Bài báo này trình bày các kết quả đạt được trong nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý thiếu nước lên sự biến động của gen MtDHDPS1 mã hóa dihydrodipicolinate synthase (MtDHDPS, EC 4.2.1.52) trong lá cây M. truncatula. Enzyme MtDHDPS đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình điều hòa sinh tổng hợp lysine trong nhóm cây họ đậu nói chung và cây M. truncatula nói riêng. Các cây 3 tuần tuổi bị xử lý thiếu nước từ 5 ngày hoặc 10 ngày, sau đó tiến hành thu lấy mẫu để nghiên cứu.
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Vol 128, No 1E, 27–37, 2019 pISSN 1859–1388 eISSN 2615–9678 ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC XỬ LÝ THIẾU NƯỚC LÊN SỰ BIẾN ĐỘNG CỦA GEN MtDHDPS1 MÃ HÓA DIHYDRODIPICOLINATE SYNTHASE TRONG CÂY MEDICAGO TRUNCATULA Effects of water stress treatment on fluctuations of MtDHDPS1 gene encoding of dihydrodipicolinate synthase in Medicago truncatula Hoàng Thị Kim Hồng1*, Nguyễn Thị Ngọc Hạnh2, Đinh Tiến Hồng1, Đặng Thanh Long4, Ngơ Thị Minh Thu5 Nguyễn Việt Hà3, Phạm Thị HồngTrang1 Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, 77 Nguyễn Huệ, Huế, Việt Nam Trường Đại học Quốc tế Hồng Bàng, 215 Điện Biên Phủ, Phường 15, Bình Thạnh, Hồ Chí Minh Cơng Ty Scavi Huế, ĐT9, TT Phong Điền, Phong Điền, Thừa Thiên Huế, Việt Nam Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế, Tỉnh Lộ 10, Phú Vang, Thừ Thiên Huế, Việt Nam 5Trường Đại học Duy Tân, 254 Nguyễn Văn Linh, Thanh Khê, Đà Nẵng, Việt Nam * Tác giả liên hệ Hoàng Thị Kim Hồng (Thư điện tử: htkhong@hueuni.edu.vn) (Ngày nhận bài: 8-9-2019; Ngày chấp nhận đăng: 21-10-2019) Tóm tắt Bài báo trình bày kết đạt nghiên cứu ảnh hưởng việc xử lý thiếu nước lên biến động gen MtDHDPS1 mã hóa dihydrodipicolinate synthase (MtDHDPS, EC 4.2.1.52) M truncatula Enzyme MtDHDPS đóng vai trị quan trọng q trình điều hịa sinh tổng hợp lysine nhóm họ đậu nói chung M truncatula nói riêng Các tuần tuổi bị xử lý thiếu nước từ ngày 10 ngày, sau tiến hành thu lấy mẫu để nghiên cứu Kết phân tích định lượng mRNA kỹ thuật RT-PCR cho thấy việc xử lý stress thiếu nước làm thay đổi mức độ biểu gen này, giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) gen MtDHDPS1 hai loại mẫu xử lý hạn ngày 10 ngày thấp so với mẫu đối chứng không xử lý thiếu nước tương ứng, đồng thời mức độ biểu gen MtDHDPS1 xử lý hạn ngày cao so với xử lý hạn 10 ngày 25,53 = 46,2 lần Từ khóa: Dihydrodipicolinate synthase (MtDHDPS), gen MtDHDPS1, Medicago truncatula, xử lý stress thiếu Abstract This paper presents the results of the effect of water stress treatment on the fluctuation of the MtDHDPS1 gene encoding dihydrodipicolinate synthase (MtDHDPS, EC 4.2.1.52) in leaves of M truncatula Enzyme MtDHDPS plays an important role in the regulation of lysine biosynthesis in the Legume group, in general, and M truncatula, in particular The 3-week-old plants were treated with water stress in shortage for days and 10 days, then the samples were corrected for research The results of quantitative mRNA analysis by RT-PCR technique show that the water stress treatment has changed the expression level of this gene, in which the threshold cycle value (Ct) of MtDHDPS1 gene in both 5day and 10-day drought-treated samples is lower than the corresponding untreated control water DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1E.5434 27 Hoàng Thị Kim Hồng CS samples, and the level of MtDHDPS1 gene expression in 5-day drought-treated plants is 25.53 = 46.2 times as high as that in the 10-day drought-treated plants Keywords: Dihydrodipicolinate synthase (MtDHDPS), gene MtDHDPS1, Medicago truncatula, water stress treatment Mở đầu Cây Medicago truncatula đối tượng thực vật mơ hình nhóm họ đậu chúng sử dụng rộng rãi lĩnh vực nghiên cứu khác giới, đặc biệt nghiên cứu sinh tổng hợp amino acid đường chuyển hóa aspartate để tạo thành lysine [1, 2] Các kết nghiên cứu trước cho thấy lysine amino acid thiết yếu quan trọng nhất, cần có phần ăn người động vật, nhiên thân nguời động vật không tự tổng hợp lysine mà phải lấy từ nguồn thức ăn bên thực vật cung cấp, đặc biệt nguồn lysine từ hạt ngủ cốc [3] Trong thực tế, q trình chuyển hóa lysine thực vật C3 C4 nghiên cứu nhiều với mục đích nhằm cải thiện chất lượng dinh dưỡng để cung cấp nguồn lysine cần thi ết cho đời sống người Ở thực vật C3 C4, trình tổng hợp lysine điều hòa chủ yếu chế ức chế ngược lysine enzyme DHDPH Nhiều loài thực vật có khả tổng hợp lysine, lượng lysine tổng hợp tích lũy nhiều thể gây độc ảnh hưởng đến sống thực vật [4] Khả ức chế ngược lysine hoạt động DHDPS chế quan trọng giúp thực vật điều hòa cân lượng lysine thể Theo tài liệu cơng bố DHDPS tách từ nhiều nguồn thực vật khác ngơ, lúa mì, rau dền, đậu thuốc [ 58] Ở loài thực vật này, DHDPS thường mã hóa họ đa gen (multigene family) Các nghiên cứu ngô cho thấy xuất vài gen đồng dạng (isogene) DHDPS, tương tự thế, nhà khoa học tìm thấy hai gen khác họ DHDPS xuất lúa mì A thaliana [2, 9] Hai gen đồng dạng DHDPS1 DHDPS2 xác định đặc tính Arabidopsis thaliana, dịng A thaliana đột biến bị knock-out DHDPS2 thường biểu khả tăng cường tính chống chịu cho [2] Nghiên cứu Ellen cộng cho thấy M truncatula hai gen đồng dạng DHDPS1 DHDPS2 (MtDHDPS1 MtDHDPS2), cịn có thêm hai gen đồng dạng khác MtDHDPS3 MtDHDPS4 tồn số phận rễ [2] Các chứng thực nghiệm nghiên cứu họ cho thấy hầu hết hoạt động bốn gen đồng dạng điều bị ức chế ngược lysine mức độ nhạy cảm gen lysine khác Mặc dù vai trò cụ thể gen đồng dạng M truncatula nói riêng thực vật nói chung cịn bí ẩn khám phá, nhiên nhiều giả thuyết cho xuất đồng phối hợp gen đồng dạng đóng vai trị quan trọng việc điều hòa sinh tổng hợp lysine nhằm giúp cho thực vật tăng cường khả đáp ứng thích nghi tốt với điều kiện bất lợi môi trường [10, 11] Trong báo này, chúng tơi trình bày kết nghiên cứu ảnh hưởng việc xử lý thiếu nước lên biến động gen MtDHDPS1 mã hóa dihydrodipicolinate synthase (Mt DHDPS1) đồng thời xác định hoạt độ enzyme MtDHDPS1 mẫu M truncatula 28 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Vol 128, No 1E, 27–37, 2019 pISSN 1859–1388 eISSN 2615–9678 Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu sử dụng nghiên cứu hạt giống M truncatula dòng 2HA cung cấp từ phịng thí nghiệm Di truyền thực vật, khoa Cơng nghệ sinh học, Đại học Vrije, Bỉ Hạt khử trùng, ni cấy tạo hồn chỉnh theo phương pháp công bố Hồng cộng [12] Chọn chậu nhựa có lỗ nước, cho đất vào chậu, phun nước giữ cho đất ẩm qua đêm Chuyển mầm có hai lên chậu đất, trồng chăm sóc điều kiện phịng thí nghiệm khoảng tuần, sau chuyển vườn ươm Trong tuần đầu tiên, chuyển trồng môi trường đất, cần dùng nắp nhựa đậy bên chậu để bảo vệ chống thoát nước Cây sinh trưởng, phát triển tốt tiếp tục trải qua giai đoạn trưởng thành (Hình 1A), hoa, tạo hạt (Hình 1B) thu hoạch hạt (Hình 1C) Các M truncatula khỏe mạnh chọn lọc phân vào lô khác lơ lơ làm lô đối chứng sau ngày 10 ngày không xử lý thiếu nước, chăm sóc tưới nước bình thường, lơ lơ chứa thí nghiệm trồng chăm sóc lô đối chứng nhiên xử lý stress thiếu nước cách không tưới nước thu mẫu sau ngày 10 ngày xử lý Mẫu tách từ M truncatula trưởng thành lơ thí nghiệm thu thời điểm (9 sáng) cố định mẫu nitrogen để tách chiết xác định hoạt độ enzyme MtDHDPS, đánh giá biểu gen MtDHDPS1 lô thí nghiệm lơ đối chứng kỹ thuật qRT-PCR 13 Hình Hình thái M truncatula qua giai đoạn sinh trưởng khác A: Cây giai đoạn trưởng thành; B: Cây giai đoạn hoa, tạo hạt C: Cây giai đoạn thu hoạch hạt DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1E.5434 29 Hoàng Thị Kim Hồng CS Tách chiết RNA từ xác định hàm lượng, chất lượng RNA RNA tổng số mẫu M truncatula tách chiết TRI-reagent (của hãng Sigma) sử dụng Kít SV Total RNA Isolation Systerm, Z3100 (Promega) để tinh RNA Mẫu nghiền mịn với Nitơ lỏng, sau lấy 500 mg mẫu đồng ml TRI-reagent, lắc mạnh phút, sau để n nhiệt độ phịng phút Tiếp tục bổ sung 200 µl Chloroform, trộn đều, giữ nhiệt độ phòng 15 phút, sau ly tâm 15.000 vịng/phút 15 phút 4°C, sau ly tâm, loại bỏ phần cặn thu lấydịch bên bổ sung thêm 200 µl ethanol 95%, dùng pipette trộn 3-4 lần chuyển toàn dung dịch vào cột lọc ly tâm 14.000 vòng/phút phút, loại bỏ phần dịch cột lọc, tiếp tục bổ sung 600 µl đệm rủa RNA (RNA Wash Solution) vào phía cột lọc, tiếp tục ly tâm 14.000 vòng/phút phút, loại bỏ dung dịch phía cột lọc Tiếp tục bổ sung 50 µl hỗn hợp gồm (40 µl Yellow Core Buffer + µl 0,09M MnCl2 + µl Dnase I enzyme) chuẩn bị trước vào phía màng ủ 15 phút 20-25°C Tiếp tục bổ sung 200 µl dung dịch ngừng phản ứng enzyme (Dnase Stop Solution)rồi ly tâm 14.000 vòng/phút phút, sau ly tâm loại bỏ dung dịch phía cột lọc, tiếp tục bổ sung 600 µl đệm rửa RNA (RNA Wash Solution) vào cột lọc tiếp tục ly tâm 14.000 vòng/phút phút, sau ly tâm loại bỏ dung dịch phía cột lọc Tiếp tục bổ sung 250 µl đệm rửa RNA (RNA Wash Solution) vào phía cột lọc ly tâm 14.000 vòng/phút phút (làm khơ cột) Chuyển cột lọc phía sang ống tube (1,5 ml), bổ sung 100 µl Water-DEPC vào màng lọc ly tâm 14.000 vòng/phút phút, loại bỏ cột lọc thu lấy toàn RNA phía ống tube Đánh dấu bảo quản RNA -70°C để thực cho thí nghiệm Lượng RNA độ tinh RNA có mẫu nghiên cứu xác định cách đo mẫu RNA bước sóng A230, A260 A280 máy Nanodrop, ra, chất lượng RNA tách chiết kiểm tra gel agarose 1,5% nhuộm màu với thuốc nhuộm Midori green Xác định biểu gen DHDPS kỹ thuật qRT-PCR Tổng hợp sợi cDNA từ khuôn mẫu RNA theo kit hãng Fermentas (RevertAid H minus first strand cDNA synthesis kit, Thermo Scientific) ống PCR chứa 250 ng oligo dT primer, 0,5 mg RNA, bổ sung nước không chứa nuclease (nuclease free water) để đạt thể tích ống 12 µl, ly tâm nhanh để trộn hỗn hợp mẫu, ủ 70 oC phút Mẫu làm lạnh đá tiếp tục thêm µl dung dịch đệm phản ứng, µl chất ức chế Riboblock Ribonuclease (20 U/µl), µl hỗn hợp dNTP (10 mM), µl RevertAid H Minus M-MuLV RT (200 U/µl) ủ mẫu 42°C 60 phút để tổng hợp cDNA, sau ủ mẫu 70oC 10 phút để ngưng phản ứng Phản ứng qRT-PCR tiến hành máy CFX96 Touch real-time PCR, sử dụng microplate (96 giếng), giếng chứa 10 µl hỗn hơp đệm Promega (Promega mix), µl cDNA µl hỗn hợp mồi MtDHDPS1 gồm µl mồi xi µl mồi ngược (10 pmol cho mồi) có trình tự sau: Mồi xuôi: 5’TGTGTGGAGTGGGAACGATGATC3’ Mồi ngược: 5’ GAGCAAGAGCCGTGTTCAAACC3’ Tách chiết xác định hoạt độ enzyme DHDPS MtDHDPS1 chiết từ M truncatula trưởng thành lô nghiên cứu Các mẫu nghiền với đệm chiết (100 mM đệm potassium phosphate, pH 8,0, mM Na 2EDTA, 20% glycerol 30 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Vol 128, No 1E, 27–37, 2019 pISSN 1859–1388 eISSN 2615–9678 10 mM β-mercaptoethanol) Dịch chiết đồng ly tâm 8.000 vòng/phút 20 phút lọc qua giấy lọc Miracloth để loại bỏ phần cặn, thu lấy dịch chiết kết tủa với 60% ammonium sulphate bão hòa 30 phút, ly tâm 8.000 vòng/phút 20 phút Phần kết tủa thu hòa tan đệm hòa tan chứa 50 mM phosphate pH 7,6, mM Na2EDTA, 20% glycerol 10 mM sodium pyruvate ủ 65oC phút Trong điều kiện này, hầu hết protein bị biến tính thu lấy sau ly tâm bảo quản 20oC Hoạt độ enzyme MtDHDPS1 xác định theo phương pháp Ghislain et al., (1990) [7] ml dịch phản ứng chứa 100 mM Tris-HCl pH8, 35 mM pyruvate, mM L-aspartic- β -semi-aldehyde (ASA) trung hòa, 35 µl dung dịch aminobenzaldehyde (0,5 mg β -ABA/35 µl ethanol tuyệt đối) Hỗn hợp phản ứng ủ 37oC 60 phút, phản ứng dừng lại cách bổ sung thêm 200 µl of 12% trichloroacetic acid tiếp tục ủ tối từ 60 - 90 phút, kết phản ứng làm chuyển màu mẫu thí nghiệm mức độ tạo màu đậm nhạt tùy thuộc vào lượng MtDHDPS1 có mẫu Hoạt độ MtDHDPS1 xác định cách đo bước sóng 550 nm [7, 13] Hoạt độ riêng MtDHDPS1 mẫu M truncatula lô đối chứng lơ thí nghiệm tính lượng enzyme mẫu cho phép tăng khả hấp thụ bước sóng 550 nm lên 0,001 phút diện L - ASA thể đơn vị (unit/mg protein) [2] Hàm lượng protein mẫu xác định theo phương pháp Braford (1976), sử dụng bovine serum albumin (BSA) làm mẫu protein chuẩn Kết thảo luận Kiểm tra chất lượng RNA tổng số Kết điện di kiểm tra chất lượng RNA tổng số gel agarose 1% không biến tính thể hình cho thấy xuất băng RNA ribosome đậm, rõ nên với kết kết luận với quy trình ly trích thí nghiệm chúng tơi hồn tồn thu nhận RNA với nồng độ cao, có độ tốt có tồn RNA mẫu kiểm tra Chất lượng RNA tổng số sử dụng cho thí nghiệm nghiên cứu Phân lập đoạn gen MtDHDPS1 Kết phân lập từ hình cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen có băng nhất, nồng độ cao, rõ nét, kích thước vào khoảng 250 bp so sánh với khối lượng thang chuẩn DNA có kích thước 100 - 1500 bp hãng BioBase Sở dĩ sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen MtDHDPS1 có kích thước cao so với tính tốn ban đầu đặc tính enzyme xúc tác cho phản ứng bổ sung nucleotide Taq DNA polymerase mà chúng tơi sử dụng Enzyme có khả kéo dài sản phẩm PCR cách gắn thêm Adenin, số lượng Adenin gắn vào lên đến 200 nucleotid [14] Với tính đặc hiệu kết PCR, nên bước đầu chúng tơi có nhận định nhân đoạn gene thành công DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1E.5434 31 Hồng Thị Kim Hồng CS Hình Ảnh điện di kiểm tra chất lượng RNA tổng số gel agarose khơng biến tính M: Marker (Invitrogen) RNA tách chiết từ M truncatula điều kiện tưới nước đầy đủ (1), mẫu ngày xử lý hạn (2) mẫu 10 ngày xử lý hạn (3) Hình Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RT- PCR gel agarose M: thang chuẩn khối lượng phân tử DNA (100 10000 bp (GeneRulerTM DNA Ladder), 2: sản phẩm RT-PCR đoạn gene MtDHDPS1 Tạo dòng đoạn gen MtDHDPS1 vào vector pGEM®-T-easy (Promega) Vector pGEM-T easy có kích thước khoảng 3015 bp, mang gen Ampr, gene lacZ, polylinker promoter đặc trưng cho RNA polymerase (SP6, T7) hai bên vùng polylinker cho phép phiên mã đoạn DNA gắn vector thành nhiều RNA (hình 4) Các RNA thường dùng làm mẫu dò hay dùng nghiên cứu cấu trúc chức RNA Loại vector mở sẵn vùng tạo dòng gen lacZ mang hai đầu T, thích hợp cho việc gắn sản phẩm PCR có mang hai đầu A 32 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Vol 128, No 1E, 27–37, 2019 pISSN 1859–1388 eISSN 2615–9678 Hình Kết sản phẩm gắn đoạn gen MtDHDPS1 môi trường chọn lọc Các đoạn gene MtDHDPS1, sau phân lập phản ứng PCR có gắn thêm Adenine (dA) vào đầu 3’ (do đặc tính enzyme Taq DNA polymerase) nhằm tạo liên kết bổ sung với Timin (dT) thiết kế vector pGEM-T easy phương pháp tạo dòng TA cloning) [13] Sản phẩm PCR sau thu hồi từ gel kit isolate ii pcr and gel (Bioline) Hệ thống tinh gel dựa khả kết hợp DNA với màng silica có cột có mặt hỗn hợp muối Hỗn hợp muối loại khỏi DNA tinh bước rửa DNA tinh thu hồi với đệm có chứa nồng độ muối thấp Hệ thống màng kết hợp lên tới 25 µg DNA cho phép thu hồi sản phẩm sau 10 phút Quá trình tinh giúp loại bỏ khỏi sản phẩm PCR thành phần không mong muốn đoạn DNA vệ tinh, NTPs Sản phẩm gắn biến nạp vào tế bào vật chủ E coli TOP10 dàn môi trường chọn lọc Luria-Bertani (0,5% dịch chiết nấm men, 1% tryptone 1% NaCl) (Vulfson cs, 2001) + ampicilin 100 µg/ml + 100 mM IPTG + 100 mg/ml X gal Kết biến nạp thể hình cho thấy có hai dịng khuẩn lạc xanh-trắng xuất với tỷ lệ tương đương Khuẩn lạc trắng khuẩn lạc có khả mang vector tái tổ hợp pGEM/MtDHDPS1 Chúng chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc trắng chuyển vào môi trường LB lỏng có bổ sung 100 µg/ml ampicilin, ni qua đêm 37°C tủ lắc Huyền dịch thu (3 ml) tiến hành thu sinh khối, tách chiết tinh plasmid tái tổ hợp Kiểm tra diện đoạn gen MtDHDPS1 phản ứng PCR trực tiếp với cặp mồi đặc hiệu gián tiếp thông qua cặp mồi M13 thiết kế hai đầu vùng tạo dòng vector pGEM-T easy (Promega) Kết tách chiết plasmid thể hình cho thấy tất ba khuẩn lạc cho băng DNA plasmid đậm, rõ nét có kích thước tương đương với kích thước tính tốn ban đầu Kết PCR với cặp mồi đặc hiệu (Hình 5) kết PCR với cặp mồi M13 (Hình 6) cho băng DNA nhất, có nồng độ cao, kích thước băng DNA thu tương đương với kích thước băng DNA phân lập ban đầu khoảng 250 bp khoảng 450 bp (kết PCR với cặp mồi M13 bao gồm kích thước đoạn gene khoảng 250 bp + kích thước đoạn gene cặp mồi M13 khuếch đại vector pGEM-T easy khoảng 200 bp) Qua kết luận rằng, gắn thành công đoạn gen MtDHDPS1 vào vector pGEM-T easy biến nạp vào tế bào vật chủ E coli chủng TOP10 Plasmid tái tổ hợp chúng tơi gửi phân tích trình tự nucleotide Công ty 1st BASE, Malaysia thông qua Công ty TNHH phát triển Công nghệ ứng dụng Việt Nam VNDAT phương pháp đánh dấu huỳnh quang dideoxy-terminator máy 3130 ABI (Applied Biosystem) (Hình 7) DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1E.5434 33 Hồng Thị Kim Hồng CS Hình Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tinh plasmid tái tổ hợp gel agarose Lane M: thang chuẩn khối lượng phân tử DNA ((Invitrogen); lane 1, 3: plasmid tái tổ hợp pGEM có chứa gen MtDHDPS1 Hình Ảnh điện di kiểm tra diện đoạn gen DHDPS1 từ khuẩn lạc trắng môi trường chọn lọc gel agarose Lane M1: thang chuẩn khối lượng phân tử DNA (100 -10000 bp (GeneRulerTM DNA Ladder); lane 1, 3: khuẩn lạc dương tính 1, có chứa gen MtDHDPS1 Kết phân tích trình tự đoạn gene thu kích thước 212 bp (đối với đoạn gen MtDHDPS1) Đoạn gen mang trình tự nucleotide có độ tương đồng cao đối vi trình tự nucleotide cơng bố ngân hàng gene giới (GenBank) với mã số XM_013613732 (99%) (Hình 7) Hình Mức độ tương đồng đoạn gen MtDHDPS1 với đoạn gen MtDHDPS1 công bố ngân hàng gene giới với mã số Genbank XM_013613732 34 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Vol 128, No 1E, 27–37, 2019 pISSN 1859–1388 eISSN 2615–9678 Thăm dò biến động gen MtDHDPS1 M truncatula xử lý thiếu nước Để kiểm tra biến động gen mã hóa tạo enzyme MtDHDPS1 xúc tác cho đường chuyển hóa tổng hợp Lysine M truncatula qua thời gian xử lý hạn khác sử dụng phương pháp Realtime RT-PCR để kiểm tra Chúng sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen MtDHDPS1 Ellent cộng công bố năm 2013 [2] để thiết lập nên thí nghiệm (thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR) SYBR Green thuốc nhuộm liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đơi SYBR Green phóng thích lượng nhờ tín hiệu huỳnh quang dạng tự dung dịch, tín hiệu huỳnh quang tăng lên 1000 lần liên kết với DNA mạch đơi Như vậy, tín hiệu huỳnh quang tổng từ phản ứng tỷ lệ với lượng DNA mạch đơi diện, gia tăng trình tự mục tiêu khuếch đại Mức độ biểu ổn định gen DHDPS1 có M truncatula đánh giá thông qua thời gian xử lý hạn khác (xử lý hạn ngày 10 ngày) Chu kỳ ngưỡng (Ct: Threshold cycle) tất mẫu phân tích giá trị sử dụng để so sánh mức độ biểu gen MtDHDPS1 Tỷ lệ biểu gen tính theo cơng thức sau: Tỷ lệ biểu gene MtDHDPS1 = 2Ct [C]-Ct[T] [4] đó: Ct[C] chu kỳ ngưỡng khuếch đại mRNA gene MtDHDPS1 không xử lý (đối chứng); Ct[T] chu kỳ ngưỡng khuếch đại mRNA gene MtDHDPS1 có xử lý 2: lượng DNA tăng gấp đôi sau chu kỳ nhiệt Phản ứng Realtime -PCR cho thấy tín hiệu huỳnh quang (Fluorescence) gen MtDHDPS1 qua thời gian xử lý thiếu nước khác có thay đổi khác Đối với mức độ biểu gen MtDHDPS1 (Hình Hình 9) Giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) mẫu thu từ có thời gian xử lý hạn ngày thấp so với mẫu thu từ xử lý hạn 10 ngày 5,53 chu kỳ, tương đương với mức độ biểu gen MtDHDPS1 xử lý hạn ngày cao so với xử lý hạn 10 ngày 5,53 lần Mặt khác, giá trị Ct thu đối chứng ngày thấp so với đối chứng 10 ngày 2,64 chu kỳ, tương ứng với mức độ biểu đối chứng ngày cao so với đối chứng 10 ngày 2,64 lần Như số chu kỳ ngưỡng dao động thu từ mẫu hai lần xử lý hạn cao so với số chu kỳ ngưỡng dao động thu đươc từ mẫu đối chứng ngày 10 ngày Điều cho ta thấy mức độ biểu gen MtDHDPS1 từ mẫu thu từ qua hai thời điểm xử lý hạn dao động lớn so với đối chứng Vậy, điều kiện xử lý hạn làm giảm lớn mức độ biểu gen MtDHDPS1 làm thay đổi mức độ biểu gen này, giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) gen MtDHDPS1 hai loại mẫu xử lý hạn ngày 10 ngày thấp so với mẫu đối chứng không xử lý thiếu nước tương ứng, đồng thời mức độ biểu gen MtDHDPS1 xử lý hạn ngày cao so với xử lý hạn 10 ngày 25,53 lần DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1E.5434 35 Hoàng Thị Kim Hồng CS Hình Kết xác định biến động genMtDHDPS1 qua thời gian xử lý hạn khác Hình Đồ thị điển hình từ phản ứng Realtime RT-PCR xác định biến thiên gen MtDHDPS1 có M truncatula qua xử lý hạn với thời gian khác 1: mẫu thu sau ngày xử lý hạn, 2: mẫu đối chứng ngày xử lý hạn, 3: mẫu thu sau 10 ngày xử lý hạn, 4: mẫu đối chứng 10 ngày xử lý hạn Kết luận Từ nghiên cứu rút kết luận sau: Đã phân lập đoạn gen MtDHDPS1 từ M truncatula co kích thước 212 bp có trình tự nucleotide tương đồng cao trình tự nucleotide cơng bố ngân hàng gene (GenBank) với mã số XM_013613732 (99%) Xử lý stress thiếu nước sau ngày 10 ngày gây ảnh hưởng rõ rệt đến biến động của gen MtDHDPS1 M truncatula Lời cảm ơn Chúng chân thành cám ơn Giáo sư Geert Angenon, Đại học Vrije (VUB) Bỉ cung cấp hạt giống M truncatula cho triển khai nghiên cứu Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số “106-NN.02-2014.13" 36 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Vol 128, No 1E, 27–37, 2019 pISSN 1859–1388 eISSN 2615–9678 Tài liệu tham khảo Blickling S, Knäblein J Feedback inhibition of dihydrodipicolinate synthase enzymes by L-lysine, Biological Chemistry 1997;207-210 Ellen E, Pieter VB, Thu TT, Geert A Medicago truncatula dihydrodipicolinate synthase (DHDPS) enzymes display novel regulatory properties Plant Molecular Biology 2013;81:401-415 Galili G Regulation of lysine and threonine synthesis The Plant Cell 1995; 7:899-906 Dereppe C, Bold G, Ghisalba O, Ebert E, Schar HP Purification and characterization of dihydrodipicolinate synthase of pea Plant Physiology 1992; 98:813-821 Frisch D, Gengenbach B, Tommey A, Sellner J, Somers D, Myers D Isolation and characterization of dihydrodipicolinate synthase from maize Plant Physiology 1991; 96:444-452 Frugoli J Medicago truncatula as a model system in plant molecular biology In: Kirti, P.B (Editor), Handbook of new technologies for genetic improvement of legumes CRC Press, Taylor & Francis Group, Chapter 2008;23: 339-352 Ghislain M, Frankard V, Jacobs M Dihydrodipicolinate synthase of Nicotiana sylvestris, a chloroplastlocalized enzyme of the lysine pathway Planta 1990; 180:480-486 Huguet T, Prosperi JM Medicago truncatula: a legume model-plant In: Genier G (ed.), Prosperi J.M (ed.) The Genus Medicago in the Mediterranean region: Current situation and prospects in research Zaragoza : Cihram 1996; 171-175 Harrison MJ Development of the arbuscular mycorrhizal symbiosis Current Opinion in Plant Biology 1998; 1:360-365 10 Long ĐT, Chương HV, Hồng HTK, Trang NTQ, Yến PTH, Khánh VP Nghiên cứu tạo dòng biểu gene mã hóa kháng nguyên glycoprotein c virus dịch tả vịt phân lập Thừa Thiên Huế Hue University Journal of Science: Natural Science 2018 09 20;127(1C):21 https://doi.org/10.26459/hueunijns.v127i1c.4924 11 Mantiri FR, Kurdyukov S, Lohar DP, Sharopova N, Saeed NA, Wang XD, VandenBosch KA, Rose RJ The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula Plant Physiology 2008; 146: 1622-1636 12 Hồng HTK, Trang PTH, Long ĐT, Trang NTQ Cloning and optimizing the expression of the DHDPS gene in the Medicago truncatula Legume Research 2019;482: 1-6 13 Nolan KE, Rose RJ Plant regeneration from cultured Medicago truncatula with particular reference to abscisic acid and light treatments Australian Journal of Botany 1998; 46: 151-160 14 Rose RJ, Rose RJ Medicago truncatula as a model for understanding plant interactions Review Functional Plant Biology, 2008; 35: 253-264 DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1E.5434 37 ... Thăm dò biến động gen MtDHDPS1 M truncatula xử lý thiếu nước Để kiểm tra biến động gen mã hóa tạo enzyme MtDHDPS1 xúc tác cho đường chuyển hóa tổng hợp Lysine M truncatula qua thời gian xử lý hạn... bày kết nghiên cứu ảnh hưởng việc xử lý thiếu nước lên biến động gen MtDHDPS1 mã hóa dihydrodipicolinate synthase (Mt DHDPS1) đồng thời xác định hoạt độ enzyme MtDHDPS1 mẫu M truncatula 28 Tạp... nucleotide công bố ngân hàng gene (GenBank) với mã số XM_013613732 (99%) Xử lý stress thiếu nước sau ngày 10 ngày gây ảnh hưởng rõ rệt đến biến động của gen MtDHDPS1 M truncatula Lời cảm ơn Chúng