Đang tải... (xem toàn văn)
Các mẫu huyết thanh chứa virus viêm gan siêu vi B (hepatitis B virus, HBV) được dùng như mẫu sinh học để khảo sát khả năng tách chiết DNA (deoxyribonucleic acid) theo kích thước và lượng hạt nano sử dụng, được thực hiện trong nghiên cứu này. Hạt nano Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa (co-precipitation) có kích thước khoảng 10 nm với độ bão hòa từ 60,02 emu/g. Sử dụng phương pháp dung môi nhiệt (solvothermal) với thời gian tổng hợp khác nhau thu được các kích thước hạt nano Fe3O4 khoảng 32, 60 và 100 nm với độ bão hòa từ tương ứng 88,82; 83,69 và 80,29 emu/g.
Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):55- 64 Nghiên cứu Che´ˆ tạo hạt nano Fe3O4 nhiều kích thước ứng dụng tách chie´ˆ t DNA từ mẫu sinh học Bùi Trung Thành1,2 , Phạm Hùng Vân3,∗ , Trần Hồng Hải4 TĨM TẮT Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Các mẫu huye´ˆ t chứa virus viêm gan siêu vi B (hepatitis B virus, HBV) dùng mẫu sinh học để khảo sát khả tách chie´ˆ t DNA (deoxyribonucleic acid) theo kích thước lượng hạt nano sử dụng, thực nghiên cứu Hạt nano Fe3 O4 tổng hợp phương pháp đồng ke´ˆ t tủa (co-precipitation) có kích thước khoảng 10 nm với độ bão hòa từ 60,02 emu/g Sử dụng phương pháp dung môi nhiệt (solvothermal) với thời gian tổng hợp khác thu kích thước hạt nano Fe3 O4 khoảng 32, 60 100 nm với độ bão hòa từ tương ứng 88,82; 83,69 80,29 emu/g Các hạt nano Fe3 O4 tổng hợp có tính chất siêu thuận từ Bằng phương pháp Stöber, hạt nano Fe3 O4 phủ SiO2 (Fe3 O4 @SiO2 ) để tạo nhóm Si-OH qua hạt nano hấp phụ DNA thơng qua liên ke´ˆ t hydro Tính chất, hình dạng, kích thước khả hấp phụ DNA hạt nano xác định nhiễu xạ tia X (XRD), hiển vi điện tử truyền qua (TEM), từ ke´ˆ mẫu rung (VSM), phổ hồng ngoại bie´ˆ n đổi Fourier (FTIR), phương pháp Brunauer–Emmett–Teller (BET) polymerase chain reaction (PCR) Ke´ˆ t cho thấy hạt nano Fe3 O4 @SiO2 tách chie´ˆ t DNA HBV Hạt nano Fe3 O4 @SiO2 thu từ hạt nano Fe3 O4 10 nm có khả tách chie´ˆ t DNA HBV tốt Ở nồng độ HBV cao (109 copies/mL), việc sử dụng mg Fe3 O4 @SiO2 (Fe3 O4 10 nm) tách chie´ˆ t nhiều DNA HBV so với dùng mg Từ khố: hạt nano, Fe3O4, kích thước, tách chiết, DNA Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ĐẶT VẤN ĐỀ Trường Đại học Phan Châu Trinh Viện Vật lý Thành phố Hồ Chí Minh Liên hệ Phạm Hùng Vân, Trường Đại học Phan Châu Trinh Email: van.phh@gmail.com Lịch sử • Ngày nhận: 31-10-2018 • Ngày chấp nhận: 27-3-2019 • Ngày đăng: 31-3-2019 DOI : https://doi.org/10.32508/stdjns.v3i1.726 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM Đây báo công bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license Tách chie´ˆ t DNA từ mẫu bệnh phẩm phần việc quan trọng xét nghiệm sử dụng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) dùng chẩn đoán, chẩn đoán bệnh, pháp y, quan hệ huye´ˆ t thống, định danh loài, đánh giá chất lượng thực phẩm Một số phương pháp truyền thống tách chie´ˆ t DNA sử dụng hạt silica cột silica dựa phương pháp ly tâm để loại bỏ dịch nổi, hóa chất sau tách chie´ˆ t thu hồi DNA, the´ˆ tiêu tốn nhiều thời gian cho quy trình tách chie´ˆ t chưa thể tự động hoàn toàn Hiện nay, hạt từ phủ lớp bề mặt có chức hấp phụ DNA nghiên cứu ứng dụng So với phương pháp tách chie´ˆ t dùng kỹ thuật ly tâm, phương pháp hạt từ sử dụng nam châm thu hồi hạt từ mang đe´ˆ n thuận lợi, đơn giản, nhanh chóng, hoàn toàn tự động, thực với lượng mẫu lớn, độ tinh cao tránh nhiễm sai sót kỹ thuật, ngồi hiệu suất tách chie´ˆ t DNA phương pháp hạt từ không thua phương pháp tách chie´ˆ t Hạt nano Fe3 O4 ứng dụng nhiều y sinh tính siêu thuận từ, độ bão hòa từ cao, độc, sau chức bề mặt chúng gắn ke´ˆ t phân tử sinh học Độ bão hòa từ phụ thuộc mạnh vào kích thước tùy kích thước mà hạt Fe3 O4 dùng ứng dụng khác Trong nghiên cứu này, hạt nano Fe3 O4 tổng hợp với kích thước 10, 32, 60 100 nm, phủ SiO2 để tách chie´ˆ t DNA Mẫu dùng để thử nghiệm khả tách chie´ˆ t DNA kích thước hạt nano lượng hạt nano sử dụng cho lần tách chie´ˆ t mẫu huye´ˆ t chứa HBV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Ferrous chloride tetrahydrate (FeCl2 4H2 O); ferric chloride hexahydrate (FeCl3 6H2 O); ammonium hydroxide (NH3 H2 O, 25 % w/w); ethylene glycol (EG); sodium acetate trihydrate (NaAc.3H2 O); poly(ethylene glycol)-2000 (PEG); ethanol tetraethyl orthosilicate (TEOS) Merck sản xuất Dung dịch ly giải: 2M guanidinium thiocyanate (GuSCN); 20 mM ethylene diamine tetra actic acid (EDTA); 250 mM sodium chloride (NaCl); mg proteinase K, pH 5,5; dung dịch rửa 1: 2M GuSCN; Trích dẫn báo này: Thành B T, Vân P H, Hải T H Che´ˆ tạo hạt nano Fe3 O4 nhiều kích thước ứng dụng tách chie´ˆ t DNA từ mẫu sinh học Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 3(1):55-64 55 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):55- 64 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) – HCl, pH 6,4; dung dịch rửa 2: ethanol 70%; dung dịch rửa 3: ethanol 99,99%; dung dịch giải hấp phụ: 10 mM Tris-HCl; mM EDTA, pH 8; hóa chất có dung dịch Merck sản xuất Kit dùng cho phản ứng PCR NK PCR-VB NK qPCR-VBquant Nam Khoa Biotek sản xuất Tổng hợp hạt Fe3 O4 @SiO2 Hạt Fe3 O4 tổng hợp phương pháp đồng ke´ˆ t tủa dung môi nhiệt Theo phương pháp đồng ke´ˆ t tủa , 2,434 g FeCl3 6H2 O 0,895 g FeCl2 4H2 O hòa tan 65 mL nước cất 80o C mơi trường khí N2 , 25 mL dung dịch NH3 H2 O thêm vào dung dịch (pH ∼10) khuấy thêm Các phân tử Fe3 O4 hình thành dựa phản ứng : Fe2+ + Fe3+ + 8OH− → Fe3 O4 + 4H2 O (1) Theo phương pháp dung môi nhiệt , hòa tan 2,7g FeCl3 6H2 O 40 mL EG, sau thêm vào dung dịch 4,8 g NaAc 0,5 g PEG, khuấy mạnh 30 phút nhiệt độ phòng mơi trường khí N2 , dung dịch chuyển vào nồi hấp, tăng dần nhiệt độ trì 200o C 12, 18 24 Sau cùng, dung dịch sau phản ứng để nguội đe´ˆ n nhiệt độ phòng, hạt tách nam châm, rửa nhiều lần với nước cất, ethanol sấy khô chân không 70o C Ở 200o C, Fe3+ bị khử EG NaAc để trở thành Fe2+ qua Fe3 O4 hình thành thể phản ứng : CH2 OH − CH2 OH → CH3 CHO + H2 O (2) Fe3+ + 2CH3 CHO → Fe2+ + 2H+ + CH3 COCOCH3 (3) Fe3+ + 3OH− → Fe(OH)3 (4) Fe2+ + 2OH− → Fe(OH)2 (5) Fe(OH)3 + Fe(OH)2 → Fe3 O4 + 4H2 O (6) Hạt nano Fe3 O4 phủ SiO2 (Fe3 O4 @SiO2 ) phương pháp Stöber với vài thay đổi, theo 150 mg Fe3 O4 phân tán 40 mL dung dịch ethanol/nước theo tỉ lệ thể tích 3:1, sau mL NH3 H2 O 0,3 mL TEOS thêm vào khuấy 12 môi trường N2 Các hạt nano rửa nước, ethanol, tách nam châm sấy khô chân không 56 Tách chie´ˆ t DNA DNA tách chieˆ´ t theo phương pháp Boom 10 , hạt silica thay hạt nano Fe3 O4 @SiO2 hạt nano thu hồi nam châm thay ly tâm Mẫu thử chứa 200 μL huye´ˆ t với nồng độ HBV khác có khơng có 20 μL chứng nội kit PCR Hạt nano Fe3 O4 @SiO2 cho vào tube chứa mẫu thử 700 μL dung dịch ly giải, vortex nhẹ, ủ hỗn hợp dung dịch nhiệt độ phòng 10 phút Hạt nano tách nam châm rửa với dung dịch rửa 1, loại mL, sấy khô mẫu 56o C 10 phút, thu hạt nano hấp phụ DNA Sau cùng, dung dịch giải hấp phụ (100 μL) thêm vào tube chứa hạt nano hấp phụ DNA, vortex ủ mẫu nhiệt độ phòng 10 phút, loại bỏ hạt nano thu dịch chứa DNA Hạt nano Fe3 O4 @SiO2 (3 mg) che´ˆ tạo từ hạt Fe3 O4 10, 32, 60 100 nm dùng để tách chie´ˆ t DNA Ngoài ra, liều lượng 2, mg hạt nano Fe3 O4 @SiO2 che´ˆ tạo từ hạt Fe3 O4 10 nm dùng cho lần tách chie´ˆ t thử nghiệm thực nghiệm Khue´ˆ ch đại DNA PCR Dịch DNA tách chie´ˆ t (10 µ L) 15 µ L dung dịch (NK PCR-VB với PCR NK qPCR-VBquant với realtime PCR) cho vào ống phản ứng thực PCR với 40 chu kỳ Các kỹ thuật phân tích Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD, D8–ADVANCE, Bruker), ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM, JEM1400, Joel), đường cong từ hóa (VSM, MicroSense), phổ hồng ngoại bie´ˆ n đổi Fourier (FTIR, TENSOR 27, Brucker), phương pháp Brunauer–Emmett–Teller (BET, Nova 3200e, Quantachrome Instruments) polymerase chain reaction (PCR, CFX96, Bio-Rad) tất sử dụng để xác định hình dạng, tính chất khả tách chie´ˆ t DNA hạt nano KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Giản đồ XRD mẫu tổng hợp phương pháp đồng ke´ˆ t tủa dung môi nhiệt cho thấy sản phẩm chủ ye´ˆ u Fe3 O4 , đỉnh nhiễu xạ (220), (311), (400), (422), (511) (440) phù hợp với đỉnh nhiễu xạ Fe3 O4 chuẩn (JCPDS file No 01-075-1372) (Hình 1) Áp dụng công thức Scherrer với đỉnh (311), từ tính kích thước tinh thể 9,15 nm với phương pháp đồng ke´ˆ t tủa (Hình 1a); 28,92; 29,02 28,75 nm với phương pháp dung môi nhiệt ứng với thời gian tổng hợp 12, 18 24 (Hình 1b-d) Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):55- 64 Ảnh TEM (Hình 2) cho thấy khác biệt kích thước hạt tổng hợp theo hai phương pháp Phương pháp đồng ke´ˆ t tủa, kích thước hạt khoảng 10 nm (Hình 2a), phương pháp dung mơi nhiệt thu hạt có kích thước lớn 30 nm (Hình 2b-d) Sự khác biệt che´ˆ hình thành hạt Fe3 O4 hai phương pháp Với phương pháp đồng ke´ˆ t tủa, phân tử Fe3 O4 hình thành theo phản ứng (1) hình thành sau dung dịch muối sắt đưa vào dung dịch bazo Và thời gian để phản ứng xảy hồn tồn khơng q Trong với phương pháp dung môi nhiệt, phân tử Fe3 O4 hình thành thơng qua phản ứng (2-6), hệ thống phản ứng hình thành thành phần trung gian trước hình thành Fe3 O4 Hơn nữa, thời gian để phản ứng xảy hồn tồn lên đe´ˆ n nhiều Chính hình thành thành phần trung gian hệ thống phản ứng hình thành hạt Fe3 O4 có kích thước lớn 11 Hình 2b-d, hạt tổng hợp theo phương pháp dung môi nhiệt với thời gian tổng hợp 12, 18 24 thu kích thước hạt tương ứng 32, 60 100 nm Sự tăng kích thước tăng thời gian tổng hợp Giản đồ XRD Hình 1b-d ứng với thời gian tổng hợp 12, 18 24 cho bie´ˆ t kích thước tinh thể khơng thay đổi đáng kể, khoảng 29 nm Trong mẫu này, Hình 2b-d thể hạt Fe3 O4 có kích thước lớn 30 nm Do hạt Fe3 O4 tổng hợp theo phương pháp dung mơi nhiệt, hình thành từ ke´ˆ t tụ tinh thể Fe3 O4 nhỏ 12 Nghiên cứu này, hạt Fe3 O4 tổng hợp theo phương pháp dung môi nhiệt, hình thành từ ke´ˆ t tụ tinh thể nano có kích thước nhỏ 29 nm thời gian tổng hợp kéo dài làm tăng kích thước hạt Fe3 O4 khơng làm thay đổi đáng kể kích thước tinh thể nano cấu thành hạt Fe3 O4 Hình thể hạt Fe3 O4 phủ SiO2 , bề dày lớp phủ khoảng 3-10 nm hầu he´ˆ t hạt phủ Các hạt nano Hình 2a Hình 3a có kích thước nhỏ nên có ke´ˆ t tụ nhiều tương tác lưỡng cực từ mạnh, tỷ số diện tích thể tích lớn Hình Bảng thể đường cong từ hóa độ bão hòa từ (Ms) hạt nano nhiệt độ phòng Giá trị Ms Fe3 O4 có kích thước 10 nm tổng hợp theo phương pháp đồng ke´ˆ t tủa 60,02 emu/g (Hình 4a) nhỏ giá trị Ms hạt Fe3 O4 tổng hợp theo phương pháp dung môi nhiệt 88,82; 83,69 80,29 emu/g ứng với kích thước 32, 60 100 nm (Hình 4b-d) kích thước tinh thể chúng nhỏ Sự khác biệt giá trị Ms hạt nano Fe3 O4 tổng hợp theo hai phương pháp chủ ye´ˆ u khác biệt kích thước tinh thể Kích thước tinh thể tăng Ms tăng Tuy nhiên, kích thước tinh thể vượt 30 nm khơng siêu thuận từ, nghĩa từ dư ngừng tác động từ trường làm hạt phân tán không tốt dung dịch Do nghiên cứu này, tinh thể cấu thành hạt Fe3 O4 có kích thước nhỏ giới hạn siêu thuận từ 30 nm 13 , nên xem hạt Fe3 O4 siêu thuận từ Ngoài ra, giá trị Ms mẫu tổng hợp theo phương pháp dung môi nhiệt lên đe´ˆ n 88,82 emu/g gần với giá trị Ms Fe3 O4 khối 92 emu/g Ke´ˆ t Bảng Hình thể giảm giá trị Ms hạt Fe3 O4 @SiO2 so với hạt Fe3 O4 lớp phủ SiO2 14 Chức hóa bề mặt hạt nano Fe3 O4 Hình thể phổ FTIR hạt nano Fe3 O4 @SiO2 Các đỉnh quanh 570 473 cm−1 thuộc dao động Fe-O3 Ở 473 cm−1 có diện dao động uốn cong Si-O-Si 15 góp phần làm tăng cường độ đỉnh Ngồi ra, đỉnh quanh 1090 804 cm−1 dao động bất đối xứng kéo căng Si-O-Si, vùng phổ quanh đỉnh 950 cm−1 liên quan đe´ˆ n dao động kéo căng Si-OH 15 Sự xuất đỉnh 3379, 1628 1401 cm−1 dao động kéo căng O-H, uốn cong H-O-H 16 Ngoài ra, đỉnh quanh 1401 cm−1 liên quan đe´ˆ n dao động bie´ˆ n dạng CH2 dao động uốn cong CH3 17 Sự hình thành lớp phủ silica bề mặt hạt nano Fe3 O4 dựa phản ứng nhóm OH hạt nano Fe3 O4 nhóm OC2 H5 TEOS 18 Ke´ˆ t cho thấy hạt nano Fe3 O4 với kích thước 10, 32, 60 100 nm phủ silica Trong môi trường pH ~ 5, hạt nano Fe3 O4 @SiO2 mang nhóm Si-OH hấp phụ DNA thơng qua liên ke´ˆ t hydro DNA giải hấp phụ môi trường pH ~ 19 Sự ảnh hưởng kích thước hạt nano Fe3 O4 Fe3 O4 @SiO2 (3 mg) với kích thước hạt Fe3 O4 10, 32, 60 100 nm dùng để tách chie´ˆ t DNA 220 μL mẫu thử gồm 200 μL huye´ˆ t có HBV(109 copies/mL) 20 μL mẫu chứng nội Độ tinh DNA tính Q = (A260 nm – A320 nm ) / (A280 nm – A320 nm ) với A260 , A280 A320 nm ứng với độ hấp thu bước sóng 260, 280 320 nm Ke´ˆ t cho thấy giá trị Q >1,7 (Bảng 2), thực PCR để khue´ˆ ch đại DNA tách chie´ˆ t 20 Chứng nội cho vào mẫu HBV để kiểm tra khả tách chie´ˆ t DNA hạt nano, sản phẩm tách chie´ˆ t có DNA chứng nội 57 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):55- 64 Hình 1: Giản đồ XRD Fe3 O4 tổng hợp a) phương pháp đồng ke´ˆ t tủa; b-d) phương pháp dung môi nhiệt với thời gian tổng hợp tương ứng 12, 18 24 giờ; e) Fe3 O4 khie´ˆ t Hình 2: Ảnh TEM hạt nano Fe3 O4 tổng hợp a) phương pháp đồng ke´ˆ t tủa; b-d) phương pháp dung môi nhiệt với thời gian tổng hợp tương ứng 12, 18 24 Hình 3: Ảnh TEM hạt Fe3 O4 @SiO2 với kích thước hạt Fe3 O4 a) 10, b) 32, c) 60, d) 100 nm Bảng 1: Độ từ hóa bão hòa hạt nano Fe3 O4 Fe3 O4 @SiO2 Kích thước hạt Fe3 O4 (nm) 10 32 60 100 Ms (emu/g) Fe3 O4 60,02 88,82 83,69 80,29 Ms (emu/g) Fe3 O4 @SiO2 50,90 76,04 75,61 73,28 Bảng 2: Độ tinh DNA tách chie´ˆ t hạt nano Fe3 O4@SiO2 với kích thước hạt Fe3 O4 10, 32, 60 100 nm 58 Hạt Fe3 O4 @SiO2 với kích thước Fe3 O4 (nm) 10 32 60 100 Độ tinh Q 1,75 1,82 1,79 1,77 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):55- 64 Hình 4: Đường cong từ hóa nhiệt độ phòng hạt nano Fe3 O4 Fe3 O4 @SiO2 (phía bên trái) với kích thước hạt Fe3 O4 a, e) 10; b, f) 32; c, g) 60; d, h) 100 nm Hình 5: Phổ FTIR hạt nano Fe3O4@SiO2 với kích thước hạt Fe3O4a) 10, b) 32, c) 60 d) 100 nm DNA HBV PCR kỹ thuật khue´ˆ ch đại đoạn DNA đích thành nhiều DNA, ne´ˆ u bắt đầu DNA đích mạch đơi DNA, sau n chu kỳ khue´ˆ ch đại, số DNA thu 2n Do đó, ne´ˆ u bắt đầu với N DNA đích mạch đơi DNA sau n chu kỳ số DNA thu N × 2n ; nghĩa với số chu kỳ khue´ˆ ch đại, số DNA đích lớn, số DNA thu tăng Hình thể sản phẩm PCR điện di gel agarose 2%, gie´ˆ ng chứa HBV chứng nội tách chie´ˆ t hạt nano Fe3 O4 @SiO2 với kích thước hạt Fe3 O4 tương ứng a) 10, b) 32, c) 60 d) 100 nm; gie´ˆ ng (-) chứa mẫu âm HBV (0 copies/mL) chứng nội tách chie´ˆ t hạt nano Fe3 O4 @SiO2 kích thước hạt Fe3 O4 10 nm Theo nhà sản xuất kit PCR, đoạn DNA HBV DNA chứng nội khue´ˆ ch đại có kích thước 259 190 bps Ke´ˆ t cho thấy vạch 259 bps xuất gie´ˆ ng a-d) DNA HBV, không xuất gie´ˆ ng (-); tất 59 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):55- 64 gie´ˆ ng xuất vạch 190 bps, sản phẩm khue´ˆ ch đại đoạn DNA đích chứng nội Ke´ˆ t cho thấy loại hạt nano tách chie´ˆ t DNA mẫu HBV chứng nội tại, DNA đủ tinh cho phép thực PCR Tuy nhiên, quan sát dải 259 bps gie´ˆ ng, khó nhận bie´ˆ t dải gie´ˆ ng sáng Dải sáng ứng với hạt nano tách chie´ˆ t DNA HBV gie´ˆ ng nhiều Realtime PCR kỹ thuật PCR, sản phẩm khue´ˆ ch đại đọc dựa tín hiệu huỳnh quang (RFU, relative fluorescence units) phát từ DNA sao, cho phép xác định số DNA đích mẫu Số DNA gia tăng sau chu kỳ, cường độ huỳnh quang phát từ DNA gia tăng đe´ˆ n chu kỳ cường độ huỳnh quang vượt qua đường huỳnh quang nền, chu kỳ gọi chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) 21 Do vậy, số DNA đích lớn giá trị Ct nhỏ ngược lại Fe3 O4 @SiO2 (3 mg) với kích thước hạt Fe3 O4 10, 32, 60 100 nm dùng để tách chie´ˆ t DNA 200 μL mẫu HBV (109 copies/mL) Và sản phẩm tách chie´ˆ t khue´ˆ ch đại realtime PCR (Hình 7) cho thấy bốn mẫu Fe3 O4 @SiO2 với hạt Fe3 O4 10, 32, 60 100 nm tách chie´ˆ t DNA sản phẩm khue´ˆ ch đại tương ứng với đường a-d) với giá trị Ct 13,39; 14,31; 15,13 15,86 Giá trị 13,39 Ct (Hình 7a) nhỏ giá trị Ct hạt nano Fe3 O4 @SiO2 (Fe3 O4 10 nm) tóm bắt DNA HBV nhiều nhất, ke´ˆ đe´ˆ n hạt Fe3 O4 @SiO2 với hạt Fe3 O4 32, 60 100 nm Gie´ˆ ng (-) (Hình 7(-)), khơng có HBV nên đường biểu diễn khue´ˆ ch đại không vượt qua đường huỳnh quang Bằng phương pháp BET xác định diện tích (bề mặt) riêng hạt nano Fe3 O4 @SiO2 ke´ˆ t cho Bảng 3, kích thước hạt Fe3 O4 giảm, diện tích riêng Fe3 O4 @SiO2 tăng Vì the´ˆ , chúng làm tăng khả gắn nhóm chức tăng khả liên ke´ˆ t phân tử sinh học Với lượng, hạt nano Fe3 O4 @SiO2 (Fe3 O4 10 nm) tóm bắt DNA nhiều diện tích riêng chúng lớn Hạt nano Fe3 O4 @SiO2 tổng hợp từ hạt Fe3 O4 có kích thước nhỏ có khả tóm bắt DNA tốt Sự ảnh hưởng lượng hạt nano Lần lượt dùng 2, mg hạt Fe3 O4 @SiO2 (Fe3 O4 10 nm) để tách chie´ˆ t DNA 200 μL mẫu HBV có nồng độ 103 , 106 109 copies/mL Sản phẩm tách chie´ˆ t khue´ˆ ch đại realtime PCR (Hình 8) Ở nồng độ HBV 103 copies/mL, sử dụng 2, mg hạt Fe3 O4 @SiO2 để tách chie´ˆ t DNA nhận 60 đường biểu diễn ứng với giá trị Ct xấp xỉ 33,70; 33,41 33,68 (Hình 8a-c) Tương tự với nồng độ HBV 106 copies/mL, giá trị Ct nhận xấp xỉ 23,84; 23,15 23,41 tương ứng với Hình 8a-c, nghĩa tách chie´ˆ t số DNA xấp xỉ với mg hạt nano tách chie´ˆ t hầu he´ˆ t DNA mẫu Tuy nhiên, nồng độ HBV 109 copies/mL, dùng mg hạt nano nhận giá trị Ct 13,13 13,15 (Hình 8b-c) thấp giá trị Ct 14,20 (Hình 8a) ứng với dùng mg hạt nano tăng lượng hạt nano làm tăng diện tích bề mặt dẫn đe´ˆ n tăng số nhóm chức ke´ˆ t tách chie´ˆ t nhiều DNA Ke´ˆ t cho thấy với mẫu có nồng độ HBV cao (109 copies/mL), dùng mg tách chie´ˆ t nhiều DNA so với dùng mg hạt nano KẾT LUẬN Đã tổng hợp hạt nano Fe3 O4 có kích thước 10, 32, 60 100 nm với độ bão hòa từ tương ứng 60,02; 88,82; 83,69 80,29 emu/g xem siêu thuận từ Độ bão hòa từ hạt Fe3 O4 (88,82; 83,69 80,29 emu/g) gần độ bão hòa từ Fe3 O4 khối (92 emu/g) Cáchạt Fe3 O4 @SiO2 tách chie´ˆ t DNA HBV DNA đủ tinh Fe3 O4 @SiO2 với hạt Fe3 O4 10 nm cho khả tách chie´ˆ t HBV DNA tốt Ở nồng độ HBV cao (109 copies/mL), dùng mg hạt Fe3 O4@SiO2 (Fe3 O4 10 nm) cho ke´ˆ t tách chie´ˆ t HBV DNA tốt so với mg hạt nano loại, nồng độ HBV thấp (103 106 copies/mL) khơng có khác biệt đáng kể Ke´ˆ t sở để ứng dụng hạt nano Fe3 O4 cho việc tách chie´ˆ t DNA/RNA (ribonucleic acid) từ mẫu sinh học khác DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid HBV: Virus viêm gan B XRD: Nhiễu xạ tia X TEM: Hiển vi điện tử truyền qua VSM: Từ ke´ˆ mẫu rung FTIR: Phổ hồng ngoại bie´ˆ n đổi Fourier BET: Brunauer–Emmett–Teller PCR: Polymerase chain reaction Tris: Tris(hydroxymethyl)aminomethane EG: Ethylene glycol NaAc: Sodium acetate trihydrate PEG: Poly(ethylene glycol)-2000 TEOS: Tetraethyl orthosilicate GuSCN: Guanidinium thiocyanate EDTA: Ethylene diamine tetraactic acid RFU: relative fluorescence units Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):55- 64 Hình 6: Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2%; MK (marker), thang DNA; gie´ˆ ng chứa HBV (109 copies/mL) chứng nội tách chie´ˆ t hạt nano Fe3 O4 @SiO2 với kích thước hạt Fe3 O4 tương ứng a) 10, b) 32, c) 60 d) 100 nm; gie´ˆ ng (-) chứa mẫu âm HBV chứng nội tách chie´ˆ t hạt nano Fe3 O4 @SiO2 với hạt Fe3 O4 10 nm Hình 7: Đồ thị RFU phản ứng realtime PCR, gie´ˆ ng chứa HBV (109 copies/mL) tách chie´ˆ t hạt nano Fe3 O4 @SiO2 với kích thước hạt Fe3 O4 tương ứng a) 10, b) 32, c) 60 d) 100 nm; gie´ˆ ng (-) chứa mẫu âm HBV tách chie´ˆ t hạt nano Fe3 O4 @SiO2 với hạt Fe3 O4 10 nm Bảng 3: Diện tích riêng hạt nano Fe3 O4 @SiO2 Kích thước hạt Fe3 O4 (nm) Diện tích riêng Fe3 O4 @SiO2 (m2 /g) 10 32 60 100 48,012 33,452 23,185 12,171 61 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):55- 64 Hình 8: Đồ thị RFU phản ứng realtime PCR; HBV với nồng độ 103 , 106 109 copies/mL tách chie´ˆ t với lượng hạt nano Fe3 O4 @SiO2 a) 2, b) c) mg MK: Thang DNA N: Số DNA đích Ct: Chu kỳ ngưỡng Ms: Độ bão hòa từ Q: Độ tinh DNA NPs: Nanoparticles XUNG ĐỘT LỢI ÍCH Các tác giả tuyên bố khơng có xung đột lợi ích ĐĨNG GĨP CỦA TÁC GIẢ Bùi Trung Thành thực thực nghiệm, xử lí số liệu vie´ˆ t thảo Phạm Hùng Vân Trần Hồng Hải có đóng góp quan trọng việc giải thích ke´ˆ t thực nghiệm góp ý cho thảo ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Y SINH Nghiên cứu thực cho phép hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh Nam Khoa Biotek Co LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Nam Khoa Biotek Co tài trợ kinh phí; Phòng Năng lượng Mơi trường Viện Vật lý Thành phố Hồ Chí Minh Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ thie´ˆ t bị TÀI LIỆU THAM KHẢO Tan SC, C YB DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present J Biomed Biotechnol 2009;p 1–10 62 Akutsu J, Tojo Y, Segawa O, K O, M O, H T, et al Development of an integrated automation system with a magnetic beadmediated nucleic acid purification device for genetic analysis and gene manipulation Biotechnol Bioeng 2004;86:667–71 Can K, Ozmen M Ersoz M Immobilization of albumin on aminosilane modified superparamagnetic magnetite nanoparticles and its characterization Colloids and Surfaces B: Biointerfaces; Andrade AL, Valente MA, Ferreira JMF, JD F Preparation of sizecontrolled nanoparticles of magnetite Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2012;324:1753–1757 Massart R Preparation of Aqueous Magnetic Liquids in Alkaline and Acidic Media IEEE Trans on Magn 1981;MAG17:1247–1248 El-kharrag R, Amin A, Greish YE Low temperature synthesis of monolithic mesoporous magnetite nanoparticles Ceramics International 2012;38:627–634 Deng H, Li X, Q P, X W, J C, Y L Monodisperse Magnetic SingleCrystal Ferrite Microspheres Angew Chem 2005;117:2842– 2845 Sun H, Zeng X, Liu M, Elingarami S, Li G, Shen B, et al Synthesis of Size-Controlled Fe3O4@SiO2 Magnetic Nanoparticles for Nucleic Acid Analysis Journal of Nanoscience and Nanotechnology 2012;12:267–273 Stöber W, Fink A, Bohn E Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range J Colloid Interface Sci 1968;26:62–69 10 Boom R, Sol CJ, MM S, CL J, PMWV D, JVD N Rapid and simple method for purification of nucleic acids Journal of Clinical Microbiology 1990;28:495–503 11 Nishio K, Ikeda M, Gokon N, Tsubouchi S, Narimatsu H, Mochizuki Y, et al Preparation of size-controlled (30–100 nm) magnetite nanoparticles for biomedical applications Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2007;310:2408–2410 12 Zheng J, Liu ZQ, XS Z, M L, X L, W C One-step solvothermal synthesis of Fe3O4@C core-shell nanoparticles with tunable sizes Nanotechnology 2012;23:165601 13 Ge J, Hu Y, Biasini M, WP B, Y Y Superparamagnetic magnetite colloidal nanocrystal clusters Angew Chem Int Ed Engl 2007;46:4342–4345 14 Girginova PI, da Silva AL D, CB L, P F, M O, VS A, et al Silica coated magnetite particles for magnetic removal of Hg2+ from water J Colloid Interface Sci 2010;345:234–240 15 Klotz M, A A, C G, C M, V C Silica Coating on Colloidal Maghemite Particles J Colloid Interface Sci 1999;220 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(1):55- 64 16 Paul RC, RC N, SK V Some compounds of iron(III) with bidentate bases ransition Metal Chemistry 1977;2:152–154 17 Li K, Zeng Z, Xiong J, Yan L, Guo H, Liu S, et al Fabrication of mesoporous Fe3O4@SiO2@CTAB–SiO2 magnetic microspheres with a core/shell structure and their efficient adsorption performance for the removal of trace PFOS from water Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 2015;465:113–123 18 Zhao J, Milanova M, MMCG W, V D Surface modification of TiO2 nanoparticles with silane coupling agents Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 2012;413:273–279 19 Melzak KA, Sherwood CS, Turner RFB, CA H Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions Journal of Colloid and Interface Science 1996;181:635–644 20 Elkins KM Determination of DNA Quality and Quantity Using UV-Vis Spectroscopy Forensic DNA Biology 2013;p 59–62 21 Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986;51:263– 273 63 Science & Technology Development Journal – Natural Sciences, 3(1):55- 64 Original Research Synthesis of magnetite nanoparticles with different sizes for application in DNA extraction from biological sample Bui Trung Thanh1,2 , Pham Hung Van3,∗ , Tran Hoang Hai4 ABSTRACT Serum samples containing hepatitis B virus (HBV) used as biological sample to examine DNA extraction capability at different nanoparticles (NPs) sizes and amounts were investigated in this study The magnetite (Fe3 O4 ) NPs synthesized by co-precipitation method were size about of 10 nm with the magnetic saturation of 60.02 emu/g Using solvothermal method with different synthesis times obtained the Fe3 O4 NPs sizes of about 32, 60 and 100 nm with the magnetic saturations of 88.82, 83.69 and 80.29 emu/g, respectively The synthesized Fe3 O4 NPs had superparamagnetic properties By Stöber method, the Fe3 O4 NPs were coated with SiO2 (Fe3 O4 @SiO2 ) to form Si-OH groups through which the NPs could adsorb DNA via hydrogen bonds The properties, morphology, size and DNA adsorption capacity of the NPs were determined by X-ray diffraction (XRD), transmission electron microscopy (TEM), vibrating sample magnetometer (VSM), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), Brunauer–Emmett–Teller (BET) method, and polymerase chain reaction (PCR) The results showed that synthesized Fe3 O4 @SiO2 NPs could extract HBV DNA The Fe3 O4 @SiO2 NPs obtained from 10 nm Fe3 O4 NPs had better HBV DNA extraction At high HBV concentration (109 copies/mL), using or mg of Fe3 O4 @SiO2 NPs (10 nm Fe3 O4 ) could extract more HBV DNA than using mg Key words: DNA, Extraction, Magnetite, Nanoparticles, Sizes Department of Physics, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City Solid State Physics Department, University of Science, VNUHCM Phan Chau Trinh University Institute of Physics, Ho Chi Minh City Correspondence Pham Hung Van, Phan Chau Trinh University Email: van.phh@gmail.com History • Received: 31-10-2018 • Accepted: 27-3-2019 • Published: 31-3-2019 DOI : https://doi.org/10.32508/stdjns.v3i1.726 Copyright © VNU-HCM Press This is an openaccess article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International license Cite this article : Trung Thanh B, Hung Van P, Hoang Hai T Synthesis of magnetite nanoparticles with different sizes for application in DNA extraction from biological sample Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 3(1):55-64 64 ... ch đại DNA tách chie´ˆ t 20 Chứng nội cho vào mẫu HBV để kiểm tra khả tách chie´ˆ t DNA hạt nano, sản phẩm tách chie´ˆ t có DNA chứng nội 57 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự... Phổ FTIR hạt nano Fe3O4@ SiO2 với kích thước hạt Fe3O4a) 10, b) 32, c) 60 d) 100 nm DNA HBV PCR kỹ thuật khue´ˆ ch đại đoạn DNA đích thành nhiều DNA, ne´ˆ u bắt đầu DNA đích mạch đơi DNA, sau... HBV chứng nội tách chie´ˆ t hạt nano Fe3 O4 @SiO2 với kích thước hạt Fe3 O4 tương ứng a) 10, b) 32, c) 60 d) 100 nm; gie´ˆ ng (-) chứa mẫu âm HBV (0 copies/mL) chứng nội tách chie´ˆ t hạt nano