Progesterone là hormone có liên quan chặt chẽ đến quá trình sinh lý sinh sản ở động vật. Nồng độ hormone này có ở trong máu, nước tiểu, sữa được sử dụng làm căn cứ để xác định có thai sớm ở bò. Để xác định được sự có mặt của progesterone bằng các phương pháp thử đặc hiệu như que thử nhanh thì một trong những bước quan trọng nhất là tạo được dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng kháng progesteron. Phương pháp gây miễn dịch, thu tế bào lách ở chuột BALB/c, tạo dòng tế bào lai và ELISA đã được áp dụng trên cơ sở sử dụng ba loại kháng nguyên khác nhau, chuột đáp ứng miễn dịch tốt nhất khi tiêm kháng nguyên ở nồng độ 200 µg/mL/con, tỷ lệ giếng có tế bào lai cao nhất ở mỗi loại kháng nguyên đạt từ 91,67% trở lên. Nghiên cứu đã tạo được 5 dòng tế bào lai (E4, E3, C6, H3, F10) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên progesterone antigen; 3 dòng tế bào lai (C12, D7, F11) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên progesterone BSA antigen; 3 dòng tế bào lai (G5, H3, A7) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên progesterone-3-CMO: BSA antigen.
Vietnam J Agri Sci 2019, Vol 17, No 8: 605-613 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2019, 17(8): 605-613 www.vnua.edu.vn NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG PROGESTERONE Nguyễn Thị Hải1, Lê Văn Phan2, Nguyễn Bá Mùi3, Nguyễn Hoàng Thịnh3, Nguyễn Thị Phương Giang3, Trần Hiệp3, Cù Thị Thiên Thu3, Phạm Kim Đăng3* Viện Sinh thái Bảo vệ công trình Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: pkdang@vnua.edu.vn Ngày chấp nhận đăng: 30.09.2019 Ngày gửi bài: 03.08.2019 TĨM TẮT Progesterone hormone có liên quan chặt chẽ đến trình sinh lý sinh sản động vật Nồng độ hormone có máu, nước tiểu, sữa sử dụng làm để xác định có thai sớm bò Để xác định có mặt progesterone phương pháp thử đặc hiệu que thử nhanh bước quan trọng tạo dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng kháng progesteron Phương pháp gây miễn dịch, thu tế bào lách chuột BALB/c, tạo dòng tế bào lai ELISA áp dụng sở sử dụng ba loại kháng nguyên khác nhau, chuột đáp ứng miễn dịch tốt tiêm kháng nguyên nồng độ 200 µg/mL/con, tỷ lệ giếng có tế bào lai cao loại kháng nguyên đạt từ 91,67% trở lên Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai (E4, E3, C6, H3, F10) có khả tiết kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên progesterone antigen; dòng tế bào lai (C12, D7, F11) có khả tiết kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên progesterone BSA antigen; dòng tế bào lai (G5, H3, A7) có khả tiết kháng thể đơn dòng kháng kháng ngun progesterone-3-CMO: BSA antigen Từ khóa: Chuột BALB/c, ELISA, kháng thể đơn dòng, progesterone, tế bào lai Study on Establishment of Hybrid Cell Lines Secreting Monoclonal Antibody for Progesterone ABSTRACT Progesterone is a hormone that relates closely to the reproductive physiology of animals The progesterone levels in blood, urine and milk have been used to determine pregnancy in cows In order to detect the appearance of progesterone using specific tests, one must create hybrid cells that secrete monoclonal antibody for this hormone, as one of the most important factors The methods of immunization, collection of spleen cells of BALB/c mice, production of hybrid cell lines and ELISA had been applied Based on the use of different types of antigens, mice differently responded to selective progesterone antigens with the concentration of 200 µg/mL per mouse The highest successful hybridization rate was 91.67% The study created hybrid cell lines (E4, E3, C6, H3, F10) secreting monoclonal antibodies for progesterone antigen, hybrid cell lines (C12, D7, F11) secreting monoclonal antibodies for progesterone BSA antigen and hybrid cell lines (G5, H3, A7) secreting monoclonal antibodies for progesterone3-CMO: BSA antigen Keywords: BALB/c mice, ELISA, monoclonal antibody, progesterone, hybrid cell T VN Progesterone v cỏc dộn xuỗt thuộc nhóm steroid, chủ yếu thể vàng tiết chu kỳ tính (sau trứng rụng, thể vàng hình thành) giai độn mang thai (Gomes & Erb, 1965) Trong lïnh vực chën nuôi thú y, hormone progesterone ứng dụng rộng rãi chương trình quân lý nâng cao khâ nëng sinh sân điều trð rối loän sinh sân, điều khiển sinh sân theo kế hoäch, gåy động dục đồng pha, cỗy truyn phụi, chốn oỏn cũ thai cho bủ (EMEA, 2004) Ở bò, nồng độ progesterone đät giá trð cao nhỗt vo ngy 21 v 22 tớnh t thi 605 Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng progesterone điểm thụ thai (Burger, 1970; Bermard, 1996) Sự diện progesterone sữa huyết ứng dụng để chèn đoán mang thai sớm bò từ nëm 70 (Pope & cs., 1976; Thirapatsukun & Entwistle, 1978) Hiện nay, có nhiều phương pháp để đðnh lượng xác síc kí lóng - khối phổ (LC/MS), phương pháp bán đðnh lượng đặc hiệu kỹ thuêt miễn dðch phóng xä (RIA), kỹ thuêt miễn dðch enzyme (ELISA) hay phương pháp đðnh tính đặc hiệu que thử nhanh dựa receptor kháng thể đặc hiệu Trong đò, phương pháp đðnh lượng xác bìng síc ký, phương pháp bán đðnh lượng bìng miễn dðch đặc hiệu phương pháp cò độ xác cao cỉn cỏc thit b rỗt ớt tin, vờn hnh phc tọp, cán phân tích phâi đào täo có tay nghề cao thực Vì vêy, phương pháp chỵ sử dụng nghiên cứu Do đò, để đưa vào thực tế sân xuỗt, cỏc nh khoa hc thng nghiờn cu, tỡm kim phương pháp đơn giân, dễ sử dụng để đðnh tính progesterone Que thử nhanh (quick-stick) chế täo dựa sở phân ứng kháng nguyên - kháng thể để xác đðnh có mặt hormone sinh sân nói chung hormone progesterone nói riêng giâi pháp phát triển ứng dụng thực tế, khơng đđi hói thiết bð cơng nghệ cao với kï thuêt phức täp Để chế täo que thử thai nhanh dựa vào xác đðnh có mặt hormone progesterone cỉn phâi có kháng thể đơn dđng cò lực cao với hormone Do đò, việc chọn dòng tế bào có khâ nëng tổng hợp kháng thể kháng kháng ngun cò tính đặc hiệu lực kháng nguyên - kháng thể cao l rỗt cổn thit, chỳng s l ngun cung cỗp khỏng th c hiu progesterone rỗt tim nởng v khơng giới hän Nghiên cứu nhìm täo dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dñng kháng progesterone ứng dng cho sõn xuỗt que th thai nhanh cho bũ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Kháng nguyên: loäi kháng nguyên bao gồm progesterone antigen (Mã code MBS238011, hãng Mybiosource, Mỹ), progesterone-3-BSA antigen (Mã code LA330, hãng East Coast Bio, Mỹ) progesterone-3CMO: BSA antigen (Mã code ND-R0752, hãng Novateinbio, Mỹ) - Chuột BALB/c thuæn chủng dòng tế bào ung thư tủy xương Myeloma Sp2/0-Ag14 (Sigma, M) - Húa chỗt: dung dch DMEM Gibco, Freunds adjuvants complete (FAC), Freund’s adjuvants incomplete (FAI), PEG, PBS, FBS, Tween, HAT (Sigma, Mỹ) Bảng Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ kháng nguyên thích hợp gây miễn dịch cho chuột Kháng nguyên Progesterone antigen Progesterone -3-BSA antigen Progesterone-3-CMO: BSA antigen 606 Nồng độ kháng nguyên (µg/mL) Lần thí nghiệm 50 100 200 300 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Nguyễn Thị Hải, Lê Văn Phan, Nguyễn Bá Mùi, Nguyễn Hoàng Thịnh, Nguyễn Thị Phương Giang, Trần Hiệp, Cù Thị Thiên Thu, Phạm Kim Đăng 2.2 Phương pháp 2.2.1 Gây miễn dịch cho chuột chủng BALB/c kháng nguyên khác Một trëm ba mươi lëm chuột BALB/c sử dụng để thử khâ nëng gåy miễn dðch kháng nguyên, kháng nguyên thử 15 chuột với liều khác nhau, thí nghiệm lặp läi lỉn Số lượng chuột thí nghiệm bố trí theo bâng Chuột gây miễn dðch theo phương pháp Kõhler & Milstein (1975), có câi tiến (Liddell & Cryer, 1991) sau: - Phối trn khỏng nguyờn vi cỏc chỗt b tr FAC hoc FAI theo tỷ lệ 1:1 - Gây miễn dðch cho chuột theo nồng độ khác bâng (mỗi chuột tiêm lặp läi læn, læn cỏch ngy) - Lỗy mỏu tim v thu huyết sau 10 ngày gây miễn dðch để đánhgiá khâ nëng đáp ứng bìng phương pháp ELISA 2.2.2 Thu tế bào lympho B lách chuột Lách ca chut cũ ỏp ng dch tt nhỗt thu theo phương pháp Leger & Wsaldanha (2000) Tế bào sau tách bâo quân mơi trường DMEM có bổ sung 10% FBS a Tạo dòng tế bào lai (hybridoma) tiết kháng thể đơn dòng kháng progesterone + Đánh thức nuôi tế bào: Chuyển ống tế bào Myeloma Sp2/0-Ag14 từ nitơ lóng sang bể ỗm 37C cho ró ụng Chuyn dung dch cha tế bào sang ống ly tâm, tiến hành ly tâm với tốc độ 1.000 vòng/phút phút Gän bó lớp dðch nổi, hòa tan cặn tế bào với mơi trường ni DMEM có bổ sung HAT, chuyển dung dch t bo sang chai nuụi cỗy T bo c nuụi t ỗm vi iu kin 37C, 5% CO2 Sau 2-3 ngày thay mơi trường lỉn + Dung hợp tế bào: Tiến hành dung hợp tế bào theo phương pháp Kõhler & Milstein (1975), tế bào Myeloma Sp2/0-Ag14 tế bào Lympho B trộn với tỷ lệ khác nhau, sau đò ly tâm tốc độ 1.000 vòng/phút, phút thu cặn tế bào Nhó 0,3 mL dung dðch PEG 50% vào cặn tế bào, ủ phút nhiệt độ phòng, sau đò bổ sung tiếp 10mL dung dðch DMEM, ly tâm hỗn hợp 1.000 vòng/phút phút thu cặn tế bào Hòa tan cặn tế bào mơi trường DMEM có bổ sung HAT, 150 µL dung dðch tế bào chia vào giếng đïa loọi 96 ging v t ỗm 37C Sau 5-10 ngày lội bó dðch ni thêm vào giếng 150 µL dung dðch DMEM có bổ sung HAT Sau 10 ngy dung hp, lỗy dch ni v dựng phân ứng ELISA để sàng lọc tế bào dương tính + Täo dòng tế bào lai (hybridoma) tiết kháng thể n dủng khỏng progesterone: ùa nuụi cỗy t bo cú chứa tế bào lai cho kết quâ ELISA dương tính cao nhỗt c la chn tọo dũng t bo lai Hút hỗn dðch tế bào sang ống ly tâm có chứa mơi trường DMEM để pha lỗng tế bào cho nồng độ đät tế bào/100 µL Sau đò chuyển tế bào pha lỗng sang giếng nuụi cỗy mi vi th tớch 100 àL /1 ging, nuôi điều kiện 37C, 5% CO2 Sử dụng phân ứng ELISA để đánh giá läi khâ nëng sinh kháng thể dòng tế bào lai Từ đò, dđng tế bo lai cú hiu giỏ cao nhỗt s c chn nhân lên + Kiểm tra khâ nëng bít cặp đặc hiệu kháng thể đơn dñng với kháng nguyên tương ứng: Phương pháp ELISA sử dụng để xác đðnh khâ nëng bít cặp chéo kháng thể đơn dòng với kháng nguyên khác sau: Phủ bân bìng 100 µL kháng ngun progesteron dung dðch gín 4C qua đêm (nồng độ 125 ng kháng ngun/giếng) Sau đò rửa bân lỉn bìng Washing buffer để lội bó kháng ngun khơng gín vào bề mặt bân Phủ bân bìng 300 µL Washing buffer + 1% Skim milk h 37C Rửa bân lỉn bìng Washing buffer Bổ sung kháng thể (dch ni ca mụi trng nuụi cỗy) ó pha lỗng 5.000 lỉn bìng Washing buffer + 1% Skim milk Ủ 37C h Rửa bân læn bìng Washing buffer lội bó kháng thể khơng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên Đưa vào giếng 100 µL kháng thể gín enzyme peroxidase pha lỗng 10.000 lỉn 607 Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng progesterone đệm Washing buffer + 1% sữa Đem ủ bân 37C h Rửa bân 10 lỉn bìng Washing buffer a vo mi ging 100 àL dung dch c chỗt TMB Ủ bân 37C 10 phút Dừng phân ứng bìng cách bổ sung 50 µL H2SO4 1N Đo giá trð OD450 (mêt độ quang học) bìng ELISA reader, giếng có giá trð OD ≥0,5 coi dương tính, tức có mặt kháng thể đơn dñng kháng kháng nguyên progesterone b Xác định số lượng tế bào buồng đếm Neubauer Đếm tế bào bìng buồng đếm Neubauer: Trộn 100 µL huyễn dðch tế bào 900 µL thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha 1/10) Đưa hỗn hợp thuốc nhuộm tế bào lên buồng đếm Số tế bào mL: C chuột tiêm với loäi kháng nguyên khác (p >0,0001) Giá trð hiệu giá kháng thể cò xu hướng tëng nồng độ kháng nguyên gây miễn dðch tëng Giá trð OD450 méu huyết khơng có khác biệt lớn chuột tiêm nồng độ khác (p >0,0001) Tuy nhiên, với nồng độ kháng nguyên gây miễn dðch 200 µg/mL/con giá trð hiệu giá kháng thể cò xu hướng đät giá trð cao so với nồng độ tiêm khác (Bâng 2) Kết quâ nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Cù Thð Thiên Thu & cs (2017) cò khác biệt so với nghiên cứu Fantl & cs (1982) Theo Fantl & cs (1982), chuột BALB/c gây đáp ứng miễn dðch với kháng nguyên 11αhydroxyprogesterone liều 30 µg/con tốt liều µg/con Sự khác biệt s khỏc bit v cỗu trỳc khỏng nguyờn Nh vêy, với kháng nguyên lựa chọn thð trường có khâ nëng gåy miễn dðch tốt chuột BALB/c 3.2 Số lượng tế bào lympho B chuột gây miễn dịch n d 104 Trong đò: C: số tế bào mL n: số tế bào ô vuông d: nồng độ pha loãng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khả đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyờn Kt quõ nghiờn cu cho thỗy chut c tiờm với nồng độ khác cho phân ứng miễn dðch Ở nồng độ tiêm, giá trð OD450 méu huyết khơng có khác biệt Thí nghiệm tiến hành đánh giá số lượng tế bào lympho B chuột cò đáp ứng miễn dðch tốt nhỗt vi nng khỏng nguyờn c tiờm 200 àg/mL/con Số lượng tế bào lympho B chuột cò ỏp ng dch tt nhỗt vi khỏng nguyờn progesterone antigen đät giá trð trung bình 1,94×109 tế bào, dao động từ 1,5×109 tế bào đến 2,7×109 tế bào; kháng nguyên progesterone-3-BSA antigen đät giá trð trung bình 1,64×109 tế bào, dao động từ 1,3×109 tế bào đến 2,2×109 tế bào; kháng nguyên progesterone-3-CMO: BSA antigen đät giá trð trung bình 1,72×109 tế bào, dao động từ 1,5×109 tế bào đến 2,2×109 tế bào (Bâng 3) Bảng Giá trị OD450 mẫu huyết chuột nồng độ gây miễn dịch khác loại kháng nguyên Nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch (µg/mL/con) Tên kháng nguyên 50 a 0,597 ± 0,146 a 0,514 ± 0,191 a 0,526 ± 0,261 Progesterone antigen 0,081 ± 0,012 Progesterone -3-BSA antigen 0,064 ± 0,006 Progesterone-3-CMO: BSA antigen 0,067 ± 0,005 100 200 300 b b 2,301 ± 0,698 b 2,089 ± 0,723 b 1,916 ± 0,781 b 1,736 ± 0,829 b 1,865 ± 0,68 b 1,811 ± 0,583 ab 1,172 ± 0,247 ab 0,952 ± 0,317 ab 1,075 ± 0,519 b b Ghi chú: Trong hàng, giá trị trung bình mang chữ khác sai khác có ý nghĩa thống kê (P