Bài viết tiến hành phân lập và chuyển gien điều khiển chịu hạn Mtosdreb2A và giống lúa chành trụi thông qua Agrobacterium. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
31(2): 79-88 Tạp chí Sinh học 6-2009 Phân lập chuyển gien điều khiển chịu hạn MtOsDREB2A vào giống lúa Chành trụi thông qua Agrobacterium Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Xuân Hội Viện Di truyền Nông nghiệp nớc ta nay, hạn hán đ nguyên nhân làm giảm suất trồng; chí có nơi, có vụ, tợng hạn hán gây thất thu, làm sản lợng nông nghiệp không ổn định, gây ảnh hởng đến an ninh lơng thực quốc gia Vấn đề trở nên xúc hầu hết đất canh tác bị hạn nặng lại tập trung vùng đất khó canh tác, vùng sâu, vùng xa nơi mà sống ngời nông dân chủ yếu dựa vào sản phẩm nông nghiệp Vì vậy, việc tạo giống trồng có tính kháng hạn cao có ý nghĩa đặc biệt quan trọng góp phần tăng ổn định suất, xóa đói giảm nghèo, ổn định x hội, tăng dân trí vị quốc gia Hàng loạt nghiên cứu chuyển gien đáp ứng stress hạn vào trồng nhằm tăng cờng tính kháng hạn thực vật đ đợc tiến hành năm vừa qua, kết đ tạo chuyển gien tăng cờng tính chống chịu với điều kiện hạn [2, 12, 14] Tuy nhiên, tính trạng chịu hạn tính trạng đa gien, nhiều gien chức tham gia trực tiếp đáp ứng điều kiện hạn gien điều khiển tính chịu hạn Vì vậy, việc chuyển hàng loạt gien chức nhằm tạo trồng biến đổi gien tăng cờng khả chịu hạn nhiệm vụ bất khả thi Các gien m hóa prôtêin điều khiển trình phiên m tham gia vào tính kháng hạn bám vào trật tự ADN đặc hiệu (cis-acting element) đoạn điều khiển gien (promoter) gien chức tham gia điều khiển tính chịu hạn với enzim sinh tổng hợp ARN (RNA polymerase) thực trình phiên m gien chức Các nghiên cứu promoter đ phát nhiều gien chức tham gia điều khiển tính chịu hạn chứa trật tự ADN đặc hiệu Vì vậy, gien điều khiển biểu sinh prôtêin bám vào trật tự ADN đặc hiệu prômôtơ nhiều gien chức tham gia điều khiển tính chịu hạn hoạt hoá biểu gien này, kết thực vật tăng cờng tính chịu hạn Điều giải thích tính trạng chịu hạn tính trạng đa gien nhng cần chuyển gien điều khiển tính chịu hạn làm tăng sức chống hạn chuyển gien Các nghiên cứu hệ gien ® ®−a kÕt ln gien ®iỊu khiĨn chiÕm - 9% tổng số gien hệ gien, ví dụ Arabidopsis có 2.057 gien điều khiển đợc phát tổng số 26.000 gien hệ gien [9] Rất nhiều nghiên cứu đặc tính gien điều khiển mô hình Arabidopsis lúa đ chứng minh nhóm gien đóng vai trò đặc biệt quan trọng việc tăng cờng tính chịu hạn thực vật Vì vậy, việc phân lập nghiên cứu đặc tính gien điều khiển trở thành vấn đề thời mang tính toàn cầu, thu hút quan tâm nhiều phòng thí nghiệm giới Gien m hóa nhân tố khởi đầu phiên m DREB2 tơng tác với trật tự ADN đặc hiệu DRE vùng khởi động gien gien chức sinh điều kiện hạn hoạt hoá biểu gien DREB2 đợc phát Arabidopsis vào năm 1998 Hai gien DREB2A DREB2B biểu điều kiện hạn mặn Tuy nhiên biểu gien DREB2A DREB2B chuyển gien không hoạt hoá biểu gien chức liên quan đến chịu hạn điều kiện sinh trởng bình thờng kết chuyển gien tính chịu hạn Điều đợc lý giải nhóm gien cần trình sửa đổi sau phiên m , ví dụ nh qua trình phosphoryl hóa (phosphorylation) để chuyển prôtêin sang dạng hoạt hoá [4] Gien DREB2A đợc thay đổi cấu trúc việc loại bỏ 30 axit amin tơng øng víi trËt tù tõ 136 ®Õn 79 165 ®Ĩ tạo dạng DREB2ACA Kết quả, biểu gien DREB2ACA giúp chuyển gien Arabidopsis tăng cờng đáng kể tính chịu hạn Các phân tích sử dụng kỹ thuật Microarray Northern blot đ chứng minh biểu gien DREB2ACA chuyển gien hoạt hoá biểu nhiều gien chức tham gia vào tính chịu hạn thực vật [7, 8] Do tính quan trọng vấn đề chịu hạn thực vật, hàng loạt nghiên cứu tập trung việc phân lập nghiên cứu đặc tính nhóm gien DREB2 điều khiển tính chịu hạn đối tợng thực vật khác lúa, gien OsDREB2A đợc phân lập công bố vào năm 2003 OsDREB2A biểu điều kiện hạn mặn biểu OsDREB2A tăng cờng tính chịu hạn mặn Arabidopsis chuyển gien [3] lúa mì, gien DREB2 đợc phân lập phát biểu mạnh điều kiện lạnh, mặn hạn [10, 11] lúa mạch, gien DREB2 có tên HvDRF1 đợc công bố tích luỹ điều kiện hạn, mặn tham gia trực tiếp vào điều hoà ABA [13] Ngoài Arabidopsis, gien ZmDREB2A đ đợc phân lập nghiên cứu đặc tính chi tiết ngô Không giống nh Arabidopsis (DREB2A), gien ZmDREB2A tạo hai dạng transcript qua phân tích Real-time PCR có dạng transcript hoạt tính sinh đáng kể điều kiện hạn Ngoài ra, qua thí nghiệm phân tích hoạt hoá phiên m (transactivation assay) tế bào trần Arabidopsis ZmDREB2A có khả hoạt hoá trình phiên m (transactivation activity) mạnh nhiều DREB2A Vì vậy, trình sửa đổi sau dịch m không cần thiết việc tạo prôtêin hoạt tính trờng hợp gien ZmDREB2A Sự biểu liên tục gien ZmDREB2A làm tăng cờng tính chịu hạn rõ rệt chuyển gien Kết cho thấy có khác chế điều khiển tính chịu hạn nhóm gien mô hình hai mầm mầm [6] Trong nghiên cứu này, đ tiến hành phân lập gien MtOsDREB2A từ th viện xư lý h¹n cđa gièng lóa Méc tun, thiÕt kÕ vector chun gien b»ng kü tht gateway vµ chun vector biĨu hiƯn mang gien MtOsDREB2A vµo gièng lóa Chµnh trơi th«ng qua kü tht chun gien sư dơng vi khn Agrobacterium 80 I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Vật liệu Ngn th− viƯn cADN xư lý h¹n: Th− viƯn cADN xử lý hạn giống lúa Mộc tuyền đợc sinh tổng hợp Trung tâm Công nghệ Sinh học Kü thuËt gien Quèc tÕ (ICGEB), New Delhi, Ên §é Nguồn thực vật nhận gien: Giống lúa Chành trụi đợc cung cấp Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, đ đợc khảo sát khả tạo callus (91%) tái sinh (> 80) [1] Các kít vector: Vector nhân dòng pUC19-Ubi vector nhận pBCKH đợc cung cấp nhóm nghiên cứu GS Shinozaki (Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trung tâm Quốc tế Khoa học Nông nghiệp NhËt B¶n, JIRCAS) Bé kit Gateway# LR Clonase# II enzim mix để thực phản ứng Gateway mua h ng Invitrogen C¸c chđng vi khn: Chđng vi khn E.coli DH5 chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 đợc cung cấp Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di trun N«ng nghiƯp, ViƯn Khoa häc N«ng nghiƯp ViƯt Nam Các trật tự mồi PCR hóa chất: Các trật tự mồi PCR đặc hiệu nhân dòng gien MtOsDREB2A kiĨm tra sù tån t¹i cđa cđa gien MtOsDREB2A vector vi khuẩn đợc mua h ng Sigma Hóa chất sử dụng nuôi cấy mô sinh học phân tử đợc mua h ng Merk, Sigma Invitrogen Phơng pháp Nhân dòng gien MtOsDREB2A tõ th− viƯn cADN xư lý h¹n gièng lóa Mộc tuyền: Dựa trình tự gien DREB2A đợc công bố Gene Bank giống lúa Japonica Pokali lựa chọn 20 nucleotide hai đầu 5, vùng ORF gien DREB2A trật tù nhËn biÕt cđa enzim BamH I ®Ĩ thiÕt kÕ trật tự mồi đặc hiệu nh sau: OsDREB2A-F: 5ATGGATCCATGGAGCGGGGGGAGGGGA 3OH; OsDREB2A-R: 5-ATCCTAGGCTAAT AGGAGAAAAGGCTA-3OH Phản ứng PCR đợc thực với nång ®é måi 10 pmol, dNTPs 0,2 mM, Taq polymerase 2,5 U với chu kỳ nhiệt: khởi đầu 94oC phót, 30 chu kú tiÕp theo (94oC - 45 gi©y, 55oC - 45 gi©y, 72oC - 60 gi©y), kÐo dài phút 72oC Sản phẩm phản ứng PCR đợc kiểm tra gel Agarose 1%, tiến hành gel b»ng cét GeneluteTM Minus EtBr (Sigma Cat G-2166) S¶n phẩm PCR tiếp đợc xử lý với enzim giới hạn BamH I gắn vào vector nhân dòng pUC19-Ubi đ xử lý BamH I loại gốc phosphate trớc để tạo vector nhân dòng mang gien MtOsDREB2A đồng thời vector cho phản ứng clonase Sự tồn gien MtOsDREB2A xuôi chiều vector nhân dòng pUC19-Ubi đợc kiểm tra cặp mồi Ubi-F: 5-CCCTGCCTTCAT ACGCTATT-3OH OsDREB2A-R, với sản phẩm ớc đoán khoảng 900-bp Gien sau đợc đọc trình tự hệ thống ABI 3100, kết giải trình tự đợc so sánh với sở liệu Gene Bank phân tÝch b»ng phÇn mỊm Genetyx 6.0 ThiÕt kÕ vetor chun gien mang gien MtOsDREB2A b»ng kü thuËt Gateway: Kü thuËt Gateway (Invitrogen) đợc sử dụng để tạo vector chuyển gien thực vật (binary vector) với thành phần phản ứng (5 àl) đợc thiết lập nh sau: àl đệm LR clonase, 50 ng vector cho (pUC19-Ubi-MtOsDREB2A), 10 ng vector nhËn (pBCKH), 2,5 àl đệm TE 0,5 àl enzim Clonaza Phản ứng đợc tiến hành 25oC, sau bổ sung proteinaza K để loại bỏ prôtêin Sản phẩm phản ứng đợc biến nạp vào tế bào E.coli DH5 khả biến đ chuẩn bị Tiến hành sàng lọc vi khuẩn mang vector chuyển gien môi trờng LB chứa 50 àg/ml kanamycin, tồn xuôi chiều gien MtOsDREB2A vector chuyển gien đợc kiểm tra phản ứng PCR với mồi đặc hiệu GW-F: 5-CAGCTATGACCATGATTACGC3OH OsDREB2A-R, với sản phẩm theo tính toán có kÝch th−íc xÊp xØ 2,9 kb Vector chun gien sau đợc biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens EHA105 phơng pháp xung điện sử dụng máy ECM 630 (BTX) với thông số nh sau: điện dung 25 µF, ®iƯn thÕ 2,4 KV, ®iƯn trë 200 µ thời gian giây Sự tồn gien MtOsDREB2A vi khuẩn A tumefaciens EHA105 đợc kiểm tra lại phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu OsDREB2A-F/R Chun cÊu tróc mang gien MtOsDREB2A vµo lóa Chµnh trơi: Các callus tốt (có màu vàng, khô, đờng kính 1-3 mm) lúa Chành trụi - đợc tạo m«i tr−êng MS cã bỉ sung 1,5 mg/l 2,4D 10 ngày, 28oC tối - đợc gom lại trải lên môi trờng MS có ngăn giấy lọc nuôi 280C ngày trớc tiến hành chuyển gien Một khuẩn lạc A tumefaciens mang gien MtOsDREB2A đợc nuôi lắc 200 vòng/phút 28oC qua đêm 5ml môi trờng YEM lỏng có bổ sung 50 mg/l kanamycin Dung dịch vi khuẩn sau đợc pha lo ng với 30 ml môi trờng AAM [3], bổ sung acetosyringone nồng độ 30 àg/ml Các callus đ lựa chọn đợc chuyển lên lới đ khử trùng đợc ngâm dung dịch huyền phù vi khuẩn 90 giây, lắc nhẹ Các callus sau đợc làm khô chuyển lên môi trờng đồng nuôi cấy MS-AS (môi tr−êng MS cã bæ sung 15 mg/l acetosyringone, 300 mg/l cazein, mg/l 2,4D, 10 g/l glucose vµ 30 g/l sucrose) có ngăn giấy lọc, giữ tối 28oC ngày Các callus sau đợc tiến hành loại bỏ vi khuẩn d thừa bề mặt cách rửa nhiều lần với dung dịch nớc cÊt khư trïng cã bỉ sung 500 mg/l cabernicillin Chun callus sang môi trờng chọn lọc MS-S (môi trờng MS cã bæ sung 300 mg/l cazein, mg/l 2,4D, 30 g/l sucrose 50 mg/l hygromycin), nuôi tối tuần 280C (lặp lại lần) Các callus sinh trởng môi trờng MS-S sau đợc chuyển sang môi trờng tái sinh MS-R (môi trờng MS có bỉ sung 15 ml/l n−íc dõa vµ 50 mg/l hygromycin), nuôi điều kiện 25oC, độ ẩm 50-70%, quang chu kỳ 16 giờ/ngày, cờng độ sáng 3000 Lux Sau tuần, cụm chồi sinh trởng tốt đợc tách tiến hành cho rễ môi trờng MS/2 (nồng độ muối khoáng giảm 1/2) Khi lúa T0 có hệ rễ phát triển tốt đạt chiều cao khoảng 7-10 cm đợc đa môi trờng làm quen trớc cấy chậu thí nghiệm Các lúa chuyển gien T0 sau đợc kiĨm tra sù tån t¹i cđa gien MtOsDREB2A hƯ gien b»ng c¸ch t¸ch chiÕt ADN tõ l¸ lóa theo phơng pháp CTAB có cải tiến để thu ADN tổng số cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Ubi-F Nos-TR: 5-AGACCGGCAACAGGATTCAA3OH, sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% có kích thớc dự đoán khoảng 1,2 kb 81 II KếT QUả Và THảO LUậN Ph©n lËp gien MtOsDREB2A tõ th− viƯn cADN xư lý hạn giống lúa Mộc tuyền: Kết điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gien MtOsDREB2A từ th viƯn cADN xư lý h¹n cđa gièng lóa Méc tun (hình 1A) cho thấy sản phẩm khuếch đại rõ nét cã kÝch th−íc xÊp xØ 825-bp KÝch th−íc 825-bp lµ kích thớc đ đợc dự đoán tơng ứng với khung đọc mở gien DREB2A đ đợc phát lúa Japonica Pokali [6] Sản phẩm khuếch đại mang hai vị trí nhận biết enzim BamH I hai đầu phía khung đọc mở gien MtOsDREB2A Sản phẩm khuếch đại sau đợc gắn vào vector nhân dòng pUC19-Ubi nhờ vị trí nhận biết Vector nhân dòng pUC19-Ubi đợc thiết kế dựa cấu trúc vector pUC19 có gắn thêm promoter Ubiquitine vµ enhancer Ω tr−íc vïng MCS cho phÐp điều hòa biểu gien lạ đợc chèn vị trÝ MCS ë thùc vËt Sau s¶n phÈm khuÕch đại gien MtOsDREB2A đợc gắn vào vector nhân dòng pUC19-Ubi đ thu đợc vector pUC19-Ubi-MtOsDREB2A vừa vector nhân dòng cho gien vừa vector cho phản ứng clonase sử dụng kỹ thuật gateway để tạo vector chuyển gien thực vật (hình 1B) Vector cho pUC19-Ubi-MtOsDREB2A sau đợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5 tiến hành sàng lọc môi trờng LB có bổ sung ampicillin nhờ gien kháng ampicillin vector cho (hình 1B) Hình Kết quả phân lập gien MtOsDREB2A vector nhân dòng pUC19-Ubi A Kết khuếch đại gien OsDREB2A từ th viện xử lý hạn lóa Méc tun: M- thang ADN chn kb (Invitrogen); giếng 1-4 sản phẩm nhân gien từ th viện với cặp mồi đặc hiệu OsDREB2A-F/R; B Sơ đồ tách dòng gien MtOsDREB2A vector nhân dòng pUC19-Ubi C Kết kiểm tra chiều gắn gien MtOsDREB2A vector nhân dßng pUC19-Ubi: M- thang ADN chuÈn 1kb (Invitrogen); GiÕng 1, cho kết gien MtOsDREB2A gắn ngợc chiều (âm tính); Giếng 2, 4, 5, có băng điện di kích thớc xấp xỉ 900-bp tơng ứng với khuẩn lạc mang gien MtOsDREB2A gắn xuôi chiều vector pUC19-Ubi Tuy nhiên, phản ứng tách dòng sử dụng vị trí enzim giới hạn BamH I nên hoàn toàn xảy trờng hợp 82 gien MtOsDREB2A bị gắn ngợc chiều vector pUC19-Ubi Để loại bỏ trờng hợp tiến hành phản ứng PCR với khuẩn lạc đợc chọn lọc môi trờng LB có bổ sung ampicillin Kết điện di sản phẩm PCR hình 1C cho thấy số khuẩn lạc đợc chọn để kiểm tra gắn xuôi chiều gien MtOsDREB2A vector nhân dòng có khuẩn lạc (khuẩn lạc số 2, 4, 5, 8) cho kết dơng tính băng ADN có kích thớc xấp xỉ 900-bp Các khuẩn lạc số 1, không cho sản phẩm khuếch đại khuẩn lạc mang vector trống khuẩn lạc có mang gien MtOsDREB2A nhng bị gắn ngợc chiều Sản phẩm khuếch đại cho kích thớc 900-bp khuẩn lạc số 2, 4, 5, đ lựa chọn mồi xuôi Ubi-F đợc thiết kế để bắt cặp với vùng cuối promoter Ubiquitine mồi ngợc đợc lựa chọn là mồi ngợc đặc hiệu gien MtOsDREB2A Nếu gien đợc gắn chiều sản phẩm khuếch đại ph¶n øng PCR sÏ ph¶i cã kÝch th−íc kho¶ng 900-bp bao gåm kÝch th−íc cđa gien MtOsDREB2A, kÝch th−íc vùng enhancer kích thớc mồi Ubi-F Ngợc lại, gien đợc gắn ngợc chiều phản ứng PCR không cho sản phẩm khuếch đại với kích thớc khoảng 900-bp Hình Kết so sánh trình tù gien MtOsDREB2A víi mét sè gien nhãm DREB2A phần mềm Blast (A)và Genetyx 6.0 (B) Khuẩn lạc số cho kết khuếch đại tốt đ đợc lựa chọn để tiến hành nuôi cấy, tách plasmid với khối lợng lớn để giải trình tự gien MtOsDREB2A đồng thời 83 làm nguyên liệu cho ph¶n øng clonase ë b−íc tiÕp theo KÕt qu¶ gi¶i trình tự hệ thống ABI 3100 (dữ liệu không trình bày) cho thấy gien đ phân lập có kích thớc xác 825-bp Tiến hành so sánh với trình tự gien có sẵn Gene Bank phần mềm Blast (hình 2A), nhận thấy gien đ phân lập từ th viện cADN xư lý h¹n cđa gièng lóa Méc tun cã 100% tơng đồng với trình tự cADN m hóa gien DREB2A ë lóa Japonica (m sè: NM 001048642.1; AF 300971.2; AK 067313.1; AK 21956.1) Hình Kết so sánh trình tự axit amin gien MtOsDREB2A So với gien DREB2A, DREB2B, JaOsDREB2A, JaOsDREB2B, ZmDREB2A: có tơng đồng lớn miền AP2 (vùng đánh dấu màu đen); gien MtOsDREB2A có tơng đồng hoàn toàn với gien JaOsDREB2A Kết tiến hành phân tích trình tự axit amin dự đoán gien đ phân lập với trình tự axit amin gien DREB2A, DREB2B, JaOsDREB2A, JaOsDREB2B ZmDREB2A 84 phần mềm Genetyx 6.0 cho thấy trình tự prôtêin dự đoán có miền AP2 có mức độ tơng đồng cao với gien lại nhóm DREB2 lúa Japonica, ngô A thaliana (hình 4) Đồng thời sử dụng chơng trình đ xây dựng đợc quan hƯ ph¸t sinh cđa gien MtOsDREB2A víi c¸c gien kh¸c nhãm DREB2 KÕt qu¶ cho thÊy gien MtOsDREB2A cã ®é t−¬ng ®ång 100% víi gien JaOsDREB2A, 78,17% víi gien DREB2 ë A thaliana vµ 71,47% víi gien ZmDREB2A ë ngô (hình 3) Các kết phân tích trình tự khẳng định đ phân lập đợc gien DREB2A tõ th− viƯn cADN xư lý h¹n cđa gièng lóa Mộc tuyền, nguồn nguyên liệu gien điều khiển tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam Thiết kÕ vector chun gien theo kü tht gateway: HƯ thèng gateway dựa phản ứng tái tổ hợp enzim LR clonase, gần trở thành xu nghiên cứu thiết kế vector đợc nhiều phòng thÝ nghiƯm sư dơng cã nhiỊu −u ®iĨm: (1) Phản ứng tái tổ hợp nhanh, nhạy tạo vector chuyển gien có khả biểu cao; (2) không cần nhiều plasmid trình thiết kế; (3) Khi đ thiết lập đợc hệ thống gateway (entry vector = vector cho vµ destination vector = vector nhËn) cần phản ứng tái tổ hợp enzim LR clonase chuyển trực tiếp cassette gồm promoter, gien cần chuyển trật tự kết thúc phiên m từ vector nhân dòng (vector cho) sang vector chuyển gien Vì tiện lợi cho phòng thí nghiệm cần thiết kế nhiều vector chuyển gien Hình KÕt qu¶ thiÕt kÕ vector chun gien MtOsDREB2A sư dơng kỹ thuật Gateway A Sơ đồ minh trình thiết kÕ vector chun gien pBCKH-Ubi sư dơng kü tht Gateway; B Kết kiểm tra tồn cassette promoter Ubiquitine, enhancer Ω vµ gien MtOsDREB2A vector chun gien: M- thang ADN chuÈn 1kb (Invitrogen; giÕng 1, 2, 6, 7, 11 cho kết âm tính; giếng 3, 4, 5, 10 cho băng điện di xấp xỉ 2,9 kb tơng ứng với khuẩn lạc chứa cassette xuôi chiều vector chuyển gien pBCKH; C Kết kiểm tra có mặt gien MtOsDREB2A vi khuÈn Agrobacterium: giÕng 1, 9, 10 vµ 11 cho băng điện di xấp xỉ 825-bp tơng ứng víi c¸c vi khn cã mang vector chun gien pBCKHMtOsDREB2A Theo hƯ thèng gateway, vector cho (h×nh 4) cã bé khung vector nhân dòng pUC19, gắn thêm vào cassette gồm promoter Ubiquitine, vị trí MCS trật tự kết thúc phiên m (NosT) đợc giới hạn hai đầu vị trí cắt enzim tái tổ hợp clonase (attL1, attL2) Trong nghiên cứu này, vector pUC19-Ubi mang gien MtOsDREB2A đ đợc trình bày vector cho Vector nhận (hình 3) có khung vector pBI101, gắn thêm vào cassette gồm promoter, gien ccdB gien chloramfenicol vùng kết thúc phiên m đợc giới hạn hai đầu 85 vị trí cắt enzim tái tổ hợp clonase (attR1, attR2) Gien ccdB gien virus, độc cho E coli, phản ứng tái tổ hợp xảy cassette vector cho chuyển sang gắn vào vector nhận sản phẩm phản ứng tái tổ hợp chuyển vào E coli cho khuẩn lạc nuôi môi trờng LB chứa kháng sinh kanamycin Các khuẩn lạc sinh trởng môi trờng LB có bổ sung kanamycin đợc kiểm tra tồn casstte mang gien cần chuyển thông qua phản ứng PCR với mồi xuôi GW-F bám đặc hiệu phía cuối vùng NosT bên trái mồi đặc hiệu OsDREB2A-R Nếu phản ứng clonase thành công cassette mang gien cần chuyển đợc chuyển sang vector nhận phản ứng PCR tạo sản phẩm khuếch đại có kích thớc theo tính toán khoảng 2,9 kb Kích thớc 2,9 kb t−¬ng øng víi sù céng dån kÝch th−íc gien MtOsDREB2A (825-bp), vïng enhancer Ω vµ promoter Ubiquitine (xÊp xØ kb) vùng vị trí nhận biết attB1 kích thớc mồi xuôi Kết điện di kiểm tra gel agarose 1% (h×nh 3A) cho thÊy víi 11 khn lạc sinh trởng môi trờng LB bổ sung kanamycin có khuẩn lạc (số 3, 4, 10) cho kết dơng tính Khuẩn lạc số cho kết khuếch đại tốt đợc lựa chọn để nuôi cấy tách plasmid để biến nạp vào A tumefaciens EHA105 sử dụng phơng pháp xung điện Sù tån t¹i cđa vector chun gien vi khn Agrobacterium đợc khẳng định thông qua phản ứng PCR với khuẩn lạc sinh trởng môi trờng LB có bổ sung kanamycin với cặp mồi đặc hiệu cho gien MtOsDREB2A Kết hình 3B cho thấy với 10 khuẩn lạc thu đợc khuẩn lạc (số 1, 10) cho kết dơng tính với sản phẩm khuếch đại rõ nét có kích thớc xấp xỉ 825-bp Khuẩn lạc số 10 đợc lựa chọn để làm nguyên liệu cho thí nghiệm chuyển gien thực vật Chuyển gien MtOsDREB2A vào lúa Chành trụi: Hình Kết chuyển gien MtOsDREB2A vào giống lúa Chành trụi A Callus lúa môi trờng MS bổ sung 2,4D; B Callus lúa môi trờng đồng nuôi cấy; C Callus lúa môi trờng chọn lọc D Tái sinh callus lóa; E Lóa chun gien sau th¸ng; F KÕt kiểm tra tồn gien MtOsDREB2A c©y lóa chun gien: M- ADN chn 1kb (Invitrogien); GiÕng đối chứng dơng, giếng đối chứng âm; giếng 12, 15 20 cho kết âm tính, giếng lại tơng ứng với mang gien MtOsDREB2A hệ gien Để nghiên cứu biểu gien MtOsDREB2A, tiến hành chuyển gien 86 MtOsDREB2A vào giống lúa Chành trụi thông qua Agrobacterium EHA105 Toàn trình hình thành callus, lây nhiễm tái sinh đợc tiến hành theo phơng pháp đ đợc tối u Nishimura [5] Từ 100 hạt lúa giống Chành trụi đợc vào nuôi cấy, thu đợc 91 callus sau 10 ngày nuôi cấy môi tr−êng MS cã bæ sung mg/l 2,4D Sau 15 ngày môi trờng chọn lọc MS-S, có 30 callus sống sót sau khoảng - tuần môi trờng tái sinh MS-R thu đợc 25 dòng lúa có chồi sinh trởng bình thờng m«i tr−êng chøa hygromycin Nh− vËy, hiƯu st chun gien giống lúa Chành trụi 25% Sau tuần nuôi cấy môi trờng tái sinh, lúa non phát triển tốt đợc chuyển sang môi trờng rễ (hình 4A, B, C D) Sau 10 ngày, đợc chuyển sang cốc đất nuôi điều kiện phòng nuôi cấy có phủ nilon tuần Cuối đợc chuyển tiếp sang xô to đợc trồng điều kiện bên môi trờng (hình 4E) Các lúa chuyển gien sau đợc kiểm tra tồn gien MtOsDREB2A genome phản ứng PCR với cặp mồi Ub-F Nos-TR Kích thớc theo tính toán sản phẩm khuếch đại xấp xỉ 1,2 kb tơng ứng với kích thớc gien 825-bp, vùng enhancer 100-bp vùng Nos-T phía phải 200-bp Kết điện di sản phẩm khuếch đại gel agarose 1% cho thÊy víi 21 dßng lóa chun gien sinh trởng tốt môi trờng có 16 dòng lúa cho kết dơng tính, với băng điện di có kích thớc xấp xỉ 1,2 kb (hình 4F) Các sau đợc thu hạt nhằm lu trữ tiến hành thí nghiệm tiÕp theo ë thÕ hƯ T1, T2 nh− thư nghiƯm khả chịu hạn, thí nghiệm Southern, Northern hay Western blotting để khẳng định tồn ổn định gien hƯ gien cđa gièng lóa Chµnh trơi III KếT LUậN Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu OsDREB2A-F/R đ thiết kế cho phép phân lập đợc gien MtOsDREB2A từ th viện cADN xử lý hạn giống lúa Mộc tuyền Đây nguồn gien điều khiển chịu hạn từ nguồn thực vật Việt Nam, sở cho nghiên cứu gien điều khiển chịu hạn khác lúa Việt Nam Kỹ thuật gateway đ giúp rút ngắn thời gian thiÕt lËp vector chun gien nghiªn cøu cđa chóng Việc áp dụng thành công kỹ thuật cho phép mở rộng tiến hành đồng thời thí nghiệm chuyển gien khác vào lúa Quy trình chuyển gien thông qua vi khuẩn A.tumefaciens nhóm tác giả Nishimura [5] đợc tối u lúa Japonica nhng thích hợp với lúa Chành trụi (giống indica) Việt Nam với hiệu suất chuyển gien đạt tới 25% Các chuyển gien sau có khả sinh trởng bình thờng điều kiện nhà kính nh ruộng thí nghiệm Lời cảm ơn: Công trình đợc tài trợ kinh phí Chơng trình Công nghệ sinh học Nông nghiệp 2007 - 2010 TàI LIệU THAM KHảO Cao Lệ Quyên cs., 2008: Tạp chí Sinh học, 30(3): 141-147 Bartels D., Sunkars R., 2005: Critical review in plant science, 24: 23-58 Dubouzet J G et al., 2003: Plant Journal, 33: 751-763 Liu Q et al., 1998: Plant Cell, 10: 13911406 Nishimura A., Aichi I and Matsuoka M., 2007: Nature protocols, 1(6): 2796-2802 Qin F., 2007: Plant Journal, 50(1): 54-69 Sakuma Y et al., 2006a: The Plant Cell, 18: 1292-1309 Sakuma Y., et al., 2006b: Proc Natl Acad Sci.,USA, 103: 18822-18827 Seki M et al., 2001: The Plant Cell, 13: 6172 10 Shen Y G et al., 2003a: Theor Appl Genet., 106: 923-930 11 Shen Y G et al., 2003: Atriplex hortensis Theor Appl Genet., 107: 155-61 12 Umezawa T., 2006: Current Opinion in Biotechnology, 17: 113-122 13 Xue G P., 2003: Plant J., 33: 373-83 14 Zhang J Z., Creelman R A., Zhu J K., 2004: Plant physiology, 135: 615- 621 87 Genetic engineering of gene encoding transcription factor MtOsDREB2A form Vietnamese rice variety Chanh trui for drought stress tolerance Le Quyen Cao, Tuan Tu Tran, Xuan Hoi Pham Summary DREB1/CBFs and DREB2s are transcription factors belonging to the DREBP transcription factor subfamily that specifically interact with a cis- acting element, DRE/CRT, which involved in the expression of many genes responsive to drought, high-salt and cold stresses Many DREB2 transcription factors, including DREB2A, and DREB2A CA (Arabidopsis), OsDREB2A (rice), ZmDREB2A (maize)… have been cloned and proved to play an important role in drought and high-salt stress tolerance in plant In this study, we report the cloning, sequencing analysis and transformation of a DREB2A homolog named MtOsDREB2A from Moc tuyen rice variety (Vietnamese cultivar rice) Interestingly, MtOsDREB2A has an Open Reading Frame of 825-bp that is totally identity to Japonica rice OsDREB2A (accession numbers: NM 001048642.1; AF 300971.2; AK 067313.1; AK 121956.1) The ORF of MtOsDREB2A was cloned into the expression vector driven by ubiquitine promoter and transferred into a Vietnam highland rice variety, named Chanh trui by the Agrobacterium-mediated transfer method As a result, from 100 Chanh trui seeds for callus formation, 25 lines transgenic rice plants were identified and PCR analysis demonstrates that 16 lines transgenic rice plants have contained the interested gene in genome Ngµy nhËn bµi: 12-11-2008 88 ... thí nghiệm chuyển gien thực vật Chuyển gien MtOsDREB2A vào lúa Chành trụi: Hình Kết chuyển gien MtOsDREB2A vào giống lúa Chành trụi A Callus lúa môi trờng MS bổ sung 2,4D; B Callus lúa môi trờng... phép phân lập đợc gien MtOsDREB2A từ th viện cADN xử lý hạn giống lúa Mộc tuyền Đây nguồn gien điều khiển chịu hạn từ nguồn thực vật Việt Nam, sở cho nghiên cứu gien điều khiển chịu hạn khác lúa. .. tính, giếng lại tơng ứng với mang gien MtOsDREB2A hệ gien Để nghiên cứu biểu gien MtOsDREB2A, tiến hành chuyển gien 86 MtOsDREB2A vào giống lúa Chành trụi thông qua Agrobacterium EHA105 Toàn trình