Phyllanthin là một hoạt chất lignan chính của cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) với nhiều tác dụng sinh học đã được công bố. Nghiên cứu trước đây cho thấy phyllanthin có độ tan trong nước thấp, dẫn đến sinh khả dụng đường uống thấp. Với khả năng cải thiện độ tan và nâng cao sinh khả dụng đường uống, giá mang nano lipid (NLC) được nghiên cứu ứng dụng trên hoạt chất phyllanthin.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 XÂY DỰNG CƠNG THỨC VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT GIÁ MANG NANO LIPID CHỨA PHYLLANTHIN Nguyễn Đức Hạnh*, Ampol Mitrevej** TÓM TẮT Mục tiêu: Phyllanthin hoạt chất lignan Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) với nhiều tác dụng sinh học công bố Nghiên cứu trước cho thấy phyllanthin có độ tan nước thấp, dẫn đến sinh khả dụng đường uống thấp Với khả cải thiện độ tan nâng cao sinh khả dụng đường uống, giá mang nano lipid (NLC) nghiên cứu ứng dụng hoạt chất phyllanthin Đề tài thực nhằm mục tiêu xây dựng công thức đánh giá tính chất giá mang nano lipid chứa phyllanthin (Phy-NLC) Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Độ tan phyllanthin tá dược dầu (dầu Mè, dầu Đậu nành dầu Đậu phụng) xác định phương pháp bão hòa kết hợp định lượng phương pháp HPLC Tính tan phyllanthin tá dược lipid rắn ước lượng khảo sát Phy-NLC điều chế phương pháp siêu âm nóng sử dụng Compritol® 888ATO làm tá dược lipid rắn, dầu Mè làm tá dược dầu sử dụng hỗn hợp Phospholipon 90G tween 80 làm chất diện hoạt Ba công thức Phy-NLC (gồm Phy-F1, Phy-F2 Phy-F3) khảo sát khả bắt giữ phyllanthin, kích thước tiểu phân, dãy phân bố kích thước độ hòa tan mơi trường dịch dày giả định không chứa enzym (SGFwe) dịch ruột giả định khơng có enzym (SIFwe) Thử nghiệm phân tích nhiệt vi sai khảo sát cơng thức Phy-F2 Kết quả: Phyllanthin bắt giữ tiểu phân nano lipid với tỷ lệ bắt giữ cao 99,24% tồn giá mang nano lipid dạng vô định hình Kích thước giá mang nano lipid chứa phyllanthin dãy phân bố kích thước ghi nhận 257 nm 0,41 Giá mang nano lipid giúp kiểm sốt tốc độ phóng thích phyllanthin mơi trường dịch ruột giả định khơng có enzym Kết luận: Cơng thức tính chất giá mang nano lipid nghiên cứu xây dựng khảo sát Đề tài cung cấp thông tin quan trọng cho nghiên cứu in vitro in vivo giá mang nano lipid chứa phyllanthin Từ khóa: phyllanthin, giá mang nano lipid, độ hòa tan, phân tích nhiệt, khả bắt giữ ABSTRACT DEVELOPMENT AND EVALUATION OF PHYLLANTHIN LOADED NANOSTRUCTURED LIPID CARRIERS Nguyen Duc Hanh, Ampol Mitrevej * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 278 - 284 Objectives: Phyllanthin is a major bioactive lignan component of Phyllanthus amarus with several known biological activities Phyllanthin has been reported to exhibit a low oral bioavailability due to its low water solubility Nano structured lipid carriers have been reported to be able to promote the oral absorption of lipophilic drugs This study aimed at developing and evaluating phyllanthin loaded nanostructured lipid carriers (Phy-NLC) Methods: Phy-NLC was prepared by a hot ultrasonication method employed Compritol® 888ATO as a solid lipid, sesame oil as a liquid lipid and a mixture of Phospholipon 90G and tween 80 as emulsifiers The prepared Phy-NLC was evaluated for their particle size, polydispersity index, entrapment efficiency, thermal analysis and *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Khoa Dược, Đại học Mahidol Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Đức Hạnh ĐT: 0909568956 Email: duchanh@uphcm.edu.vn 278 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học dissolution release pattern in simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid without enzyme Results: Phyllanthin was found to be entrapped in nanostructured lipid carriers at a high entrapment efficiency of 99.38% and in an amorphous state The average particle size and polydispersity index of Phy-NLC were found to be at 257 nm and 0.41, respectively The controlled release of phyllanthin from Phy-NLC was studied in both simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid Conclusion: This study provided useful information for further in vitro and in vivo studies on phyllanthin loaded nanostructured lipid carriers Key words: Phyllanthin, nanostructured lipid carriers, dissolution, thermal analysis, entrapment efficiency mang cho hoạt chất phyllanthin Công thức ĐẶT VẤN ĐỀ giá mang nano lipid chứa phyllanthin Phyllanthin (Hình 1) nghiên cứu thiết lập, từ đó, số tính chất hoạt chất Diệp hạ châu đắng giá mang nano lipid chứa phyllanthin (Phyllanthus amarus) Một số hoạt tính khảo sát phyllanthin cơng bố gồm: tính chất PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU bảo vệ gan(1-3), chống oxy hóa, hạ acid uric Đối tượng nghiên cứu máu (có thể so sánh với allopurinol (5,6) benzbromaron, probenecid) , hiệp đồng với Phyllanthin (độ tinh khiết 98,73 %) ban doxorubicin số thuốc hóa trị khác NCKH – TV, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP điều trị ung thư(5)… Tuy nhiên, kết Hồ Chí Minh cung cấp Các tá dược, dung môi nghiên cứu trước cho thấy, độ tan đạt tiêu chuẩn Dược điển tiêu chuẩn sở phyllanthin dịch ống tiêu hóa thấp dẫn Màng thẩm tách MWCO (Molecular Weight đến sinh khả dụng đường uống Cut-Off) 3500 – 4000 (Cellu Sep, Mỹ) phyllanthin thấp (0,62 % chuột cống(6)) Xây dựng thẩm định phương pháp HPLC Ngày nay, hệ tiểu phân nano lipid ứng định lượng phyllanthin dụng rộng rãi việc cải thiện độ hấp thu Điều kiện HPLC định lượng phyllanthin hoạt chất, đặc biệt hoạt chất tan Máy sắc ký lỏng hiệu cao D-2000 Elite nước(4), thông qua chế bám dính Series HPLC system (Hitachi High Technologies tiểu phân nano tăng cường hấp thu hoạt chất America, Pleasanton, CA) Cột sắc ký: Hypersil qua đường hấp thu lipid Cơ thể hấp thu GOLD C18 (250mm x 4,6mm; µm; Thermo lipid đồng thời hấp thu hoạt chất bị bắt giữ Scientific) Hệ pha động: acetonitril – nước tiểu phân lipid (65:35) Tốc độ dòng 0,7 ml/phút Nhiệt độ cột: 25 oC Thể tích tiêm mẫu: 20 µl Bước sóng phát hiện: 230 nm H CH 3O OCH3 OCH3 CH 3O H OCH OCH3 Hình 1: Cơng thức hóa học phyllanthin Với khả cải thiện độ hấp thu qua đường tiêu hóa, giá mang nano lipid (Nanostructured lipid carriers, NLC), dạng hệ tiểu phân nano lipid, chọn làm giá Chuyên Đề Dược Chuẩn bị mẫu thử định lượng phyllanthin tá dược lỏng: Hòa tan hồn tồn 50 µl mẫu cần định lượng ethanol bình định mức 10 ml, thêm ethanol đến vạch, lắc lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,22 µm trước phân tích phương pháp HPLC 279 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Chuẩn bị mẫu thử định lượng phyllanthin phóng thích từ thử nghiệm độ hòa tan: Mẫu thu từ thử nghiệm khảo sát độ hòa tan lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,22 µm trước phân tích phương pháp HPLC Thẩm định phương pháp HPLC định lượng phyllanthin Phương pháp HPLC định lượng phyllanthin thẩm định tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại độ Khảo sát độ tan phyllanthin tá dược dầu Độ tan phyllanthin loại dầu: dầu Mè, dầu Đậu nành, dầu Đậu phụng xác định phương pháp bão hòa Cho tá dược dầu vào eppendorf, thêm phyllanthin, vortex, siêu âm cho tan hết Tiếp tục thêm phyllanthin hòa tan đến bão hòa Lọc qua màng lọc 0,22 µm, thu dung dịch phyllanthin bão hòa tá dược dầu Lựa chọn dầu có khả hòa tan phyllanthin cao Khảo sát độ tan phyllanthin tá dược lipid rắn Độ tan phyllanthin tá dược lipid rắn (Compritol® 888ATO, Compritol® HD5ATO GeleolTM mono and diglycerides NF) ước lượng so sánh cách làm nóng chảy tá dược thêm từ từ lượng nhỏ phyllanthin để hòa tan lượng nhỏ phyllanthin cho vào hòa tan lipid nóng chảy So sánh khả hòa tan phyllanthin lipid rắn chọn lipid rắn có khả hòa tan phyllanthin tốt Phương pháp điều chế giá mang nano lipid chứa phyllanthin Giá mang nano lipid chứa phyllanthin điều chế phương pháp siêu âm nóng Phyllanthin hòa tan pha dầu gồm Compritol® 888ATO, Phospholipon 90G 280 dầu Mè 75oC Pha nước, gồm tween 80 hòa tan nước cất nhiệt độ 80oC, cho từ từ vào pha dầu khuấy 15 phút tốc độ khuấy 1000 vòng/phút Nhũ tương hình thành đánh siêu âm với biên độ 60% phút Mẫu sau đánh siêu âm để nguội nhiệt độ phòng 24 hình thành giá mang nano lipid chứa phyllanthin Một phần giá mang nano lipid chứa phyllanthin đông khô để khảo sát tính chất hóa lý Bảng 1: Cơng thức giá mang nano lipid chứa phyllanthin (Phy-NLC) Phyllanthin (mg) ® Compritol 888ATO (g) Dầu Mè (g) Phospholipon 90G (g) Tween 80 (g) Nước cất (vừa đủ) (g) Phy-F1 10 2,5 0,50 1,00 50 Phy-F2 10 2,25 0,25 0,50 1,00 50 Phy-F3 10 2,00 0,50 0,50 1,00 50 Đánh giá tính chất giá mang nano lipid chứa phyllanthin Kích thước tiểu phân zeta Kích thước tiểu phân, dãy phân bố kích thước Zeta đo máy Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Worceshtire, UK) Mẫu Phy-NLC pha loãng 10 lần với nước cất trước đo Lấy kết trung bình lần đo Khả bắt giữ hoạt chất Khả bắt phyllanthin PhyNLC xác định phương pháp siêu ly tâm, sử dụng ống ly tâm màng lọc 100,000 MWCO (Millipore, Billerica, MA) Tốc độ ly tâm 5,000 vòng/phút 60 min, sử dụng máy ly tâm (Kubota Model 6930, Kubota Corporation, Madison, WI, USA) Khả bắt giữ phyllanthin tính tốn từ lương phyllanthin tự mơi trường phân tán hệ Phy-NLC từ phương trình sau: EE % MI MF 100% MI Trong đó: Chun Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 MI: lượng phyllanthin cho vào pha dầu MF: lượng phyllanthin tự môi trường phân tán Lượng phyllanthin tự môi trường phân tán định lượng phương pháp HPLC nêu Phân tích nhiệt Khảo sát phân tích nhiệt (thermal analysis) mẫu đơng khơ Phy-NLC thực máy phân tích nhiệt vi sai (DSC 7, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) Mẫu (3 mg) cho vào khay nhơm làm nóng tốc độ gia nhiệt 10 oC/phút nhiệt độ 125 oC mơi trường khí nitơ trơ với tốc độ dòng 50 ml/phút Độ hòa tan Phy-NLC Khả phóng thích phyllanthin từ PhyNLC khảo sát sử dụng phương pháp phóng thích qua màng thẩm tách (MWCO 35004000 Da) 250 ml mơi trường thử độ hòa tan nhiệt độ 37oC ± 0,5 oC, sử dụng thiết bị kiểu cánh khuấy với tốc độ quay 50 vòng/phút Thử nghiệm độ hòa tan thực điều kiện: pH 1,2 (SGFwe) pH 6,8 (SIFwe) Thể tích lấy mẫu ml Sau lấy mẫu thời điểm xác định, ml môi trường trả lại bình thử nghiệm Mẫu lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 µm trước định lượng phương pháp HPLC Nghiên cứu Y học (Cellu-Sep T1, Bioron GmbH, Ludwigshafen, Germany) khảo sát độ hòa tan 250 ml dịch ruột giả định khơng có enzym pH 6,8 Thời điểm lấy mẫu: 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 24 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thẩm định phương pháp HPLC định lượng phyllanthin Phương pháp HPLC định lượng phyllanthin đạt yêu cầu tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu (Hình 2), tính tuyến tính khoảng nồng độ 0,25 – 500 µg/ml với phương trình tương quan tuyến tính y=54,50x + 41,87 (R2=0,9995), đạt độ lặp lại với RSD khoảng 0,05% - 0,15%; đạt độ với độ phục hồi từ 99,99% – 101,48 % giới hạn định lượng 0,25 µg/ml (a) (b) (c) Thử nghiệm độ hòa tan dịch dày giả định khơng có enzym Mẫu đông khô Phy-NLC tương ứng với mg phyllanthin cho vào túi thẩm tách (Cellu-Sep T1, Bioron GmbH, Ludwigshafen, Germany) khảo sát độ hòa tan 250 ml dịch dày giả định khơng có enzym pH 1,2 Thời điểm lấy mẫu: 0,5, 1, 1,5 (d) Thử nghiệm độ hòa tan dịch ruột giả định khơng có enzym Hình 2: Sắc ký đồ HPLC (a) phyllanthin chuẩn, (b) dầu Mè, (c) dầu Đậu nành (d) dầu Đậu phụng Mẫu đông khô Phy-NLC tương ứng với mg phyllanthin cho vào túi thẩm tách Độ tan phyllanthin tá dược dầu Chuyên Đề Dược 281 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Độ tan phyllanthin dầu Mè, dầu Đậu nành, dầu Đậu phụng thể Hình Cơng thức % phyllanthin bắt giữ giá mang nano lipid Phy-F3 99,38 Công thức Phy-F1 không sử dụng dầu Mè nên khả bắt giữ phyllanthin thấp công thức khảo sát Cơng thức Phy-F3 có lượng dầu Mè nhiều so với công thức PhyF2 nên khả bắt phyllanthin công thức Phy-F3 cao công thức Phy-F2 Điều giải thích dầu Mè cho khả hòa tan phyllanthin cao Compritol® 888ATO Kích thước tiểu phân, dãy phân bố kích thước Zeta Hình 3: Độ tan phyllanthin tá dược dầu Dầu Mè có khả hòa tan phyllanthin cao dầu khảo sát Vì vậy, dầu Mè chọn làm tá dược dầu cho hệ Phy-NLC Khảo sát độ hòa tan phyllanthin tá dược lipid rắn Kích thước tiểu phân, dãy phân bố kích thước Zeta cơng thức khảo sát trình bày Bảng Bảng 3: Kích thước tiểu phân, dãy phân bố kích thước Zeta Phy-NLC Kích thước tiểu phân (nm) Phy-F1 263 ± 6,11 Dãy phân bố kích thước 0,44 ± 0,01 Thế Zeta (mV) -15,90 ± 0,46 -10,02 ± 0,22 -7,75 ± 0,31 Trong tá dược lipid rắn khảo sát (Compritol® 888ATO, Compritol® HD5ATO GeleolTM mono and diglycerides NF), phyllanthin tan tốt Compritol® 888ATO (khoảng mg/g) Vì Compritol® 888ATO chọn làm tá dược lipid rắn cho hệ Phy-NLC Kết cho thấy kích thước tiểu phân, dãy phân bố kích thước Zeta cơng thức khác khơng có ý nghĩa thống kê Khảo sát số phối hợp công thức giá mang nano lipid chứa phyllanthin Độ hòa tan giá mang nano lipid chứa phyllanthin Tween 80 Phospholipion 90G chọn làm chất nhũ hóa cho giá mang nano lipid chứa phyllanthin khả tương thích khả tạo nhũ tương kích thước nano với tá dược lipid chọn (dữ liệu khơng trình bày nghiên cứu này) Độ hòa tan phyllanthin từ giá mang nano lipid chứa phyllanthin môi trường SGFwe SIFwe trình bày Hình Hình Bảng 2: Khả bắt giữ phyllanthin giá mang nano lipid khảo sát Công thức % phyllanthin bắt giữ giá mang nano lipid Phy-F1 95,76 Phy-F2 282 99,24 257 ± 0,30 0,43 ± 0,01 Phy-F3 255 ± 3,00 0,41 ± 0,03 % phyllathin phóng thích Kết nghiên cứu khả bắt giữ phyllathin cơng thức Phy-NLC (Phy-F1, Phy-F2 Phy-F3) trình bày Bảng Phy-F2 Phy-F1 Phy-F2 Phy-F3 0 0.5 1.5 Thời gian (giờ) Hình 4: Độ hòa tan giá mang nano lipid chứa phyllanthin môi trường SGFwe (n=6) Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 60 % phyllanthin phóng thích 50 40 30 20 Phy-F1 10 Phy-F2 Phy-F3 0 12 Thời gian (giờ) 18 24 Hình 5: Độ hòa tan giá mang nano lipid chứa phyllanthin mơi trường SIFwe (n=6) Tốc độ phóng thích phyllathin từ SGFwe từ SIFwe khác khơng có ý nghĩa thống kê thời gian đầu Mặt khác, Hình cho thấy rõ việc phóng thích phyllanthin từ Phy-NLC SIFwe kiểm soát thời gian 24 Điều giải thích khung lipid matrix không bị phân rã môi trường SIFwe mơi trường thử nghiệm độ hòa tan SIFwe khơng có enzym lipase Như vậy, cơng thức Phy-F2 Phy-F3 khác khơng có ý nghĩa thống kê Tuy Nghiên cứu Y học nhiên, sản phẩm đông khô hai công thức phân tán lại môi trường nước cất, công thức Phy-F2 cho khả tái phân tán tốt công thức Phy-F3 Thành phần dầu Mè công thức Phy-F3 cao gấp đơi so với cơng thức Phy-F2 ngun nhân dẫn đến tượng kết dính khó phân tán lại công thức Phy-F3 Như vậy, chọn công thức Phy-F2 để tiếp tục khảo sát Phân tích nhiệt Kết phân tích nhiệt vi sai Compritol® 888ATO, giá mang nanolipid công thức Phy-F2 không tải phyllanthin, Phy-F2 phyllanthin tinh thể trình bày Hình Nhiệt độ nóng chảy phyllanthin tinh thể ghi nhận đỉnh nhọn nhiệt độ 96oC Đỉnh khơng phát kết phân tích nhiệt vi sai cơng thức Phy-F2 Vì vậy, phyllanthin tồn giá mang nano lipid công thức Phy-F2 dạng vơ định hình Endothermic (a) (b) (c) (d) Hình 6: Kết phân tích nhiệt vi sai (a) nguyên liệu Compritol® 888ATO, (b) giá mang NLC cơng thức Phy-F2 khơng có phyllanthin, (c) Phy-F2 (d) tinh thể phyllanthin tồn giá mang dạng vơ định KẾT LUẬN hình Đường kính trung bình dãy phân bố Giá mang nanolipid chứa phyllanthin kích thước giá mang nano lipid chứa nghiên cứu phát triển Kết nghiên phyllanthin xác định 257 nm cứu cho thấy phyllanthin bắt giá 0,41 Nghiên cứu cho thấy giá mang nano lipid mang nano lipid với khả bắt giữ 99,24% giúp kiểm sốt tốc độ phóng thích Chun Đề Dược 283 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 phyllanthin mơi trường dịch ruột giả định khơng có enzym TÀI LIỆU THAM KHẢO 284 Chirdchupunseree H, Pramyothin P (2010), Protective activity of phyllanthin in ethanol-treated primary culture of rat hepatocytes, Journal of Ethnopharmacology 128 172–176 Islam A, Selvan T, Mazumder UK, Gupta M, Ghosal S (2008), “Antitumour effect of Phyllanthin and Hypophyllanthin from Phyllanthus amarus against Ehrlich Ascites Carcinoma in mice”, Pharmacologyonline (2008) 796-807 Leite DFP, Kassuya CAL (2006), The cytotoxic effect and the multidrug resistance reversing action of lignans from Phyllanthus amarus, Planta Med 72, pp 1353-1358 Muchow M, Maincent P, Müller RH (2008), Lipid Nanoparticles with a Solid Matrix (SLN®, NLC®, LDC®) for Oral Drug Delivery, Drug Development and Industrial Pharmacy 34, pp 1394–1405 Murugaiyah V, Chan K, Antihyperuricemic Lignans from the Leaves of Phyllanthus niruri, Planta Med 72 (2006) 1262-1267 Murugaiyah V, Chan K(2009), Mechanisms of antihyperuricemic effect of Phyllanthus niruri and its lignan constituents, Journal of Ethnopharmacology, pp 233–239 Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 30/10/2015 20/11/2015 20/02/2016 Chuyên Đề Dược ... phyllanthin Công thức ĐẶT VẤN ĐỀ giá mang nano lipid chứa phyllanthin Phyllanthin (Hình 1) nghiên cứu thiết lập, từ đó, số tính chất hoạt chất Diệp hạ châu đắng giá mang nano lipid chứa phyllanthin. .. nano lipid chứa phyllanthin Một phần giá mang nano lipid chứa phyllanthin đơng khơ để khảo sát tính chất hóa lý Bảng 1: Cơng thức giá mang nano lipid chứa phyllanthin (Phy-NLC) Phyllanthin (mg)... cơng thức khác khơng có ý nghĩa thống kê Khảo sát số phối hợp công thức giá mang nano lipid chứa phyllanthin Độ hòa tan giá mang nano lipid chứa phyllanthin Tween 80 Phospholipion 90G chọn làm chất