tong hop NGÂN HÀNG CDNA

NGÂN HÀNG CDNA

NGÂN HÀNG CDNA 1. Thế nào là CDNA? cDNA (complementary DNA) có nghĩa là ADN bổ trợ. ADN bổ trợ chính là ADN đựơc tổng hợp từ ARN thông tin( messenger RNA hay m-RNA) duới sự xúc tác của enzim phiên mã nguợc (reverse transcriptase). Ngân hàng cADN chính là tập hợp lưu trữ các DNA bổ trợ được tổng hợp từ các RNA thông tin. 2. Khái Niệm Ngân Hàng CDNA Ngân hàng cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mDNA của một tế bào. Như vậy, ngân hàng được thiết lập từ một loại tế bào xác định (tế bào biệt hóa), vì thế, cDNA mang tính tế bào rất cao. Ngân hàng cDNA thường được lập cho eukaryote. 3. Mục Đích Thiết Lập Ngân Hàng CDNA Nghiên cứu sự biểu hiện của 1 gen xác định cùng với những vấn đề liên quan (như sự điều hòa biểu hiện gen…).Tuy nhiên việc phân tích kết quả đòi hỏi sự thận trọng (sự biểu hiện của 1 gen chịu tác động rất lớn của tình trạng sinh lý tế bào vào thời điểm thí nghiệm, một số gen được phiên mã thành mRNA nhưng không được dịch mã). 4. Các bước tổng hợp cDNA • Tổng hợp sợi thứ nhất bằng enzyme reverse transcriptase (enzim phiên mã nguợc). • Biến tính và cắt RNA trong thể lai mRNA-cDNA tuần tự bằng nhiệt và enzyme RNase H của E. coli. Thay thế khuôn mẫu là chuỗi RNA bằng chuỗi cDNA thứ nhất và tổng hợp sợi cDNA thứ hai nhờ DNA polymerase I của E. coli. • Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi nhờ nuclease S1 và sửa chữa hai đầu bằng đoạn Klenow. a) Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất ARN thông tin của sinh vật bậc cao thường có đuôi (3’ end) là một chuỗi các gốc A (poly-A). Như vậy mồi để tổng hợp sẽ là một chuỗi các gốc T ( oligo-dT). Enzim xúc tác quá trình này là enzim phiên mã ngược (reverse transcriptase). Nguyên liệu: dNTP ( bao gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Có thể tóm tắt quá trình làm như sau: Người ta tách riêng mARN nhờ các tổ hợp ologonucleotid chỉ chứa deoxythimidin (Oligo dT). Người ta gắn các Oligo dT trong phiễu chiết. Sau đó chiết xuất toàn bộ ARN của tế bào gồm rARN, tARN, mARN rồi cho hỗn hợp này chảy qua phễu có gắn xellulo-oligo (dT) Các mARN sẽ bị giữ lại trong phễu do hình thành liên kết bổ sung A-T. Sau đó ta dùng dung dịch muối NaCl để đẩy tARN và rARN ra khỏi phễu. Cuối cùng dung dịch đệm Tris EDATA cho chảy qua phễu, các mARN sẽ được giải phóng do liên kết A-T bị phân giải. Dùng mARN này làm khuôn với sự có mặt của enzyme sao chép ngược cùng với các nguyên liệu , quá trình tổng hợp DNA sẽ xảy ra, kết quả sẽ thu được cDNA. Sau khi tổng hợp xong sợi 1 của ADN bổ trợ, lúc này cDNA thứ nhất vẫn còn kết cặp với mARN bởi liên kết hydro ( hỗn hợp 2 sợi ARN và ADN này gọi là heteroduplex) ,nguời ta gây biến tính (đun sôi) thể lai mRNA-cDNA để cắt RNA bằng RNase H của E. coli tại một số điểm ngẫu nhiên nào đó, xử lý enzim Rnase-H để làm đứt sợi m-RNA trong cặp heteroduplex bao gồm m-RNA + cADN sợi 1. b) Tổng hợp sợi cADN thứ 2  Thông thường, đầu tận cùng 3’ của các cDNA sợi đơn có khả năng tạo thành các cấu trúc vòng cặp tóc (hairspin loop) và vì thế có thể được sử dụng để làm mồi (primer) cho quá trình tổng hợp sợi cDNA thứ hai bằng DNA polymerase I của E. coli hoặc reverse transcriptase .  Đoạn Klenow của DNA polymerase I thiếu hoạt tính exonuclease 5'-3' cũng được sử dụng thành công để tổng hợp sợi cDNA thứ hai. c) Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi -Sau khi tổng hợp cDNA hoàn toàn, sợi thứ nhất và thứ hai được liên kết cộng hóa trị bởi vòng cặp tóc và vòng cặp tóc dễ bị cắt bởi nuclease S1. Sau đó, đoạn cDNA được sửa chữa bằng enzyme Klenow, kết quả là hai đầu tận cùng là đầu bằng. -Sợi đôi cDNA sau đó được tách thành các tiểu phần theo kích thước và các phân tử lớn nhất được gắn vào các plasmid của vi khuẩn. Hoặc là một tập hợp đầy đủ các kích thước của cDNA sợi đôi được tạo dòng trong bacteriophage l để xây dựng thư viện cDNA (cDNA library). -Tuy nhiên, việc đưa các đầu bằng vào vector sẽ gây khó khăn trong việc lấy chúng ra khỏi vector một cách nguyên vẹn sau này. Do đó các linker thường được nối vào hai đầu của các cDNA nhờ DNA ligase. Linker là những đoạn nucleotide ngắn có chứa vị trí nhận biết của một loại RE (ví dụ: EcoRI) được tổng hợp nhân tạo tương ứng với vị trí nhận biết RE (ví dụ: EcoRI) của vector. Sau đó, các cDNA mang linker và vector sẽ được cắt bởi cùng một enzyme (ví dụ: EcoRI). Nhờ đó các cDNA và vector đều có đầu sole tương đồng (đầu dính) và cDNA sẽ dễ dàng gắn cũng như lấy ra khỏi vector một cách nguyên vẹn. 5. Những bước hình thành ngân hàng cDNA o Chọn vector (tương đối dễ do kích thước cDNA thường < 9 kb): thường là plasmid thế hệ 3 ( gồm 3 nhóm chính pUC, pGEM, pBluescript) o Tách chiết mRNA và chuyển thành cDNA (nhờ enzym phiên mã ngược). Vector tái tổ hợp = plasmid + cDNA o Đưa Vector tái tổ hợp vào TB vi khuẩn( biến nạp), nuôi cấy trong môi trường thích hợp,sau đó ủ trong CaCl 2 ( lạnh) => màng tế bảo dễ thấm đối với 1 DNA lạ o Sau khi tế bào vi khuẩn đã nhận được vector tái tổ hợ,nuôi trong môi trường lỏng trước khi trải lên mt đặc =>các dòng vi khuẩn hình thành nên những khuẩn lạc trên mặt thạch 6. Một số phương pháp tạo dòng cDNA a) Phương pháp tổng hợp cDNA bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase linked to Polymerase Chain Reaction) Dựa vào phản ứng khuếch đại phân tử (PCR) nhưng có sử dụng enzyme phiên mã ngược, với nguyên liệu ban đầu là phân tử mRNA trưởng thành. Phương pháp này được mô tả qua hình dưới: Mục đích của kỹ thuật này là tạo ra đoạn cDNA mang 2 đầu đều có chức năng làm primer và làm vùng cắt hạn chế để chèn vào genome vật chủ phục vụ cho mục đích biểu hiện. Trong ứng dụng này đuôi poly A của mRNA được dùng làm đoạn bổ sung với primer dT được thiết kế mang trình tự của vùng cắt hạn chế cho RE (restriction enzyme) cụ thể. Tương tự như thế, các primer bổ sung tiếp theo dATP, dGTP, hoặc dCTP mang vùng hạn chế cụ thể nào đó. b) Phương pháp tạo dòng bằng plasmid Sử dụng plasmid để tạo dòng cDNA có kích thước dưới 3 kb với số lượng lớn nhờ vào khả năng sinh sản của vật chủ, thường là E.coli. Khi đưa một đoạn cDNA vào plasmid , chỉ cần cắt plasmid để làm mất cấu trúc vòng đóng, sau đó gắn cDNA vào plasmid bằng enzyme ligase tạo plasmid tái tổ hợp và biến nạp vào E.coli. Nhưng thực tế là, cắt plasmid như thế sẽ tạo ra các đầu bằng (blunt ends), sau khi gắn nối và nhân dòng cDNA sẽ gặp khó khăn để tách lấy cDNA nguyên vẹn dùng cho nghiên cứu tiếp theo. Vì lí do trên, người ta tạo ra đầu bổ sung giữa plasmid bị cắt và đoạn cDNA đích, hoặc đầu sole ở 1 phía, 2 phía, ở cDNA, plasmid, hoặc cả plasmid và cDNA sẽ có nhiều thuận lợi trong quá trình tạo dòng và tách chiết cDNA. Xử lý plasmid sau khi bị cắt tại vùng hạn chế Quá trình chèn đoạn cDNA đòi hỏi phải cắt plasmid tại một vùng hạn chế, sau khi cắt các plasmid có thể tự gắn nối (self-ligation) lại theo cơ chế bổ sung ở 2 mạch. Để tạo hiệu suất cắt hạn chế cao, tránh hiện tượng tự gắn nối của plasmid, có 2 biện pháp: (1) Cắt Plasmid bằng 2 enzyme cắt hạn chế khác nhau tại vùng cắt hạn chế sẽ tạo các đầu bằng. (2) Loại bỏ phospho ở đầu 5’ mỗi sợi của plasmid sau khi cắt hạn chế, được mô tả ở hình dưới: Gắn đuôi đồng trùng hợp Gắn đuôi dA-dT hoặc dG-dC vào 2 đầu của cDNA hoặc của plasmid sẽ hình thành một đoạn đặc trưng là đuôi đồng trùng hợp. Thực tế, chủ yếu dùng đuôi trùng hợp dG-dC vì nó tạo vùng nhận biết cho một số RE, nhưng dA-dT thì không có phương thức thích hợp để cắt. Để tạo đuôi đồng trùng hợp người ta dùng enzyme teminal transferase xúc tác gắn đuôi đồng trùng hợp (homopolymer tail) vào đầu 3’ của chuỗi DNA. Tạo đuôi đồng trùng hợp, chủ yếu là dC và dG vào các đầu 3’ ở 2 chuỗi DNA của plasmid và của 2 sợi cDNA, sau đó ủ chúng với nhau để gắn đoạn cDNA vào vector plasmid mà không cần dùng enzyme gắn nối nào. Sử dụng adapter hoặc linker tạo đầu dính (cohensive end) Linker là một sợi đôi nucleotide đầu bằng (blunt end) mang một hay nhiều vùng nhận biết hạn chế, adapter là một oligonucleotide có một đầu bằng (gắn với cDNA sợi đôi) và một đầu dính (gắn với đầu tương ứng ở vector) là vùng nhận biết hạn chế của một RE cụ thể. Có thể hạn chế sự tái tạo lại vòng của plasmid vector (không tái tổ hợp) bằng cách xử lý các vector được cắt bằng enzyme phosphatase trước khi thực hiện phản ứng gắn với cDNA. Trong trường hợp các phân tử cDNA mang các adapter đã được phosphoryl hóa có thể tạo thành các phân tử mạch vòng đóng bằng liên kết cộng hóa trị (dạng không thể tạo dòng) hoặc các phân tử mạch thẳng dạng khảm (dạng không mong muốn) trong suốt phản ứng gắn tuần tự với sự có mặt của vector DNA đã được dephosphoryl hóa. Sử dụng adapter hiệu quả hơn linker vì không phải dùng RE để cắt hạn chế. Trong quá trình gắn nối linker, adapter cần thực hiện một dung tích tối thiểu để duy trì nồng độ của chúng cao, thường gấp 100 lần nồng độ đầu tận cùng của cDNA. Để tránh sự gắn nối của cDNA sau khi được gắn adapter hoặc linker, ngoài biện pháp dephosphoryl hóa nêu ở trên, có thể dùng phương pháp bổ sung tuần tự linker vào lần lượt từng đầu của cDNA sợi đôi. Linker đầu tiên được gắn vào một đầu của sợi đôi cDNA chưa bị loại bỏ vòng kẹp tóc (hairspin loop); mục đích của việc giữ vòng kẹp tóc lại là để linker chỉ gắn vào một đầu của cDNA (đầu bằng). Tạo dòng bằng primer-adapter c) Tạo dòng cDNA với vector bacteriophage lambda Vector lambda mang vùng đệm (suffer) hay còn gọi là vùng trung tâm có chiều dài bằng 1/3 chiều dài của toàn bộ DNA, vùng này không quan trọng nên nếu cắt bỏ sẽ không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của phage lambda. Vì thế người ta loại bỏ vùng này và thay bằng đoạn cDNA nói riêng, đoạn DNA nói chung vào vị trí đó. DNA của phage lambda mang một số vùng cắt hạn chế, các thế hệ lambda cải tiến mang nhiều vùng nhận biết hạn chế hơn. Trong tạo dòng cDNA, thường dùng:  bacteriophage lambda gt10  bacteriophage lambda gt11  bacteriophage lambda gtZAP I,II là thế hệ bacteriophage lambda mới Vector lambda gt10  Lambda gt 10 là vector được thiết kế để nhận đoạn DNA ngoại lai trong vùng mã hóa gen ức chế cI2. Các vector này mang gen cI, giống như bacteriophage lambda, sản sinh ra các bacteriophage tái tổ hợp và tạo thành các plaque màu sáng, dễ phân biệt với các plaque mờ đục của lgt bố mẹ.  DNA của lgt 10 có kích thước khoảng 43 kb và có thể nhận được các đoạn DNA ngoại lai có kích thước lên tới 7,6 kb.  Các thư viện cDNA được xây dựng trong lgt10 luôn chứa hỗn hợp: bacteriophage tái tổ hợp và không tái tổ hợp.  Hai loại bacteriophage này có thể phân biệt kiểu hình nhờ vào khả năng tạo các plaque. Hình dưới mô tả việc chèn cDNA vào DNA của lgt 10 và phân biệt các chủng sau khi tái tổ hợp. Vector lgt 11 . transcriptase). Ngân hàng cADN chính là tập hợp lưu trữ các DNA bổ trợ được tổng hợp từ các RNA thông tin. 2. Khái Niệm Ngân Hàng CDNA Ngân hàng cDNA là tập. thế, cDNA mang tính tế bào rất cao. Ngân hàng cDNA thường được lập cho eukaryote. 3. Mục Đích Thiết Lập Ngân Hàng CDNA Nghiên cứu sự biểu hiện của 1 gen