Trong công trình này, chúng tôi đã nghiên cứu xác định một số thông số công nghệ thích hợp để thủy phân và lên men phế liệu tôm (PLT) trong quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenprotein từ PLT bằng chủng B. subtilis C10 và L. fermentum TC10. Kết quả của công trình làm tiền đề cho nghiên cứu xử lý PLT kết hợp hai chế phẩm vi sinh nhằm tạo ra chế phẩm probitic giàu caroten-protein. Các thông số công nghệ thích hợp để xử lý PLT trong quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenprotein từ PLT là tỷ lệ phối trộn của chủng B. Subtilis C10 và L. fermentum TC10 vào PLT là (1:2). Nhiệt độ và thời gian lên men của hỗn hợp PLT tương ứng là 35 °C và 24 giờ.
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa họ c Tự nhiên; ISSN 1859–1388 Tập 127, Số 1C, 2018, Tr 107–118; DOI: 10.26459/hueuni-jns.v127i1C.4907 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ THÔNG SỐ CƠNG NGHỆ LÊN Q TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTEN-PROTEIN TỪ PHẾ LIỆU TÔM SỬ DỤNG HỖN HỢP Bacillus subtilis C10 Lactobacillus fermentum TC10 Đỗ Thị Bích Thủy*, Lê Thị Thanh Khoa Cơ khí – Cơng nghệ, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế, 102 Phùng Hưng, Huế, Việt Nam Tóm tắt Trong cơng trình này, nghiên cứu xác định số thông số cơng nghệ thích hợp để thủy phân lên men phế liệu tơm (PLT) quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenprotein từ PLT chủng B subtilis C10 L fermentum TC10 Kết công trình làm tiền đề cho nghiên cứu xử lý PLT kết hợp hai chế phẩm vi sinh nhằm tạo chế phẩm probitic giàu caroten-protein Các thông số công nghệ thích hợp để xử lý PLT quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenprotein từ PLT tỷ lệ phối trộn chủng B Subtilis C10 L fermentum TC10 vào PLT (1:2) Nhiệt độ thời gian lên men hỗn hợp PLT tương ứng 35 °C 24 Từ khóa: B subtilis, L fermentum, lên men, phế liệu tôm, probiotic Đặt vấn đề Việt Nam nước nơng nghiệp có ngành chăn ni phát triển có đóng góp lớn vào phát triển kinh tế đất nước Vì vậy, vấn đề nâng cao suất, chất lượng sản phẩm cải thiện môi trường chăn nuôi quan tâm Việt Nam Việc lạm dụng kháng sinh người chăn nuôi trở thành vấn đề nan giải Hệ lượng tồn dư kháng sinh có thực phẩm khơng ảnh hưởng đến vật ni mà nguy hại đến sức khỏe người tiêu thụ thực phẩm Để hạn chế tiến tới loại bỏ kháng sinh thức ăn chăn nuôi, sử dụng probiotic giải pháp thay kháng sinh quan trọng Probiotic vi khuẩn có ích nấm men đưa vào thể liều lượng vừa đủ sản sinh enzym tiêu hóa, vitamin chất có hoạt tính kháng khuẩn, tạo tác động tích cực q trình tiêu hóa, giúp hấp thu dưỡng chất tốt [13] Các loài Bacillus Lactobacillus xem đối tượng giàu tiềm để sản xuất probiotic Do Bacillus khơng có khả sinh bào tử để chống chịu với điều kiện mơi trường bất lợi [18, 24], mà sinh chất kháng sinh, chất kháng khuẩn kìm hãm *Liên hệ: dothibichthuy@huaf.edu.vn Nhận bài: 02–8–2018; Hoàn thành phản biện: 19–8–2018; Ngày nhận đăng: 27–8–2018 Đỗ Thị Bích Thủy Lê Thị Thanh Tập 127, Số 1C, 2018 vi sinh vật (VSV) gây bệnh [24] B subtilis sinh nhiều loại enzyme, đặc biệt amylase protease kiềm có giá trị cao; ngồi B subtilis có khả sinh riboflavin (tiền vitamin B2) [1] Lactobacillus biết đến nhóm vi khuẩn có chức probiotic có nhiều tác động có lợi cho sức khỏe người động vật Khả sinh tổng hợp bacterioxin vi khuẩn lactic làm cho chúng ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột [8] L fermentum vi khuẩn có khả chống chịu dịch dày, dịch ruột non, kháng vi sinh vật gây bệnh, tăng cường hệ miễn dịch, tăng khả kháng oxy hóa [14-16] Trong cơng nghệ chế biến thuỷ sản xuất Việt Nam, công nghệ chế biến tôm tạo lượng lớn phế thải rắn bao gồm đầu tôm vỏ tôm, thường chiếm 50–70% nguyên liệu ban đầu Phế liệu tôm (PLT) nguồn cung cấp protein, chitin carotenoids [17] Trong đó, carotenoid biết chất màu tự nhiên an toàn cho ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm Gần đây, nhiều phương pháp sử dụng để tách chiết thu nhận chế phẩm đạm giàu carotenoid Chúng có thành phần protein carotenoid dạng phức hợp caroten-protein có nhiều phế liệu giáp xác (tôm hùm, tôm sú, tôm chì, tơm thẻ chân trắng) số phế liệu hải sản khác Việc tách chiết chúng không thu nhận sản phẩm có giá trị gia tăng mà giảm thiểu nhiễm mơi trường [4,12] Vì vậy, nghiên cứu thủy phân lên men PLT phương pháp vi sinh vừa thu hồi hàm lượng caroten-protein vừa tách lượng chitin đáng kể [5] Trong nghiên cứu này, xác định số thông số cơng nghệ thích hợp để thủy phân PLT B subtilis C10 lên men phế liệu L fermentum TC10 Giá trị dinh dưỡng của sản phẩm sau xử lý đánh giá thông qua mật độ tế bào sống, khả kháng oxy hóa, hoạt độ enzyme ngoại bào protease hàm lượng amino acid tự thông qua hàm lượng nitơ formol Kết cơng trình làm tiền đề cho nghiên cứu kết hợp hai chế phẩm nhằm nâng cao giá trị sử dụng PLT Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu Phế liệu tôm cung cấp Công ty Cổ Phần Chăn Nuôi C.P Việt Nam – Chi Nhánh Đông Lạnh Thừa Thiên Huế Yêu cầu phế liệu phải tươi, khơng có mùi lạ, khơng bị biến đỏ, không lẫn tạp chất Phế liệu sau lấy cho vào thùng xốp cách nhiệt chứa nước đá vận chuyển phòng thí nghiệm Phế liệu trước sử dụng rửa sạch, để thời gian phút Trong trường hợp chưa làm rửa sạch, đóng gói bảo quản đơng –20 °C Chủng B subtilis C10 L fermentum TC10 cung cấp Phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Cơ khí – Cơng nghệ, Trường đại học Nơng Lâm Huế, Đại học Huế 108 jos.hueuni.edu.vn 2.2 Tập 127, Số 1C, 2018 Phương pháp Phân tích vi sinh vật hóa sinh (1) Xác định số tế bào sống sản phẩm phương pháp đếm khuẩn lạc đĩa thạch: * Xác định số lượng tế bào sống vi khuẩn lactic: Mẫu thí nghiệm chứa tế bào VSV đồng hóa pha lỗng thập phân mL dịch pha lỗng thích hợp cho vào đĩa petri vô trùng trộn với môi trường MRS agar 43 °C Sau lớp môi trường thứ đông, lớp môi trường MRS agar thứ hai đổ lên kín bề mặt Số lượng tế bào sống xác định cách đếm số khuẩn lạc phát triển đĩa có số lượng nằm khoảng 50 –250 sau ủ 37 °C 48 Tổng số vi khuẩn lactic mL mẫu thử tính theo cơng thức (Phương pháp Koch): 𝑁 = log ∑𝐶 (𝑛 𝑉 · + 0,1 · 𝑛2 ) · 𝑑 N tổng số vi khuẩn sống có mL mẫu thử (CFU/ mL); ∑C tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa chọn; V thể tích cấy đĩa (mL); n số đĩa đậm độ pha loãng thứ giữ lại; n2 số đĩa đậm độ pha loãng thứ hai giữ lại; d hệ số pha loãng đậm độ pha loãng thứ * Xác định số lượng tế bào sống vi khuẩn B subtilis: Mẫu thí nghiệm chứa tế bào VSV đồng hóa pha lỗng thập phân 0,1 mL độ pha lỗng thích hợp dàn đĩa thạch chứa môi trường thạch thịtpetone Số tế bào sống xác định vi khuẩn lactic (2) Xác định hoạt độ protease phương pháp Ason cải tiến Hỗn hợp phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzyme dung dịch casein 2,0%, tỷ lệ 1:2 ủ 30 °C, 10 phút; phản ứng kết thúc cách cho dung dịch axit tricloacetic (TCA) 5,0% theo tỷ lệ thể tích dung dịch axit cho thể tích enzyme vào hỗn hợp phản ứng; dịch thu sau ly tâm sử dụng để thực phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N có mặt Na CO3 6% (tỷ lệ dịch nổi: dung dịch Na CO 3: Folin 0,2 N = 1:4:1) Mẫu đối chứng thực đồng thời cách cho dung dịch tricloacetic acid (TCA) vào enzyme trước ủ với chất Độ hấp thụ ánh sáng (OD) dung dịch màu thu sau phản ứng đo máy quang phổ kế bước sóng 750 nm Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để tính sản phẩm tạo thành tương ứng tác dụng enzyme Một đơn vị hoạt độ protease (HP) định nghĩa lượng enzyme mà phút 300 °C có khả phân giải protein tạo thành sản phẩm hoà tan (TCA), cho phản ứng màu tương đương với 1,0 µmol tyrosine [21] 109 Đỗ Thị Bích Thủy Lê Thị Thanh Tập 127, Số 1C, 2018 (3) Xác định hàm lượng protein tổng số phương pháp Kjeldahl Protein mẫu sau vơ hóa H SO4 đậm đặc với chất xúc tác hỗn hợp K2 SO4: CuSO (10:1) tạo thành NH NH tiếp tục tác dụng với H 2SO tạo thành (NH4 )2SO Dùng kiềm mạnh NaOH đẩy NH từ (NH 4) 2SO NH hấp thụ H3 PO tạo thành (NH 4)2 B4 O (amoni tetraborat) Định lượng muối amoni tetraborat tạo thành dung dịch H 2SO 0,1N xuất màu hồng nhạt với chất thị tasiro [10] (4) Xác định hàm lượng nitơ formol phương pháp chuẩn độ Amino acid hòa tan nước có tính chất muối nội phân tử, nhóm amino carboxyl trung hòa lẫn Nhóm –COO amino acid bị cản trở nhóm amino nên khơng thể chuẩn độ trực tiếp Trong fomandehyd, nhóm amino amino acid phản ứng với nhóm andehyd cho metylen; kết phản ứng nhóm amino tính chất nó; ngược lại, nhóm cacboxyl amino acid tồn dạng tự chuẩn độ Điều cho phép định lượng amino acid có dung dịch nghiên cứu [3] (5) Xác định hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp DPPH Về nguyên tắc, chất kháng oxy hóa trung hòa gốc DPPH cách cho hydro làm giảm độ hấp thụ bước sóng cực đại màu dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt Giá trị mật độ quang OD thấp chứng tỏ khả bắt gốc tự DPPH cao Quy trình thực hiện: Lấy khoảng 20µL đến 40 µL dịch chiết trộn với nước cất để đạt thể tích 30 mL Sau thêm vào mL dung dịch DPPH 0,2 nM, lắc để yên bóng tối 30 phút Đo độ hấp thụ quang học bước sóng 517 nm [11] Bố trí thí nghiệm để nghiên cứu nội dung đề tài Thí nghiệm (TN1): Chuẩn bị mơi trường: cân 100g PLT (đã xay nhỏ tới kích thước 0,3–0,5 cm) 5,2 g bột sắn khô [6] Môi trường hấp tiệt trùng nhiệt độ 121 °C 20 phút để nguội trước bổ sung 6% sinh khối B subtilis C10 : L fermentum TC10 theo tỷ lệ (1:1, 1:2, 2:1) với mật độ sinh khối ban đầu 10 CFU/mL Tiến hành lên men hỗn hợp PLT tủ ấm nhiệt độ 35 °C 48 Sau 48 lên men, hỗn hợp PLT lọc thu phần dịch lỏng caroten-protein loại bỏ bã phần chitin Phần dịch lỏng caroten-protein dùng để xác định tiêu (mật độ tế bào sống, khả kháng oxy hóa, hoạt độ protease, hàm lượng protein nitơ formol) Sau xác định tiêu có chất lượng tốt chọn tỷ lệ thích hợp để nghiên cứu nội dung 110 jos.hueuni.edu.vn Tập 127, Số 1C, 2018 Thí nghiệm (TN2): Sau xác định tỷ lệ VSV thích hợp để bổ sung vào PLT, tiến hành khảo sát nhiệt độ lên men PLT Chuẩn bị môi trường trên; sau hấp để nguội, VSV bổ sung theo tỷ lệ thích hợp khảo sát TN1 Tiến hành lên men PLT với mức nhiệt độ (30 °C, 35 °C, 40 °C) 48 Sau thời gian lên men, hỗn hợp PLT lọc thu phần dịch lỏng caroten-protein tiến hành phân tích tiêu mật độ tế bào sống, khả kháng oxy hóa, hoạt độ protease, hàm lượng protein nitơ formol để xác định nhiệt độ thích hợp lên men PLT Thí nghiệm (TN3): Sau xác định nhiệt độ thích hợp để lên men PLT, tiến hành khảo sát thời gian lên men PLT Chuẩn bị môi trường trên; sau hấp để nguội, VSV bổ sung theo tỷ lệ thích hợp khảo sát TN1 lên men nhiệt độ thích hợp khảo sát TN2 với mức thời gian (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ) Sau thời gian lên men, hỗn hợp PLT lọc thu phần dịch lỏng caroten-protein Phần dịch lỏng caroten-protein dùng để xác định tiêu (mật độ tế bào sống, khả kháng oxy hóa, hoạt độ protease, hàm lượng protein nitơ formol) Sau xác định tiêu chọn thời gian lên men thích hợp để dịch caroten-protein có chất lượng tốt Xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm xử lý (ANOVA) phần mềm Minitab 17 Kết thảo luận 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn B subtilis C10 L fermentumTC10 vào PLT đến chất lượng chế phẩm probiotic giàu caroten-protein Lợi dụng hệ enzyme ngoại bào đa dạng vi khuẩn B subtilis TC10 để thủy phân PLT giúp chuyển hóa chất khó tiêu (protein) thành chất dễ tiêu (axit amin) Bên cạnh đó, B subtilis L fermentum mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ chúng có khả chống lại vi khuẩn gây bệnh [20], đồng thời, chủng làm tăng khả miễn dịch, khả kháng khuẩn giúp vật nuôi tăng trưởng nhanh [25] Ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn B subtilis C10 L fermentum TC10 vào PLT đến hoạt độ enzyme protease, khả kháng oxy hóa, hàm lượng protein nitơ formol Môi trường ảnh hưởng lớn đến khả sinh protease vi khuẩn, dịch thủy phân PLT chứa nhiều đạm (0,9%) [9], sử dụng PLT làm môi trường để vi khuẩn lên men PLT lên men hai chủng B.subtilis C10 L.fermentum TC10 với tỷ lệ phối trộn (1:1), (1:2), (2:1) Sau lên men 35 °C 48 giờ, hỗn hợp xác định tiêu hỗn hợp PLT (Bảng 1) 111 Đỗ Thị Bích Thủy Lê Thị Thanh Tập 127, Số 1C, 2018 Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn B subtilis C10 L fermentum TC10 vào PLT đến hoạt độ enzyme protease, kháng oxy hóa, hàm lượng protein nitơ formol Tỷ lệ phối trộn B subtilisC10 L fermentumTC10 Chỉ tiêu Hoạt độ protease (UI/mL PLT) ĐC (1:1) 5,6 40,118 c (1:2) b (2:1) a 46,814 37,807b Khả kháng oxy hóa (%) 11,835b 26,908ab 40,579a 23,864ab HL protein khử (%) d 7,631 55,052 72,421 62,000b HL nitơ formol (g/L) 0,821c 1,080b 1,311a 1,101b c a Số liệu có chữ a, b, c biểu thị khác có ý nghĩa giá trị trung bình theo hàng với p < 0,05 Khi cấy hai chủng B subtilis C10 L fermentum TC10 với tỷ lệ 1:2, hoạt độ protease khả kháng oxy hóa đạt sau lên men 35 °C 24 có giá trị cao (46,814 UI/mL PLT 40,579 %) so với tỷ lệ 1:1 (40,118 UI/mL PLT 26,908 %) tỷ lệ 2:1 (37,807 UI/mL PLT 23,864 %) mẫu đối chứng (ĐC) có giá trị thấp (5,6 UI/mL PLT 11,835 %) (Bảng 1) Theo kết cơng bố, hàm lượng protein có PLT đạt giá trị cao chiếm khoảng 54,4% [17, 26] Vì vậy, tiến hành nghiên cứu tỷ lệ bổ sung VSV, hàm lượng protein nitơ formol thu đạt giá trị cao Cụ thể, tỷ lệ 1:2, hàm lượng protein nitơ formol đạt giá trị cao chiếm 72,421 % 1,311 g/L; tỷ lệ 1:1 chiếm 55,052% 1,080 g/L; tỷ lệ 2:1 chiếm 62% 1,101 g/L mẫu ĐC có giá trị thấp (7,631% 0,821 g/L) (Bảng 1) Có thể bổ sung lượng VSV thích hợp vào mơi trường PLT sản sinh enzyme ngoại bào, đặc biệt enzyme protease để thủy phân protein PLT tạo thành peptid mạch ngắn; acid amin hòa tan vào dịch lên men Còn acid lactic phản ứng với CaCO tạo thành lactatcanxi dạng khơng hòa tan [22, 23] Ngồi ra, acid lactic sinh có tác dụng làm mềm protein, hoạt hố protein thúc đẩy q trình thuỷ phân, tạo điều kiện cho số protease hoạt động [2, 19] Ngược lại, mẫu ĐC có giá trị thấp mơi trường PLT khơng có VSV để sinh enzyme ngoại bào protease thủy phân protein, hàm lượng protein phần dịch lỏng đạt giá trị thấp Ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn B subtilis C10 L Fermentum TC10 vào PLT đến mật độ tế bào sống chế phẩm probiotic Sau lên men PLT 48 35 °C, mật độ tế bào sống hỗn hợp thu được xác định phương pháp đếm khuẩn lạc (phương pháp Koch) Kết cho thấy hai chủng B subtilis C10 L fermentum TC10 phát triển tốt môi trường PLT phù hợp với kết công bố Đỗ Thị Bích Thủy (2008) [7] Mật độ tế bào sống tỷ lệ 1:2 đạt giá trị cao (9,680 lg CFU/mL) (Hình 1) 112 jos.hueuni.edu.vn Tập 127, Số 1C, 2018 Hình Ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn B subtilis C10 L fermentum TC10 vào PLT đến mật độ tế bào sống chế phẩm Số liệu có chữ a, b, c biểu thị khác có ý nghĩa giá trị trung bình với p