Fibroin tơ tách từ kén tằm (Bombyx mori), là một loại protein cấu trúc được ứng dụng trong công nghiệp may mặc và y sinh. Tuy nhiên cho đến nay ứng dụng của nó vẫn bị hạn chế do tính tan kém trong nước. Nghiên cứu này nhằm sử dụng công nghệ bức xạ như một biện pháp cải thiện tính tan của fibroin thông qua việc cắt mạch các phân tử protein này. Fibroin tơ được chiếu xạ trong dải liều 01000 kGy và tính tan cũng như một số đặc tính khác của nó đã được nghiên cứu. Ngoài những thay đổi hình thái bề mặt do ảnh hưởng của bức xạ gamma, độ bền kéo và độ dãn dài của sợi tơ giảm rõ rệt khi tăng liều chiếu từ 0 kGy đến 1000 kGy. Độ bền kéo của sợi fibroin tơ ở liều 1000 kGy giảm 71% và độ dãn dài giảm 94% so với mẫu đối chứng. Khả năng hòa tan của fibroin tơ chiếu xạ trong cả hai loại dung dịch calcium chloride (CaCl2C2H5OHH2O=1:2:8 theo tỷ lệ mol) và nước cất đã được cải thiện đáng kể tăng theo sự tăng của liều chiếu xạ.
Trang 1NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA FIBROIN TƠ TẰM
BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ
HOÀNG PHƯƠNG THẢO, TRẦN BĂNG DIỆP, TRẦN MINH QUỲNH,
HOÀNG ĐĂNG SÁNG, PHẠM QUANG HIẾU, NGUYỄN VĂN BÍNH,
PHẠM DUY DƯỠNG, NGUYỄN THÙY HƯƠNG TRANG
Trung tâm chiếu xạ Hà Nội, Minh Khai - Từ Liêm- Hà Nội
Email: hoangthao277244@gmail.com
Tóm tắt: Fibroin tơ tách từ kén tằm (Bombyx mori), là một loại protein cấu trúc được ứng
dụng trong công nghiệp may mặc và y sinh Tuy nhiên cho đến nay ứng dụng của nó vẫn bị hạn chế do tính tan kém trong nước Nghiên cứu này nhằm sử dụng công nghệ bức xạ như một biện pháp cải thiện tính tan của fibroin thông qua việc cắt mạch các phân tử protein này Fibroin tơ được chiếu xạ trong dải liều 0-1000 kGy và tính tan cũng như một số đặc tính khác của nó đã được nghiên cứu Ngoài những thay đổi hình thái bề mặt do ảnh hưởng của bức xạ gamma, độ bền kéo và độ dãn dài của sợi tơ giảm rõ rệt khi tăng liều chiếu từ 0 kGy đến 1000 kGy Độ bền kéo của sợi fibroin tơ ở liều 1000 kGy giảm 71% và độ dãn dài giảm 94% so với mẫu đối chứng Khả năng hòa tan của fibroin tơ chiếu xạ trong cả hai loại dung dịch calcium chloride (CaCl 2 /C 2 H 5 OH/H 2 O=1:2:8 theo tỷ lệ mol) và nước cất đã được cải thiện đáng kể tăng theo sự tăng của liều chiếu xạ
Từ khóa: Tơ tằm, Fibroin, Phân hủy bức xạ, Tính tan
I GIỚI THIỆU
Tơ được định nghĩa là một sợi protein liên tục do ấu trùng một số loại sâu bọ cánh vảy như tằm, nhện, bọ cạp và ve nhả ra từ dạng kén của chúng Loại tiêu biểu nhất là tơ tằm
(Bombyx mori) Tơ tằm là loại sợi protein tự nhiên bền nhất, thậm chí nó bền hơn cả một sợi
thép mảnh có đường kính tương đương [1] Thông thường, sợi tơ tằm bao gồm hai loại protein
tự lắp ráp, fibroin và sericin Fibroin là thành phần chính của sợi tơ (khoảng 75%) đóng vai trò như một lõi Sự khác nhau giữa hai loại protein là ở cấu trúc tinh thể, cấu trúc dạng này chỉ tìm thấy ở fibroin Phần fibroin bao gồm các amino acid (-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-) lặp đi lặp lại dọc theo chuỗi, tạo thành một lượng lớn các vi tinh thể dạng tấm β (β-sheet microcrystallines) [2] Điều này làm tăng tính bền và cứng của sợi tơ
Fibroin tơ tằm được sử dụng làm vật liệu dệt hàng nghìn năm nay do nó là loại sợi tự nhiên tuyệt hảo, bóng, đẹp lại nhẹ và ấm áp khi mặc, …v.v Gần đây fibroin tơ và các peptide của nó đã được nghiên cứu rộng rãi, nhất là cho các ứng dụng trong ngành mỹ phẩm và dược phẩm do có các đặc tính nổi trội như bóng, dẻo, dễ dàn trải và gắn dính, đồng thời với khả năng phân hủy sinh học có thể kiểm soát, có đặc tính cầm máu, không gây độc tế bào, có đặc tính sinh kháng thể thấp và không gây viêm nên vật liệu này đang ngày càng được các nhà khoa học quan tâm
Trên thực tế các sợi fibroin tơ có tính bền cơ học cao do cấu trúc tinh thể, do đó chúng rất khó phân hủy Điều này dẫn tới những hạn chế nhất định trong việc sử dụng fibroin tơ cho các ứng dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm, dược phẩm cũng như y sinh Tơ được xem như loại vật liệu không phân hủy theo định nghĩa trong dược điển Mỹ (USP) [1] Tuy nhiên tơ có thể được tiêu hóa từ từ bởi enzym phân hủy protein và phải mất một thời gian dài để cơ thể có thể
Trang 2hấp thụ nó Hiện có khá nhiều các kết quả về khả năng phân hủy của fibroin tơ được xử lý bởi enzym phân hủy protein [2] Tuy nhiên các nghiên cứu về khả năng này của fibroin tơ bởi các
kỹ thuật khác còn rất hạn chế
Trong những năm gần đây xử lý chiếu xạ protein tơ tằm đã được thực hiện ở một số phòng thí nghiệm chuyên ngành trên thế giới Một vài nghiên cứu cho thấy bức xạ gamma có thể tác động trực tiếp tới cấu trúc của sợi fibroin làm giảm cường lực của nó [4] và liều xạ cao hơn 250 kGy có thể ảnh hưởng trực tiếp tới tính tan của fibroin tơ và tính tan tăng khi liều xạ tăng [3] Một nghiên cứu khác cho rằng chiếu xạ EB có thể giúp tán fibroin tơ thành bột và làm tăng tính tan của bột fibroin tơ do tác động làm phân hủy các amino acide glycine và alanine trong vùng vô định hình của sợi tơ [5] Mặc dù vậy các nghiên cứu xử lý chiếu xạ fibroin vẫn còn mới mẻ ở Việt nam Đề tài này được thực hiện nhằm nghiên cứu tác động của bức xạ gamma tới hình thái, đặc tính cơ lý cũng như tính tan của fibroin tơ tằm Nếu thành công, đề tài này có thể có thể làm tiền đề cho việc mở rộng hướng ứng dụng của công nghệ bức xạ, sử dụng nguồn fibroin tơ tằm rồi rào sẵn có trong nước
II THỰC NGHIỆM
1 Vật liệu
Tơ tằm được mua ở xã Đại Hưng, huyện Mỹ Đức, Hà Nội Các hóa chất tinh khiết như
Na2CO3, HCl, CaCl2, LiBr được mua từ hãng Merck, Đức C2H5OH do Việt nam sản xuất
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Phương pháp loại sericin để thu được fibroin tơ
Tơ tằm thô được loại sericin theo phương pháp của Kim và cộng sự [7] 10g tơ thô (đã loại bỏ mảnh kén và bụi bẩn) được xử lý trong dung dịch sodium carbonate (Na2CO3 ) 5% Hỗn hợp được đun nóng trong ở 100oC, sau 1 giờ hỗn hợp được làm nguội và lọc qua giấy lọc
để loại bỏ sericin hòa tan trong dung dịch Phần thu được sau lọc được rửa kỹ vài lần bằng nước nóng để loại bỏ hoàn toàn sericin và sodium carbonate còn sót Fibroin tơ sạch thu được đem sấy chân không ở 50oC cho tới khi đạt trọng lượng không đổi
2.2 Phương pháp xử lý chiếu xạ
Fibroin tơ được xử lý chiếu xạ dải liều 50 - 1000 kGy trên nguồn Co-60 tại trung tâm chiếu xạ Hà Nội hoặc nguồn Co-60 tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt
2.3 Phương pháp đánh giá độ bền cơ lý
Độ bền kéo và độ dãn dàicủa các mẫu tơ tằm được xác định trên thiết bị kiểm tra vật liệu polymer Lloyd Instrument (Anh) của Trung tâm Nghiên cứu Vật liệu Polyme (Đại học Bách Khoa Hà Nội) Phép đo được thực hiện theo ASTM D1294-2005 [2]
2.4 Phương pháp chụp ảnh SEM
Sự thay đổi hình thái của các mẫu fibroin tơ đã xử lý chiếu xạ được phát hiện qua ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử quét môi trường (Environmental Scanning Electron Microscope) FEI Quanta 200 của Viện Vật lý Kỹ thuật (Đại học Bách Khoa Hà Nội)
2.5 Phương pháp đánh giá tính tan của fibroin tơ tằm
Hai loại dung dịch được sử dụng để kiểm tra tính tan của fibroin tơ đã xử lý chiếu xạ là nước cất và dung dịch CaCl2:C2H5OH:H2O=1:2:8 theo tỷ lệ mol
Cân 0,1g fibroin tơ (mẫu chưa chiếu xạ và đã xử lý chiếu xạ ở các liều khác nhau) ngâm trong 10 ml nước cất Các mẫu được ngâm trong nước cất ở nhiệt độ phòng (250C) hoặc đặt
Trang 3trong bể ổn nhiệt ở 100oC Sau 1 giờ, các mẫu được đem ly tâm 15 phút ở 9000 vòng/phút Sau ly tâm phần dung dịch được loại bỏ, còn phần fibroin ướt đem sấy khô ở 105oC đến trọng lượng không đổi Cân lại các mẫu đã sấy khô và tính phần trọng lượng mẫu đã hòa tan Tính tan của fibroin chiếu xạ trong dung dịch calcium chloride (CaCl2/C2H5OH/H2O=1:2:8 theo tỷ lệ mol) được đánh giá bằng thời gian hoà tan hoàn toàn của fibroin khi hoà tan 50mg fibroin trong 2ml dung dịch calcium chloride ở nhiệt độ 100oC
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Ảnh hưởng của bức xạ gamma tới hình thái bên ngoài fibroin tơ
Màu sắc và độ bóng của sợi tơ thô cũng như các mẫu fibroin tơ bị ảnh hưởng đáng kể bởi xử lý chiếu xạ (hình1) Màu vàng tự nhiên và độ bóng đều giảm ở các mẫu chiếu xạ so với mẫu đối chứng Liều chiếu xạ càng cao, sự mất màu càng rõ rệt Độ bóng của các mẫu cũng giảm đáng kể khi liều xạ tăng Mùi hương của fibroin tơ cũng có sự thay đổi, mùi hương tự nhiên giảm đi và các mẫu fibroin tơ chiếu xạ có mùi nồng rõ hơn khi liều chiếu xạ tăng lên
Hình 1 Các mẫu tơ thô và fibroin tơ được xử lý chiếu xạ dải liều 0-1000 kGy
2 Ảnh hưởng của bức xạ gamma tới tính chất cơ lý
Hình 2 và hình 3 cho thấy độ bền kéo và độ dãn dài của sợi fibroin tơ giảm khi liều chiếu xạ tăng Khi liều chiếu xạ tăng lên 500 kGy, độ bền kéo và độ dãn dài giảm đi 69,5% và 83,17% Độ bền kéo và độ dãn dài của sợi firoin tơ ở liều 1000 kGy giảm tới 71% và 94% so với mẫu đối chứng
Nhiều nghiên cứu cũng cho kết quả tương tự khi xử lý chiếu xạ fibroin tơ Nhóm tác giả Trung Quốc khi xử lý chiếu xạ fibroin tơ trong dải liều từ 0-3000 kGy trên nguồn Co-60 cũng nhận thấy độ bền kéo và độ dãn dài của sợi tơ giảm với việc tăng cường độ bức xạ [11] Khi liều chiếu xạ lên đến 500 kGy, độ bền kéo và độ dãn dài giảm tương ứng là 58% và 40% và ở liều chiếu xạ 3000 kGy thì giá trị của hai đại lượng này gần như bằng không Họ cho rằng bức
xạ gamma đã làm yếu liên kết peptide, liên kết nội phân tử và sự định hướng phân tử trong chuỗi peptide fibroin [11]
Trang 4
Hình 2 Độ bền kéo của fibroin chiếu xạ Hình 3 Độ dãn dài của sợi fibroin chiếu xạ
Một nghiên cứu khác cho thấy cường lực của fibroin chiếu xạ giảm khi tăng liều chiếu Cường lực của sợi fibroin chiếu xạ liều 1500 kGy khi có mặt oxygen giảm còn 13% so với cường lực của sợi fiboin tự nhiên, và cùng liều chiếu này trong điều kiện chân không giá trị này là 25% Cường lực của sợi fibroin chiếu xạ ở liều cao hơn 2000 kGy trong oxygen không xác định được có thể do sự phân hủy quá nặng [9]
Từ các kết quả thu được chúng tôi cho rằng việc tăng liều chiếu xạ sẽ làm tăng tính tan của fibroin tơ tằm
3 Ảnh hưởng của bức xạ gamma tới cấu trúc
Ảnh hưởng của bức xạ gamma tới cấu trúc bề mặt của fibroin tơ được phát hiện bằng
phương pháp chụp hiển vi điện tử quét (SEM) Ảnh SEM trong hình 4 cho thấy sự thay đổi rõ
rệt về mặt hình thái của sợi tơ, các vết xước sự đứt gẫy sợi fibroin tơ tăng lên cùng với độ mạnh của bức xạ Từ đó cho thấy fibroin tơ tằm bị biến đổi về mặt cấu trúc
Hình 4 Ảnh SEM của sợi fibroin xử lý chiếu xạ (độ phóng đại 4000 lần): 0 kGy (a), 100 kGy (b),
200 kGy (c), 500 kGy (d), 750 kGy (e), và 1000 kGy (f)
0 5 10 15 20 25 30
0 100 2 00 3 00 4 00 500 60 0 70 0 8 00 9 00 10 00 1100
Liều chiếu xạ (kGy)
0
50
10 0
150
2 0 0
250
0 10 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 50 0 60 0 70 0 8 0 0 9 0 0 10 0 0 110 0
Liều chiếu xạ (kGy)
a
Trang 54 Ảnh hưởng của bức xạ gamma tới tính tan của fibroin tơ tằm
Hình 5 Ảnh hưởng của bức xạ tới khả
năng hoà tan của fibroin tơ trong
dung dịch calcium chloride
Hình 6 Ảnh hưởng của bức xạ tới khả năng hòa tan của fibroin tơ trong nước ở điều kiện nhiệt độ phòng và ở 100 o C ( ■
nhiệt độ phòng/1giờ; ♦100 o C/1giờ)
Vì fibroin tơ hoàn toàn không tan trong nước nên các phương pháp xử lý hóa học phức tạp đã được sử dụng để hoà tan chúng Một số phương pháp thường sử dụng đó là hòa tan fibroin tơ trong dung dịch acid; trong một số loại dung môi đặc biệt như dung dịch các muối kim loại kiềm và kiềm thổ như LiCl, LiBr, NaI, các dung dịch chloride, nitrate hoặc thiocyanate của Ca, Mg, Zn sau đó trung hòa và thẩm tách để thu được fibroin hòa tan [10] Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát việc sử dụng kỹ thuật phân hủy bức xạ như một cách để hòa tan fibroin Khả năng hoà tan của fibroin tơ chiếu xạ trong nước và trong dung dịch calcium chloride (CaCl2/C2H5OH/ H2O=1:2:8 theo tỉ lệ mol) đã được khảo sát Khả năng hòa tan của fibroin tơ chiếu xạ trong dung dich muối calcium chloride được biểu diễn trong hình 5 Kết quả cho thấy thời gian để fibroin tơ tan hoàn toàn trong dung dịch muối giảm đáng kể nhờ xử lý chiếu xạ Fibroin được xử lý chiếu xạ 1000 kGy tan hoàn toàn trong dung dịch CaCl2 sau 3,2 phút trong khi với cùng điều kiện fibroin chưa xử lý cần 14 phút để tan hoàn toàn Xu hướng này phù hợp với dự đoán của chúng tôi khi nghiên cứu tác động của bức xạ tới độ bền kéo của fibroin tơ trong hình 2
Khả năng hòa tan của fibroin trong nước ở điều kiện nhiệt độ phòng và ở 100oC được trình bày trong hình 6 Mặc dù đặc tính cơ bản của fibroin tơ là hoàn toàn không tan trong nước nhưng trong cả hai điều kiện thí nghiệm khối lượng tan của fibroin tơ đều tăng và phụ thuộc vào liều chiếu xạ Hình 6 cho thấy fibroin được xử lý chiếu xạ ở liều 500 kGy sau 1 giờ tan trong nước nóng 13,21% và 12,78% ở điều kiện nhiệt độ phòng Khối lượng tan của fibroin tơ trong nước nóng sau 1 giờ là 22% và tỷ lệ này là 19,78% ở điều kiện nhiệt độ phòng khi liều chiếu xạ tăng tới 1000 kGy
Kết quả tương tự cũng được một nhóm nghiên cứu chỉ ra khi chiếu xạ fibroin tơ trên thiết bị gia tốc chùm điện tử [9] Tính tan của fibroin trong nước tăng lên khi liều xử lý chiếu
xạ tăng Xử lý chiếu xạ khi có mặt oxy có khả năng làm tăng tính tan của fibroin tơ tốt hơn xử
lý chiếu xạ trong chân không Khối lượng hòa tan của fibroin tơ tăng tới 43% trong nước nóng khi liều chiếu xạ cao tới 2500 kGy
Một nhóm tác giả khác khi xử lý chiếu xạ sợi fibroin tơ trên thiết bị gia tốc EB trong khoảng liều từ 250 đến 1000 kGy nhận thấy sợi fibroin tơ chưa chiếu xạ không nghiền hết
0
2
4
6
8
10
12
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 100
0
Liều chiếu (kGy)
0 5 10 15 20 25
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 100
0 Liều chiếu (kGy)
Trang 6được hoàn toàn, nhưng liều chiếu xạ tăng thì hiệu suất chuyển từ dạng sợi sang dạng bột cũng tăng Hiệu suất chuyển đổi của sợi fibroin tơ đã xử lý liều 1000 kGy khi có mặt oxy là 94% Bột fibroin tơ hòa tan đáng kể, khoảng 57% trong nước ở nhiệt độ phòng [6]
Khi nghiên cứu khả năng hòa tan của màng fibroin tơ chiếu xạ bằng cách ngâm chúng trong nước cất và kiểm soát thời gian tan của mẫu, nhóm tác giả Đại học Mahidol-Thái Lan nhận thấy các màng fibroin được chiếu xạ liều cao tan dễ dàng trong nước hơn so với các màng được chiếu xạ liều thấp Họ cho rằng chiếu xạ gamma có thể làm biến đổi cấu trúc bậc hai của sự xắp xếp chuỗi polypeptide do làm gẫy các liên kết ngang hydrogen liên kết giữa các chuỗi polypeptide Sự biến đổi trong cấu trúc bậc hai (cấu trúc tấm beta thành cấu trúc cuộn ngẫu nhiên) của fibroin tơ chiếu xạ xảy ra do sự thủy phân của các liên kết ngang polypeptide [8]
IV KẾT LUẬN
Như vậy xử lý chiếu xạ đã cắt mạch làm thay đổi hình thái, đặc tính cơ lý cũng như cấu trúc của các đại phân tử protein để tạo ra fibroin tơ có khả năng phân hủy cao hơn và tính tan trong nước cũng như một số loại dung môi tốt hơn so với fibroin tự nhiên Chúng tôi hy vọng trong thời gian tới việc tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học của fibroin tơ như hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính kháng khuẩn sẽ tạo ra các fibroin dễ phân hủy và có hoạt tính sinh học được cải thiện bằng kỹ thuật chiếu xạ để sử dụng làm nguyên liệu cho ngành mỹ phẩm và dược phẩm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Altman, G H., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R L , Chen, J., Lu, H., Richmond., kaplan, D.L “Silk-based biomaterials” Biomaterials, 2003, 24, 401- 416
[2] ASTM D 1294-2005: Test method for tensile strength and breaking tenacity of wool fiber bundles 1 in
[3] Danlin, S.B and Kumar, S.N “Bio-medical uses of silk and its derivatives” Indian Silk 2007,
45(9), 5-8
[4] Greenwald, D.; Shumway, S.; Albear, P.; Gottlieb, L “Mechanical comparison of 10 suture
materials before and after in vivo incubation” J Surg Res 1994, 56, 372-377
[5] Heslot, H “Arfificial fibrous proteins: A review” Biochimic 1998, 80, 9-13
[6] Ishida, K.; Takeshita, H.; Kamiishi, Y.; yoshi, F.; Kume, T “Radiation degradation of silk”
Jaeri-conf 2001, 005, 130-138
[7] Kim U., Park J., Li Ch., Jin H., Valluzzi R and Kaplan D L “Structure and Properties of Silk
Hydrogels” Biomacromolecules 2004, 5, 786-792
[8] Kojthung, A.; Meesilpa, P.; Sudatis, B.; Treeratanapiboon, L.; Udomsangpetch, R.; Oonkhanond, B “Effects of gamma radiation on biodegradation of Bombyx morii silk fibroin”
Int biodeter Biodegr 2008, 62, 487-490
[9] Pewlong, W., Sudatis, B., Takeshita, H., Yoshii, F., Kume, T “Radiation degradation of silk
protein” In: Proceedings of JAERI Conference 2000-2003, Takasaki, Japan, pp 146-152
[10] Ramesh, S.; Kumar, C.S.; Seshagiri, S.V.; Bashha, K.I.; Lakshmi, H.; Rao, C.G.P
Chandrashekaraiah “Silk filament its phamaceutical applications” Indian silk 2005, 44(2),
15-19
[11] Yao, W.; Liu, Z.; Yi, H.; Wang, J “Structure and mechanical property of silk fiber under
gamma radiation”.Trans tech publications 2011, 85, 175-176
Trang 7RADIATION DEGRADATION OF SILK FIBROIN
HOANG PHUONG THAO, TRAN BANG DIEP, TRAN MINH QUYNH, HOANG DANG SANG, PHAM QUANG HIEU, NGUYEN VAN BINH, PHAM DUY DUONG, NGUYEN THUY HUONG TRANG
Trung tâm chiếu xạ Hà Nội, Minh Khai - Từ Liêm- Hà Nội
Email: hoangthao277244@gmail.com
Abstract: Silk fibroin a kind of protein created by silkworm Bombyx mori in products of
silk was irradiated using Co-60 gamma source and its degradability and solubility were investigated with various radiation doses to apply in pharmacy and cosmetic Addition to the morphological changes of irradiated fibroin fibers, its mechanical property were much influenced by irradiation Tensile strength and elongation at break of silk fibroin significantly decreased with increasing of radiation dose to1000 kGy The tensile strength and elongation at break of irradiated fibroin at 1000 kGy reduced to 71% and 94% respectively in compared with non-irradiated one The solubility of silk fibroin in both calcium chloride (CaCl 2 /C 2 H 5 OH/H 2 O=1:2:8) in mole ratio and distilled water were improved by irradiation
Keywords: Silk, Fibroin, Radiation Degradation, Dissolution