Với mục đích sử dụng bức xạ gamma tạo dòng Trichoderma biến dị có khả năng sinh cellulase cao, bài viết bước đầu khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma tới tỷ lệ sống sót và khả năng sinh cellulase của chủng nấm Trichoderma koningiopsis.
THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG Trichoderma SINH CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ GAMMA Cellulase enzyme công nghiệp quan trọng, ứng dụng nhiều lĩnh vực đời sống Vi sinh vật, đặc biệt chủng nấm Trichoderma nguồn cung cấp cellulase chủ yếu Nghiên cứu tạo dịng Trichoderma có khả sinh cellulase cao xử lí chiếu xạ Sau chiếu xạ, tỷ lệ sống sót Trichoderma dải liều tối ưu tạo đột biến sinh cellulase cao xác định Hoạt tính enzyme chủng chủng sau chiếu xạ đánh giá bán định lượng phương pháp khuếch tán đĩa thạch định lượng phương pháp xác định hoạt độ cellulase dựa vào lượng đường khử tạo thành (DNS.) Kết cho thấy tỷ lệ đột biến cao đạt 12,33-14,25% khoảng liều 700-1500 Gy Năm (05) khuẩn lạc sau chiếu xạ sàng lọc có khả sinh cellulase cao vượt trội ổn định sau hệ, hoạt độ - CMCase (thủy phân chất CMC) hoạt độ enzyme tổng số-FPase (thủy phân giấy lọc Whatman số 1) khuẩn lạc cao chủng tương ứng 1,51-2,48 lần 1,2-1,87 lần Như vậy, xử lý chiếu xạ gamma phương pháp gây đột biến hiệu nâng cao khả sinh cellulase chủng Trichoderma MỞ ĐẦU Cellulose hợp chất cao phân tử trùng hợp (polyme hóa) từ gốc β-D-glucose cầu nối β-1-4-glucosid nhờ vào khả tự dưỡng ánh sáng mặt trời; vậy, cellulose hợp chất phổ biến tự nhiên [1, 2] Để q trình thủy phân cellulose nhanh chóng triệt để phải có tham gia phức hệ đa enzyme (cellulosome) gồm ba loại enzyme cellulase endoglucanase, exoglucanase β-glucosidase Cellulosome có khả tác động hiệp đồng giúp việc phân cắt đồng thời triệt để vùng vơ định hình vùng tinh thể phân tử cellulose khoảng thời gian ngắn so với tác động loại enzyme riêng rẽ [3, 4, 5] cellulase hoạt tính cao gấp vài trăm lần so với vi khuẩn mà chủng Trichoderma thu hút quan tâm đặc biệt Cellulase ngoại bào từ số chủng Trichoderma thường tồn dạng cellulosome nhờ theo thống kê Hiệp hội Hóa Học (Current Opinion Green and Sustainable Chemical) nay, Trichoderma nghiên cứu ứng dụng nhiều sản xuất cellulase công nghiệp [6] Các tia X, g, tia notron có bước sóng ngắn nên có khả ion hóa khả xuyên sâu cao Các tia phóng xạ gây đột biến cách làm đứt gãy ADN, thay đổi cấu trúc ADN hình thành hợp chất có hoạt tính khơng ổn định làm biến đổi ADN Bức xạ ion hóa Trichoderma spp loại nấm sợi diện gần tạo đột biến vị trí xác định nhờ tất loại đất nhiều mơi hoạt tính vi sinh vật cải thiện Ngồi ra, trường sống khác Nhờ việc ni cấy dễ dàng, gây đột biến xạ có nhiều ưu điểm không tốn với khả tiết enzyme phổ đột biến rộng, tần suất đột biến cao… làm tăng khả chọn đột biến mong 34 Số 65 - Tháng 12/2020 THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN muốn rút ngắn thời gian sàng lọc [7] Để cải thiện khả sinh cellulase Trichoderma nhiều nghiên cứu gây đột biến chủng nấm xạ tia gamma thực Trong nghiên cứu Shahbazi cộng sự, hoạt tính cellulase Trichoderma reesei cải thiện tăng 1,5-1,99 lần nhờ tác nhân gamma [8] Trên chất bã mía, chủng Trichoderma viride xử lý chiếu xạ liều 20 krad lần liên tiếp có hoạt tính sinh cellulase tăng 253,5% thay tăng 134,5% xử lý lần liều chiếu [9] Tamada cộng đánh giá ảnh hưởng xạ gamma lên chủng Trichoderma reesei nhận thấy tỷ lệ sống sót chủng nấm giảm dần theo tăng dần liều chiếu Đồng thời, chủng đột biến thu liều chiếu 2000 Gy có khả sinh cellulase cao chủng 1,8 lần [7] Với mục đích sử dụng xạ gamma tạo dịng Trichoderma biến dị có khả sinh cellulase cao, nghiên cứu bước đầu khảo sát ảnh hưởng xạ gamma tới tỷ lệ sống sót khả sinh cellulase chủng nấm Trichoderma koningiopsis Môi trường nuôi cấy lỏng sử dụng gồm thành phần sau: CMC 2g, KH2PO4 4g; (NH4)2SO4 13,6g; CaCl2 0,8g; MgSO4 0,6g; pepton; yeast extract 0,1g; FeSO4.H2O 1mg; MnSO4.2H2O 0,32 mg; ZnSO4.7H2O 0,28mg; CoCl2.6H2O 0,4mg; CuSO4.5H2O 0,25mg, nước cất vừa đủ 1000 mL 2.1.2 Phương pháp 2.1.2.1 Bảo quản giữ giống Chủng giống T koningiopsis VTCC 31435 bảo quản theo phương pháp cấy truyền ống thạch nghiêng chứa môi trường PDA, nuôi tủ ấm 28oC 72 bảo quản tối đa 30 ngày 4oC trước cấy truyền đợt 2.1.2.2 Xử lý chiếu xạ Chủng T koningiopsis VTCC 31435 nuôi cấy điểm đĩa petri chứa môi trường PDA 28oC Sau ngày, tiến hành gạt toàn số bào tử mọc bề mặt đĩa vào 100 mL dung dịch NaCl 0,9% có bổ sung Tween 80 theo tỷ lệ thể tích 1/99 Dung dịch bào tử pha loãng cho mật độ tế bào khoảng 108-109 CFU/ mL Các ống nghiệm vơ trùng có chứa 10 mL dung NỘI DUNG dịch bào tử T koningiopsis VTCC 31435 đem xử lý chiếu xạ nguồn gamma Co-60 2.1 Đối tượng phương pháp dải liều 0-2500 Gy (3 ống nghiệm lặp lại cho 2.1.1 Vật liệu liều) Liều kế Gammachrome YR sử dụng Chủng Trichoderma koningiopsis VTCC 31435 để đo liều hấp thụ có khả sinh tổng hợp cellulase ngoại bào cao 2.1.2.3 Xác định số lượng bào tử cung cấp Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC), Viện Vi sinh Công nghệ sinh học, Dung dịch bào tử (trước sau chiếu xạ) pha loãng theo dãy thập phân 0,1 mL mẫu Đại học Quốc Gia Hà Nội độ pha loãng thích hợp cấy vào đĩa petri Mơi trường ni cấy vi sinh vật: PDA (Potato chứa môi trường PDA (3 đĩa petri/độ pha loãng) Dextrose Agar) hãng Diffco cung cấp Các hóa Sử dụng que gạt vơ trùng dàn dịch cấy chất: CMC (carboxymethyl cellulose) (Sigma), bề mặt thạch Tiến hành đếm số khuẩn lạc sau 72 Congo Red (Sigma), Agar (Việt Nam)… đảm ni cấy 28oC tính số lượng bào tử (Mi) bảo độ phân tích mL mẫu theo công thức [7]: Số 65 - Tháng 12/2020 35 THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN Mi (CFU/ mL) = Ai x Di/V 2.1.2.4 Sàng lọc đột biến sinh cellulase cao nhiệt độ 50oC 20 phút CMC 60 phút với giấy lọc Lượng đường khử sinh phản ứng với thuốc thử DNS, cường độ màu (màu lục) hợp chất tạo thành sau phản ứng đo máy quang phổ UV-2450 Shimadzu bước sóng 540 nm Khả phân hủy cellulose chủng T koningiopsis xác định định tính phương pháp khuếch tán đĩa thạch PDA có chứa chất CMC chất thị Congo đỏ Một đơn vị hoạt độ enzyme định nghĩa lượng enzyme có khả xúc tác chuyển hóa µmol glucose phút điều kiện thí nghiệm [11] Trong đó: Ai số khuẩn lạc trung bình/đĩa; Di độ pha lỗng V thể tích dịch bào tử cấy vào đĩa (mL) Sau chiếu xạ, dung dịch bào tử T koningiopsis liều khác cấy trải lên mơi trường PDA có bổ sung CMC congo đỏ Đĩa sau cấy ủ 28oC 24 Sau 24 nuôi cấy, nhiệt độ ủ nâng lên 37oC đến ngày nhằm hạn chế lan rộng khuẩn lạc thu vòng phân giải CMC tối đa Khả thủy phân cellulose đánh giá thông qua số HC (Hydrolysis Capacity) theo công thức [10]: Kết thảo luận 3.1 Ảnh hưởng chiếu xạ lên sống sót chủng nấm T koningiopsis VTCC 31435 Tác động xạ gamma tới phát triển chủng T koningiopsis VTCC 31435 xác định thơng qua số khuẩn lạc sống sót sau xử lí chiếu xạ liều từ 100 đến 2500 Gy Hình biểu diễn mối tương quan Logarit số lượng HC = Đường kính vịng phân giải/ Đường kính bào tử nấm sống sót (CFU/ mL) liều xạ Kết khuẩn lạc cho thấy, số lượng bào tử sống sót phụ thuộc Những khuẩn lạc có số HC lớn 10% so vào liều chiếu Số lượng bào tử giảm mạnh với số HC chủng coi khoảng liều từ 100 đến 1200 Gy, liều cao khuẩn lạc đột biến có khả sinh cellulase số lượng bào tử có chênh lệch cao 2.1.2.5 Phương pháp DNS (axit 3,5 dinitrosalicylic) Hoạt độ cellulase chủng Trichoderma sinh q trình ni cấy định lượng theo TCVN 12104:2018 [11] phương pháp DNS Trong nghiên cứu này, đánh giá hai loại hoạt độ enzyme endoglucanase - CMCase (thủy phân chất CMC) hoạt độ enzyme tổng sốFPase (thủy phân giấy lọc Whatman số 1) Xác định hoạt độ thủy phân CMC giấy lọc (Whatman số 1) cách xác định lượng đường Hình Mối tương quan số lượng bào tử T khử tạo thành cho 0,1 mL cellulase tác koningiopsis VTCC 31435 sống sót dịch bào dụng với chất CMC giấy lọc pH 4,8 tử liều xạ 36 Số 65 - Tháng 12/2020 THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN Sau lần chiếu xạ, tính tốn tỉ lệ sống sót chủng T koningiopsis VTCC 31435, chúng tơi nhận thấy số lượng tế bào sống sót cịn khoảng 10% xử lý chiếu xạ dung dịch bào tử khoảng liều 400 Gy Giá trị D10 nghiên cứu Trandafir cộng T viride khoảng từ 450 đến 500 Gy [12] Nghiên cứu ảnh hưởng chiếu xạ gamma tới đặc điểm hình thái tính đối kháng T viride với nấm gây bệnh M phaseona, Baharvand cộng nhận thấy, tỷ lệ sống sót T viride 9,7% liều chiếu 400 Gy nhóm tác giả khơng quan sát nảy mầm bào tử nấm liều 450 Gy [13] Những khác biệt kết nghiên cứu nêu giải thích cho yếu tố chủng giống, giai đoạn sinh trưởng, nhiệt độ, chất mơi trường dạng khí, thành phần hóa học môi trường nuôi cấy… điều kiện sinh lý khả tự sửa chữa tế bào nấm ảnh hưởng đến tồn chúng sau chiếu xạ lulase xuất tất liều chiếu xạ với vòng phân giải CMC bao quanh khuẩn lạc mơi trường sàng lọc có thị Congo đỏ Tuy nhiên, số lượng khuẩn lạc có số HC cao chủng khác liều chiếu xạ Kết Bảng cho thấy khoảng liều chiếu từ 700 đến 1500 Gy thu nhiều khuẩn lạc T koningiopsis có số HC cao có số HC cao vượt trội so với liều xử lý lại Điều thể rõ giá trị HC trung bình, giá trị 2,05; 2,21; 2,17 2,06 tương ứng với liều 700, 1000, 1200 1500 Gy Tại liều chiếu xạ này, thu khuẩn lạc có giá trị HC lớn 2,48; 2,38; 2,41 2,62, giá trị chủng 1,74 So sánh giá trị HC nghiên cứu với nghiên cứu giới, nhận thấy: Damaso cộng đặt ngưỡng cho giá trị HC 1,0 [14], giá trị HC Florencio cộng đề xuất 1,5 [15], giá trị HC 3.2 Ảnh hưởng chiếu xạ tới khả sinh cel- nghiên cứu Sazci cộng lên tới đến 2,5 lulase chủng T koningiopsis VTCC 31435 [16] Như giá trị HC nghiên cứu Các khuẩn lạc đơn kháng xạ lựa chọn tương đồng với nghiên cứu khác ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc cho liều chiếu) để giới đánh giá khả thủy phân cellulose thông qua Tỷ lệ đột biến thường liên quan tới liều chiếu xạ số HC Những khuẩn lạc có số HC lớn [17] Kết cho thấy đột biến sinh cellulase cao 10% so với số HC chủng xuất tất liều xạ, tỷ lệ đột biến dường coi khuẩn lạc kháng xạ có khả cao khoảng liều từ 700 đến 1500 sinh cellulase cao Gy so với liều khảo sát lại Dựa vào đường Bảng Khả thủy phân cellulose cong sống sót phụ thuộc liều chiếu xạ chủng khuẩn lạc T koningiopsis xử lý chiếu xạ liều T koningiopsis VTCC 31435 (Hình 1), chúng tơi nhận thấy đột biến sinh cellulase cao chủng khác thu nhiều số lượng TB sống sau chiếu xạ giảm từ 103 đến 105 lần (3-5 đơn vị Log) so với dạng không chiếu xạ Sau trình sàng lọc này, 05 khuẩn lạc tiềm lựa chọn Giá trị HC 05 khuẩn lạc sau sàng lọc trình bày Bảng 2, vòng phân giải CMC số khuẩn lạc tiềm Kết Bảng cho thấy, khuẩn lạc sinh cel- sau chiếu xạ biểu diễn Hình Số 65 - Tháng 12/2020 37 THƠNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN Bảng Giá trị HC 05 khuẩn lạc T koningiopsis có khả sinh cellulase cao nhờ chiếu xạ Hình Vòng phân giải CMC số khuẩn lạc T koningiopsis sau nuôi cấy 28oC 24 ủ 37oC ngày 3.3 Hoạt độ cellulase khuẩn lạc tiềm Để chọn khuẩn lạc có hoạt tính cellulase cao nhất, 05 khuẩn lạc tiềm có giá trị HC cao (được liệt kê Bảng 2) định lượng hoạt độ CMCase FPase phương pháp DNS Hoạt độ CMCase FPase chủng T koningiopsis VTCC 31435 05 khuẩn lạc tiềm sinh q trình ni cấy biểu diễn Hình Các kết cho thấy 05 khuẩn lạc (tạo khoảng liều chiếu từ 700-1500 Gy) có hoạt độ CMCase FPase cao chủng Hoạt độ CMCase khuẩn lạc tiềm cao chủng 1,51-2,48 lần Trong đó, hoạt độ FPase chúng cao chủng 1,20-1,87 lần Khuẩn lạc VTCCI-1 tạo liều chiếu 1500 Gy có hoạt độ CMCase đạt 2,753 U/ mL, cao chủng gốc tới 2,48 lần hoạt độ FPase đạt 0,365 U/mL, cao chủng gốc 1,87 lần Khuẩn lạc VTCC I-3 tạo liều 700 Gy có hoạt độ CMCase FPase tương ứng 1,987 U/mL 0,284 U/mL, cao chủng 1,78 1,45 lần Kết mà thu tương đồng với với nghiên cứu Florencio cộng đánh giá mối tương gian phương pháp bán định lượng (trên mơi trường PDA có bổ sung thị Congo đỏ) định lượng hoạt độ cellulase (phương pháp DNS) chủng nấm Trichoderma Nhóm nghiên cứu khẳng định hai phương pháp phù hợp để đánh giá sàng lọc chủng VSV có khả sinh cellulase cao [15] Đánh giá tính bền chủng sau chiếu xạ hai chủng VTCC-I-1 VTCC-I-3, nhận thấy hai chủng ổn định sau hệ liên tiếp (4 lần cấy truyền, lần cách 01 tháng) (số liệu khơng trình bày báo cáo này) Hoạt độ CMCase chủng VTCC I-1 VTCC I-3 hệ hệ thứ kiểm tra xác nhận Trung tâm Hóa sinh Cơng nghiệp Mơi trường, Viện Công nghiệp Thực phẩm KẾT LUẬN Tỷ lệ sống sót chủng nấm sợi Trichoderma koningiopsis VTCC 31435 giảm dần theo Hình Hoạt độ CMCase FPase 05 khuẩn tăng dần liều chiếu Liều D10 khoảng 400 Gy lạc T koningiopsis có khả sinh cellulase cao khoảng liều 700-1500 Gy phù hợp để sàng lọc tạo chiếu xạ 38 Số 65 - Tháng 12/2020 THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN chủng sau chiếu xạ có khả sinh cellulase cao Sau chiếu xạ, sàng lọc 05 khuẩn lạc có khả sinh cellulase cao vượt trội, hoạt độ CMCase FPase khuẩn lạc cao chủng tương ứng 1,51-2,48 lần 1,21,87 lần; chủng VTCC-I-1 VTCCI-3 có hoạt tính cellulase ổn định sau hệ Các kết nghiên cứu chứng minh xạ gamma tác nhân hiệu việc nâng cao khả sinh cellulase chủng nấm T koningiopsis Nguyễn Thị Thơm, Hoàng Đăng Sáng, Trần Xuân An, Nguyễn Văn Bính, Trần Băng Diệp Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Gardner K.H., Blackwell J., The structure of native cellulose Biopolymers, 13: 1975-2001, 1974 [2] Jarvis M., 2003, Cellulose stacks up, Nature, 426(6967), pp 611–612, 2003 [3] Gupta P., Samant K., Sahu A., Isolation of cellulose- degrading bacteria and determination of their cellulolytic potential International Journal of Microbiology, 6, pp 1-5, 2012 [4] Bayer E.A., Belaich J.-P., Shoham Y., Lamed R., The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides, Annu Rev Microbiol, 58, pp 521–554,2004 [5] Miklaszewska B., Macko D., Kłosowski G., Mikulski D., Application of semi-quantitative and quantitative methods for the selection of cellulolytic filamentous fungi isolated from pulp mill materials, BioTechnologia, 3, pp 169–178, 2016 [6] Xu, F., Wang, J., Chen, S., Qin, W., Yu, Z., Zhao, H., Xing, X., Li, H, Strain Improvement for enhanced production of cellulose in Trichoderma viride Applied Biochemistry and Microbiology, Vol 47, 1, 2011 [7] Tamada M., Kasai N., and Kaetsu I., Effects of gam- ma-ray irradiation on cellulase secretion of Trichoderma reesei, J Ferment Technol 65(6), pp 703–705, 1987 [8] Shahbazi S., Ispareh K., Karimi M., Askari H., Ebrahimi M A., Gamma and UV radiation induced mutagenesis in Trichoderma reesei to enhance cellulases enzyme activity International Journal of Farming and Allied Sciences (5): 543-554, 2014 [9] El-Zawahry, Y.A., Mostafa, I.Y., Effect of gamma irradiation on the production of cellulase enzyme by some fungal isolates Isotope and Radiation Research, Vol 19, 1, 43-50, 1991 [10] Pratima, G., Kalpana S., Avinash S., Isolation of cellulose-degrading bacteria and determination of their cellulolytic potential International Journal of Microbiology, Vol 2012, Article ID 578925, 2011 [11] TCVN 12104: 2018, Xác định hoạt độ xenlulaza vi sinh vật phân giải xenlulo, 2018 [12] Blakely W.F., Introduction: Chromosome aberration induced by radiation, Lecture of regoninal training course on biological radiation dosimetry, Seoul, Korea, 2007 [13] Trandafir T., Florina L.Z., Mioara A., Mihaele E., Mihai C., Alexandru A., Ovidiu I., oRdica I.S., Radioresistance of biodegradation in estabshing the decontamination dose, ICAMS 2014 – th International Conference on Advanced Materials and Systems, 2012 [14] Damaso M.C.T., Terzi S.D.C, Farias A.X., Oveira A.C.P.D, Fraga M.E, Couri S., Selection of cellulolytic fungi isolated from diverse substrates, Braz Arch Biol Technol, 55(4), pp 513-520, 2012 [15] Florencio C., Couri S., Farinas C.S., Correlation between agar plate screening and sod-state fermentation for the prediction of cellulase production by Trichoderma strains Enzyme Res, pp.1-7, 2012 [16] Sazci A., Radford A., Erenle K., Detection of cellulolytic fungi by using Congo red as an indicator a comparative study with the dinitrosalicylic acid reagent method, Journal of Apped Bacteriology 61, pp 559-562, 1986 [17] Satoh K., Oono Y., Studies on application of ion beam breeding to industrial microorganisms at TIARA, Quantum Beam Sci, 3(2), pp 1-16, 2019 Số 65 - Tháng 12/2020 39 ... mục đích sử dụng xạ gamma tạo dịng Trichoderma biến dị có khả sinh cellulase cao, nghiên cứu bước đầu khảo sát ảnh hưởng xạ gamma tới tỷ lệ sống sót khả sinh cellulase chủng nấm Trichoderma koningiopsis... nhờ tác nhân gamma [8] Trên chất bã mía, chủng Trichoderma viride xử lý chiếu xạ liều 20 krad lần liên tiếp có hoạt tính sinh cellulase tăng 253,5% thay tăng 134,5% xử lý lần liều chiếu [9] Tamada... lọc [7] Để cải thiện khả sinh cellulase Trichoderma nhiều nghiên cứu gây đột biến chủng nấm xạ tia gamma thực Trong nghiên cứu Shahbazi cộng sự, hoạt tính cellulase Trichoderma reesei cải thiện