Tóm tắt luận án Tiến sĩ Y học: Thích nghi chủng sản xuất vắc xin dại Vnukovo-32 trên tế bào Vero để thử nghiệm sản xuất vắc xin

Luận án với mục tiêu: thích nghi chủng sản xuất vắc xin dại Vnukovo-32 trên tế bào Vero; điều chế chủng vi rút gốc và chủng sản suất; tiến hành thử nghiệm sản xuất vắc xin. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo luận án.

Bộ giáo dục v đo tạo Bộ Y tế Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ơng ********** Nguyễn Thị Kiều Anh Thích nghi chủng sản xuất vắc xin dại Vnukovo-32 tế bo Vero để thử nghiệm sản xuất vắc xin Chuyên ngành: Virút học Mã số: 62 72 68 05 Tóm tắt Luận án tiến sĩ y học Hà nội - 2010 Công trình đợc hoàn thành tại: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng Ngời hớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Hạnh PGS.TS Đinh Kim Xuyến Phản biện 1: GS.TSKH Nguyễn Văn Dịp Phản biện 2: GS.TSKH Nguyễn Thu Vân Phản biện 3: PGS.TS Lê Văn Phủng Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc tổ chức tại: Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ơng Vào hồi: 14 00 ngày 25 tháng năm 2010 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Th viện Quốc gia; - Th− viƯn ViƯn VƯ sinh DÞch tƠ Trung ơng Các chữ viết tắt CPE Cytopathic Effect (huỷ hoại tế bào) CTT Chuột tăng trọng ELISA Emzym Linked Immuno-Sorbent Assay (kỹ thuật miễn dịch gắn men) G protein Glycoprotein KD Kilodalton KV 1000 vßng/phót MCB Master Cell Bank (ngân hàng tế bào giống gốc) MOI Multiplicity of Infection (liỊu g©y nhiƠm) MSV Master Seed Virus (Chđng vi rót gièng gèc) MWCO Molecular weight cut off (giíi h¹n träng lợng phân tử) N protein Nucleoprotein RFFIT Rapid Fluorescence Focus Inhibition Test (thử nghiệm ức chế tạo đám huỳnh quang nhanh) SLT Siêu ly tâm TB Tế bào TCYTTG Tổ chøc Y tÕ ThÕ giíi VR Vi rót WCB Working Cell Bank (ngân hàng tế bào sản xuất) WSV Working Seed Virus (Chủng vi rút giống sản xuất) Đặt vấn đề Bệnh dại vấn đề y tế cộng đồng nghiêm trọng số nớc châu Phi, châu Đặc biệt năm gần bệnh dại có xu hớng gia tăng diễn biến phức tạp số quốc gia châu ¸ nh− Trung Qc, Hµn Qc, Philippine vµ ViƯt Nam Bệnh dại lên có tỷ lệ tử vong gần nh 100%, nhng bệnh phòng vắc xin Từ năm 1976, Việt Nam sử dụng vắc xin phòng dại đợc sản xuất não chuột ổ theo phơng pháp Fuenzalida Do vắc xin Fuenzalida cha đợc tinh khiết nên gây phản ứng dị ứng, nặng dẫn tới viêm não tuỷ dị ứng với myeline Tháng năm 2007, Bộ Y tế thức định ngừng sản xuất sử dụng vắc xin dại Fuenzalida, thay vắc xin dại sản xuất tế bào Hiện Việt Nam cha sản xuất vắc xin dại tế bào nớc Vì lý thực đề tài Thích nghi chủng sản xuất vắc xin dại Vnukovo-32 tế bào Vero để thử nghiệm sản xuất vắc xin Mục tiêu nghiên cứu Thích nghi chủng sản xuất vắc xin dại Vnukovo-32 tế bào Vero Điều chế chủng vi rút gốc chủng sản xuất Thử nghiệm sản xuất vắc xin Các đóng góp luận án Xây dựng đợc ngân hàng tế bào Vero - CCL81 WCB đạt tiêu chuẩn tế bào dùng cho sản xuất vắc xin chế phẩm sinh học; Thích nghi đợc chủng sản xuất dại Vnukovo-32 dòng tế bào Vero, chủng thích nghi đợc đặt tên Vnukovo-V06; Xây dựng đợc ngân hàng chủng giống vi rút sản xuất vắc xin dại tế bào Vero Vnukovo-V06 đạt tiêu chuẩn chủng giống sản xuất vắc xin dại tế bào TCYTTG; Nghiên cứu đợc quy trình sản xuất vắc xin dại tinh chế tế bào Vero đạt hiệu st 28,8 ± 0,7%; S¶n xt thư nghiƯm đợc 03 loạt vắc xin dại tinh chế tế bào Vero, đạt tiêu chuẩn vắc xin dại TCYTTG vô khuẩn, an toàn chung, an toàn đặc hiệu, pH, protein công hiệu Cấu trúc luận án Luận án dày 138 trang không kể phụ lục, gồm chơng, 15 bảng, biểu đồ, 20 hình, 195 tài liệu tham khảo trong, nớc phụ lục Bố cục luận án gồm: đặt vấn đề trang, tổng quan 35 trang, vật liệu phơng pháp nghiên cứu 20 trang, kết 28 trang, bàn luận 28 trang, kết luận trang, kiến nghị trang, báo có nội dung liên quan với luận án đợc công bố Chơng Tổng quan 1.1 Vi rút dại Các đặc điểm sinh học vi rút d¹i: Vi rót d¹i thc nhãm Lyssavirus, hä Rhabdoviridae Lyssavirus chia thành 10 kiểu gien, có kiểu gien gây bệnh dại, có kiểu gien có vắc xin phòng bệnh Tuy nhiên, vắc xin có khả gây đáp ứng miễn dịch chéo với vi rút gây bệnh dại thuộc kiểu gien khác Vi rút dại có protein cấu trúc, protein có tính kháng nguyên, nhng có G N protein có vai trò đáp ứng miễn dịch bảo vệ thành phần thiếu vắc xin Dịch tễ học vi rút dại: Bệnh dại phổ biến toàn cầu, từ châu Âu đến châu á, châu Phi, Mỹ La Tinh trừ số vùng bệnh dại nh Vơng Quốc Anh, Nhật Bản, vùng Bắc cực châu Đại Dơng vùng đất biệt lập Theo báo cáo TCYTTG, 86 quốc gia khu vực có giám sát bệnh dại có tới 68 quốc gia có ổ dịch dại tự nhiên, chủ yếu loài động vật hoang dã nh chồn (59%), dơi (15%), cầy (15%), cáo (3%) Hàng năm có khoảng 40.000 50.000 ngời chết bệnh dại, 99% số ca tử vong đợc thông báo từ nớc phát triển châu Phi, châu vùng Nam Mỹ 1.2 Các hệ vắc xin dại Các vắc xin sản xuất mô thần kinh: vắc xin Semple sản xuất mô não động vật trởng thành (thỏ, bê ); vắc xin Fuenzalida sản xuất mô thần kinh động vật sơ sinh (chuột ổ, thỏ dứt sữa ) Các vắc xin có hạn sử dụng ngắn, thờng dới tháng, công hiệu vấn đề đáng lo ngại thờng gây dị ứng, nặng viêm não tuỷ dị ứng với Myelin dẫn tới tử vong Các vắc xin sản xuất mô mô thần kinh: vắc xin sản xuất phôi vịt, phôi gà tinh chế Vắc xin có hiệu lực bảo vệ tốt độ an toàn cao Tuy nhiên gây dị ứng cho ngời bị dị ứng với thành phần trứng Các vắc xin sản xuất tế bào: vắc xin sản xuất tế bào tiên phát (thận chuột đất vàng tiên phát, thận chó tiên phát, tế bào phôi gà tiên phát); vắc xin sản xuất tế bào lỡng bội (tÕ bµo l−ìng béi phỉi ng−êi WI-38, MRC5, tÕ bµo lỡng bội bào thai khỉ); vắc xin sản xuất tế bào thờng trực (tế bào Vero) Các vắc xin sản xuất tế bào có độ an toàn hiệu bảo vệ cao Các vắc xin sản xuất theo phơng pháp tái tổ hợp: chèn gien N G vi rút dại vào genome vi rút Adeno, Baculo, Orthopox BCG để sản xuất vắc xin vi rút tái tổ hợp Các vắc xin đợc trộn với thức ăn để gây miễn dịch cho động vật hoang dại, cha sử dụng cho ngời 1.3 Tế bào dùng sản xuất vắc xin dại Các tế bào sử dụng sản xuất vắc xin dại phải thoả mãn yêu cầu chung tế bào sử dụng cho sản xuất vắc xin chế phẩm sinh học nh không nhiễm yếu tè nhiÕm trïng tiÒm Èn (vi khuÈn, nÊm, mycoplasma, mycobacteria, rickettsia, protozoa, vi rút, axít nucleic protein gây bệnh (bệnh bò điên), không gây ung th, đặc tính nuôi cấy, cấy truyền ổn định từ MCB tế bào giai đoạn cuối quy trình sản xuất Ngoài dòng tế bào phải nhạy cảm với vi rút dại Tế bào sử dụng để sản xuất vắc xin trừ dòng tế bào tiên phát nên xây dựng ngân hàng tế bào bao gồm MCB WCB Các tế bào thuộc tầng MCB phải đợc kiểm tra đầy đủ đặc tính theo yêu cầu, nhng tế bào WCB cần kiểm tra yếu tố nhiễm trùng tiềm ẩn mà tế bào WCB bị phơi nhiễm cấy truyền từ MCB 1.4 Chủng sản xuất vắc xin dại Ngân hàng chủng giống sản xuất vắc xin đợc xây dựng tơng tự nh ngân hàng chủng giống tế bào Yêu cầu chủng sản xuất phải đợc lựa chọn cách cẩn trọng đợc kiểm tra đặc tính nh tính sinh miễn dịch, đảm bảo chủng cố định, ổn định đặc tính cấy truyền, di truyền, giảm độc lực, không nhiễm vi khuẩn, nấm, mycoplasma, vi rút ngoại lai phải gây đợc miễn dịch chống lại bệnh dại vùng Thông thờng kiểm tra chất lợng chủng giống đợc thực đầy đủ tầng MSV, vi rút WSV cần kiĨm tra c¸c u tè nhiƠm khn tiỊm Èn cã thể xuất trình nhân giống từ MSV đến WSV Hệ thống chủng sản xuất vắc xin dại Quèc tÕ bao gåm: chñng Pasteur Paris, chñng PV-12, chñng Pitman-Moore (PM), chñng CVS-27, chñng CVS-11, chñng LEP, chñng HEP, chđng Kelev, chđng ERA, chđng SAD, chđng Beijing vµ chđng Vnukovo-32 1.5 Các phơng pháp tinh chế vi rút dại ứng dụng sản xuất vắc xin Cô đặc tinh chế vi rút dại ly tâm phân vùng: Có nhiều quy trình công nghệ sản xuất vắc xin dại ứng dụng ly tâm phân vùng để cô đặc, tinh chế vi rút dại nh : vắc xin sản xuất tế bào sợi phôi gà tiên phát, tế bào lỡng bội, vắc xin sản xuất tế bào Vero, sử dụng sử dụng ly tâm phân vùng hai lần loại bỏ tối đa ADN tế bào thu hoạch hạt vi rút tinh khiết với sản lợng lớn Tinh chế siêu ly tâm qua dung dịch đờng nồng độ liên tục: vắc xin dại tế bào sử dụng quy trình cô đặc siêu lọc tinh chế siêu ly tâm qua dung dịch đờng nồng độ liên tục bao gồm: vắc xin sản xuất tế bào Vero; vắc xin sản xuất phôi gà tinh chế; vắc xin tế bào lỡng bội ngời; vắc xin sản xuất tế bào phôi gà tiên phát Phơng pháp cô đặc siêu lọc tinh chế siêu ly tâm phơng pháp mở rộng quy mô sản xuất (scale up) đạt hiệu cao Cô đặc vi rút siêu lọc, tinh chế sắc ký cột, cô đặc tinh chế sắc ký cột: Hiện với phát triển phức hợp gắn công nghệ sắc ký cột, nhiều nhà sản xuất vacine sử dụng công nghệ cô đặc tinh chế vi rút v¾c xin b»ng s¾c ký cho hiƯu st cao, chÊt lợng tốt giá thành giảm nh lọc qua gel sepharose 6B sau chạy sắc ký cột DEAE sephadex A50; sư dơng cét DEAE sepharose CL 6B; sepharose CL 6B Hiệu tinh chế sắc ký cột cao, kỹ thuật tinh chế cột đơn giản giá thành thấp so với siêu ly tâm Đây công nghệ đại đợc ứng dụng sản xuất vắc xin dại sử dụng cho ngời Có nhiều phơng pháp cô đặc tinh chế vi rút dại ứng dụng sản xuất vắc xin nh cô đặc siêu lọc - tinh chế sắc ký cột; cô đặc siêu lọc - tinh chế siêu ly tâm cô đặc - tinh chế ly tâm phân vùng Mỗi quy trình có u nhợc điểm yêu cầu kỹ thuật riêng, tuỳ theo điều kiện mạnh kỹ thuật nhà sản xuất để lựa chọn quy trình sản xuất phù hợp Chơng Vật liệu, phơng pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu - Chủng vi rút sản xuất vắc xin Vnukovo-32 đời 29 Viện Bại Liệt Viêm não Mát xơ va cung cấp; chủng vi rút thử thách CVS Trung tâm nghiên cøu khoa häc Quèc Gia Ph¸p cung cÊp - TÕ bào Vero CCL 81 TCYTTG cung cấp cho sở sản xuất vắc xin; tế bào CER, MRC5, WI 38 trờng Đại học Y Oita, Nhật Bản cung cÊp; tÕ bµo NA2 ViƯn Pasteur Paris cung cấp; tế bào BHK 21, BSR Trung tâm nghiên cứu khoa học Quốc Gia Pháp cung cấp - Động vật thí nghiệm, môi trờng, hoá chất, sinh phẩm thiết bị cần thiết để nuôi cấy tế bào, cô đặc tinh chế vi rút, kiểm định chất lợng chủng giống vắc xin tinh chế 2.2 Phơng pháp nghiên cứu: thử nghiệm phòng thí nghiệm 2.2.1 Thích nghi sản xuất chủng vi rút giống 2.2.1.1 Thích nghi chủng giống: phơng pháp cấy truyền liên tiếp Xác định khả xâm nhập chủng gốc Vnukovo-32 tế bào Vero; MOI thích hợp (gây nhiễm với MOI khác từ 1VR/100TB 1VR/1TB, chuẩn độ hiệu giá vi rút điều kiện Chọn MOI thấp, đạt đợc hiệu giá cao) xác định đờng cong phát triển chủng gốc Vnukovo-32 tế bào Vero (tất thử nghiệm đợc tiến hành 03 lần để xác định độ lặp lại) Sử dụng vi rút pha phát triển hàm số mũ gây nhiễm cho tế bào đời cấy truyền với MOI thích hợp đợc xác định Khi hiệu giá vi rút đạt khoảng 107 LD50/ml (đời cấy truyền thứ n) ổn định qua ba đời cấy truyền (n+2) sử dụng đời n lµm MSV vµ n+1 lµ WSV, n+2 lµm vi rút sản xuất vắc xin 2.2.1.2 Điều chế chủng vi rút giống gốc giống sản xuất: theo hớng dẫn sản xuất chủng giống TCYTTG Điều chế MSV: Sau vi rút thích nghi tế bào Vero, xác định lại MOI tối u chủng thÝch nghi CÊy trun chđng thÝch nghi víi MOI thÝch hợp, thu hoạch vi rút đỉnh cao pha sinh trởng, ly tâm loại bỏ tế bào, chia 1,5ml/tuýp, bảo quản chủng giống gốc -80oC nitrogen lỏng §iỊu chÕ WSV: sư dơng 03 MSV trén ®Ịu, gây nhiễm với MOI thích hợp tế bào Vero Quy trình nhân giống WSV tơng tự nh nhân giống MSV 2.2.2 KiĨm tra chÊt l−ỵng chđng gièng: theo h−íng dÉn kiĨm tra chÊt l−ỵng chđng gièng cđa TCYTTG ™ Kiểm tra vi khuẩn, nấm mycoplasma: sử dụng môi trờng thioglycholate, soybean, thạch thờng salbouraud cấy1ml vi rút/ tuýp Tổng số 10 tuýp Theo dõi 14 ngày Xác ®Þnh mycoplasma b»ng hai kü thuËt lai ghÐp huúnh quang PCR Kiểm tra chủng cố định: Trên hệ thống tế bào: cấy truyền mù lần chủng thích nghi chủng Vnukovo-32 gốc dòng tÕ bµo cã nguån gèc tõ ng−êi (WI-38; MRC5); tõ khØ (Vero B19, Vero 1009, CCL81 vµ BHK); tõ gµ (CER); từ chuột (NA2) Xác định tợng CPE, so sánh với chủng gốc Vnukovo-32 Chủng Vnukovo-32 chủng không gây CPE tế bào Trên động vật: tiêm ®−êng n·o chđng thÝch nghi vµ chđng Vnukovo-32 cho cht Swiss ỉ ngµy ti vµ cht 11 – 13g Theo dõi chuột 21 ngày, so sánh biểu bƯnh lý trªn cht cđa chđng thÝch nghi víi chđng gèc Vnukovo-32 Chđng gèc Vnukovo-32 g©y liƯt cht ỉ tõ ngày thứ 3, gây liệt chuột trởng thành từ ngày thứ sau tiêm đờng não tợng gây liệt chuột cố định vòng 21 ngày Kiểm tra độc lực: sử dụng kỹ thuật invivo, invitro di truyền học để xác định chủng cố định Thông qua kiểm tra chủng cố định (trên hệ thống tế bào động vật) Cloning gien P (gien độc lực vi rút) giải trình tự gien So sánh trình tự nucleotide gien P cđa hai chđng thÝch nghi vµ chđng Vnukovo32 ™ Kiểm tra vi rút ngoại lai: Chủng vi rút thích nghi đợc trung hoà với kháng thể kháng dại trớc tiến hành thử nghiệm xác định vi rút ngoại lai Xác định vi rút gây huỷ hoại tế bào: cấy truyền mù 03 lần hỗn dịch vi rút sau trung hoà với huyết lên dòng tế bào NA, CER, BSR, Vero, WI38, MRC5 Song song cấy lô đối chứng vi rút huyết Theo dõi tợng huỷ hoại tế bào Xác định vi rút gây bệnh động vật: Tiêm ổ bụng tiêm não cho chuột Swiss æ ngµy tuæi vµ chuét 11 – 13g, song song tiêm lô đối chứng vi rút chứng huyết Theo dâi hiƯn t−ỵng bƯnh lý cđa cht − Xác định vi rút ngoại lai phơng pháp hiển vi điện tử: nhuộm âm hỗn dịch vi rút lát cắt mỏng tế bào gây nhiễm vi rút Kiểm tra khả sinh miễn dịch: Bất hoạt vi rút propiolactone nồng độ cuối 1/4.000, nhiƯt ®é 40C 24 giê, tiÕp ®ã 370C Tiêm 0,5 ml hỗn dịch vi rút bất hoạt vào ổ bụng chuột 11 13g, sau ngày tiêm mũi thứ hai Lấy máu chuột sau ngày tiêm mũi thứ hai, xác định hiệu giá kháng thể trung hoà kháng dại huyết cht b»ng thư nghiƯm RFFIT vµ ELISA Cloning gien G N, giải trình tự gien, so sánh với trình tù nucleotide gien G vµ N cđa chđng gèc Vnukovo-32 2.2.3 Sản xuất thử nghiệm vắc xin: 2.2.3.1 Nghiên cứu quy trình sản xuất: toàn giai đoạn đợc thực 03 lần để xác định tính lặp lại thử nghiệm Kết đợc tính giá trị trung bình thử nghiệm 11 Hình 3.1 Hình ảnh tế bào sau ngày gây nhiễm vi rút P1 (trái) P6 (phải) Hình 3.1 cho thấy đời P6 có nhiều tế bào nhiƠm hnh quang, ®ã ë ®êi P1 cã tế bào nhiễm huỳnh quang Điều khẳng định chủng Vnukovo-32 thích nghi tế bào Vero 3.1.3 Kết xác định đặc tính chủng thích nghi tế bào Vero Kết xác định đặc tính ổn định hiệu giá chủng thích nghi Bảng 3 Hiệu giá trung bình vi rút đời cấy truyền P6, P7, P8 Đời cÊy trun P6 P7 P8 HiƯu gi¸ vi rót FFU/ml 108,2 ± 0,1 108,1 ± 0,03 108,1 ± 0,1 HiÖu gi¸ vi rót LD50/ml 10-7,1 ± 0,02 10-7,1 ± 0,1 10-7,0 0,08 Từ đời P6 qua đời cấy truyền liên tiếp P7, P8 hiệu giá vi rút ổn định khoảng 10-7LD50/ml Do lựa chọn đời P6 làm MSV, P7 làm WSV P8 làm vi rút vắc xin phù hợp, đời P5 đợc giữ lại làm Parent Seed Virus (vi rút cha mẹ) Chủng vi rút dại thích nghi tế bào Vero sau đời cấy truyền đợc đặt tên Vnukovo-V06 Kết xác định MOI tối u chủng thích nghi Vnukovo-V06 Vero Bảng 3.4 Hiệu giá trung bình chủng đ thích nghi VnukovoV06 với liều gây nhiễm khác Liều gây nhiễm 0,01 MOI 0,05 MOI 0,1 MOI 0,3 MOI 0,6 MOI HiƯu gi¸ LD50/ml 10-6,33 ± 0,05 10-7,33 ± 0,1 10-7,12 ± 0,1 10-7,0 ± 0,02 10-7,28 ± 0,1 KÕt qu¶ cho thÊy liỊu g©y nhiƠm tèi −u cđa chđng gièng gèc Vnukovo - V06 lµ 0,05 MOI (5VR/100TB) 12 3.2 KÕt điều chế chủng giống kiểm tra chất lợng chủng giống 3.2.1 Kết điều chế chủng giống gốc giống sản xuất Tạo đợc ngân hàng chủng vi rút sản xuất vắc xin tế bào Vero Vnukovo-V06 Tổng số nhân giống đợc 318 tuýp giống gốc MSVcó hiệu giá 10-7,12LD50/ml 2000 tuýp WSV có hiệu giá 107,1 LD50/ml WSV 3.2.2 Kết kiểm tra chất lợng chủng giống Kết kiểm tra vi khuẩn, nÊm vµ mycoplasma: chđng gièng gèc MSV vµ WSV Vnukovo-V06 không nhiễm vi khuẩn, nấm mycoplasma Thang chuÈn 3,4 Chđng Vnukovo-V06 MSV 5,6 Chủng Vnukovo-V06 WSV Chứng ©m Không có mẫu Chứng dơng on ADN khuch đại đặc hiệu: 270bp H×nh 3.2 : H×nh ảnh điện di sản phẩm PCR x¸c định mycoplasma Vnukovo-V06 MSV v WSV Kết kiểm tra nhận dạng Hình 3.3: H×nh ảnh vi rót dại tế bào Vero quan sát KHVĐTđộ phóng đại 25.000 lần (trái) nhuộm Mab kháng N FITC (phải) 13 Kết kiểm tra vi rút ngoại lai Các dòng tế bào NA, CER, BSR, Vero (CCL81, B19 vµ 1009), WI38 vµ MRC5 sau lần cấy truyền mù hỗn dịch vi rút MSV trung hoà với 8250IU kháng thể kháng dại không xuất huỷ hoại tế bào Chuột nhắt trắng 11 13g chuột ổ tiêm MSV sau trung hoà với 8250IU kháng thể kháng dại hoàn toàn khoẻ mạnh sau 21 ngày theo dõi Lô chuột tiêm vi rút không trung hoà chuột liệt điển hình Kiểm tra vi rút ngoại lai phơng pháp HVĐT không thấy hình ảnh vi rút ngoại lai hỗn dịch vi rút nh tế bào gây nhiễm vi rút Kiểm tra chủng cố định Chng Vnukovo-V06 gây liệt chuột ổ tiêm đờng não vào ngày thứ 3, gây liệt chuột tuần tuổi vào ngày thứ ổn định 21 ngày Chuột liệt điển hình giống thời gian bệnh học nh lô chuột tiêm chủng Vnukovo-32 Lô chuột đợc tiêm hỗn dịch vi rút sau trung hoà với 8250IU kháng thể hoàn toàn khoẻ mạnh sau 21 ngày theo dõi Các dòng tế bào Vero, BHK, WI38, MRC5, NA2 CER tợng huỷ hoại tế bào gây nhiễm chủng Vnukovo-V06 nh lô tế bào gây nhiễm chủng Vnukovo-32 đối chứng Nhuộm tế bào với Mab kháng N gắn FITC thấy có hình ảnh phát quang đặc hiệu bào tơng tất dòng tế bào gây nhiễm vi rút VnukovoV06 Hình 3.4: Hình ảnh tế bào Vero sau 14 ngày gây nhiễm VnukovoV06 quan sát kính hiển vi soi ngợc (trái) nhuộm huỳnh quang kháng thể đơn dòng kháng N vi rút dại gắn FITC (phải) 14 Kết kiểm tra đặc tính sinh miễn dịch Hiệu giá kháng thể kháng dại chuột trớc tiêm miễn dịch đơn vị ELISA RFFIT, hiệu giá kháng thể trung hoà sau mũi tiêm chủng Vnukovo-V06 (10 7,14LD50/ml) cô đặc 10 lần, bất hoạt đạt 0,97IU/ml (RFFIT) 1,2 IU/ml (ELISA) Kết kiểm tra trình tự nucleotide gien mã hoá cho G, P N protein chủng thích nghi, so sánh với chủng gốc Trình tự nucleotide gien N, P G chủng thÝch nghi Vnukovo- V06 trïng khíp 100% víi tr×nh tù nucleotide gien chủng gốc Vnukovo-32 3.3 Kết sản xuất thử nghiệm vắc xin 3.3.1 Kết nghiên cứu quy trình sản xuất thử nghiệm vắc xin dại tế bào Vero 3.3.1.1 Quy trình gây nhiễm thu hoạch vi rút Nuôi cấy tế bào líp kÝn 80%, cÊy vi rót víi MOI 0,05 (5VR/100TB); môi trờng MEM có 2%FCS Sau ngày gây nhiễm lấy mẫu kiểm tra hiệu giá, rửa tế bào PBS (-), nu«i cÊy vi rót b»ng parker pH 7,4 Bảng 3.5: Hiệu giá trung bình vi rút lần gặt khác Ngày gặt 10 ngày 13 ngày 16 ngày Hiệu giá VR 10- 5,9 ± 0,1 10 -7,0 ± 0,05 10 -7,1 ± 0,1 10 -6,9 ± 0,1 10 -5,8 ± 0,15 (LD50/ml) Thu hoạch loạt gặt ngày thứ 7, 10 13 vi rút có hiệu giá >106,0 LD50/ml, ly tâm 3.500 vòng/ phút 30 phút lấy nớc lọc qua màng lọc 0,45m, bất hoạt propiolacton 1/4.000 24 giê ë 4oC, sau ®ã 37oC 3.3.1.2 Quy trình cô đặc bất hoạt vi rút 15 Hiệu giá G protein (ELISA) Hiệu giá G protein qua trình cô đặc màng lọc khác 250 200 10 10KKD 100KD 100K 300KD 300K 150 100 50 X1 X2 X5 X 10 X 15 X 20 Số lần cô đặc Biểu 3.3 Hiệu giá G protein trung bình qua trình cô đặc màng lọc 10KD, 100KD 300KD Cô đặc vi rút màng lọc có giới hạn trọng lợng phân tử khác 10KD, 100KD 300KD điều kiện: thể tích lọc 300ml, màng lọc 50cm2, áp lực dòng chảy Bar, áp lực nén màng 0,3 Bar Kết cho thấy hiệu giá vi rút đạt cao màng lọc 100KD, tiếp đến màng lọc 10KD sau màng lọc 300KD Đối với màng lọc 100KD hiệu giá vi rút đạt cao mức độ cô đặc 10 lần 3.3.1.3 Quy trình tinh chế vi rót Thư nghiƯm tinh chÕ b»ng s¾c ký cét cellulose fine sulfate cho thấy hiệu suất tinh chế đạt 14,9 0,25% (CV: 1,6) protein toàn phần dao ®éng kho¶ng 0,22 ± 0,01 mg/ml (CV: 9,3) Thư nghiệm tinh chế màng vi lọc tiếp tuyến khác 0,45; 0,22; 0,1 m màng siêu lọc có giới hạn trọng lợng phân tử 100KD, 300KD để tinh chế vi rút Kết loại bỏ đợc 91,7 2,2% protein toàn phần (protein TP), nhng G protein tới 89 5%; hàm lợng protein TP sản phẩm cuối đạt 0,5 0,1 mg/ml Thử nghiệm tinh chế siêu ly tâm qua dung dịch đờng có nồng độ liên tục 10 40% kết cho thÊy: 16 B¶ng 3.6 KÕt qu¶ tinh chÕ vi rút dại siêu ly tâm qua dung dịch đờng 10 40% với tốc độ thời gian khác Tốc độ Hiệu giá vi rút (Đơn vị ELISA) thêi gian Tr−íc SLT Sau SLT Protein (mg/ml) HiƯu st Tr−íc (%) SLT SLT Sau SLT Protein th¶i (%) 35KV/17giê 6156 ± 5,8 4106 ± 5,1 66,7 ± 0,01 57 ± 0,8 5,4 ± 0,2 90,4 ± 0,3 38KV/18giê 6004 ± 15 4012 ± 6,8 66,8 ± 0,05 53 ± 2,1 5,16 ± 0,1 90,3 ± 0,1 40KV/15giê 6118 ± 15 4100 ± 11,5 67,01 ± 0,3 55 ± 1,2 5,52 ± 0,06 90 ± 0,3 B¶ng 3.6 cho thấy siêu ly tâm tốc độ từ 35KV đến 40KV 15 18 hiệu suất đạt đợc 66,7 0,01% đến 67,01 0,3% hàm lợng protein loại bá tõ 90 ± 0,3% ®Õn 90,4 ± 0,3% TÊt giá trị X X 2SD; CV từ 0,1 đến So sánh hiệu suất vi rút đạt đợc ly tâm 35KV/17 giờ; 38KV/ 18 40KV/15 test Anova cho thấy sù kh¸c biƯt víi P = 0,192 (> 0,05) Qua thử nghiệm tinh chế vi rút sắc ký cột CS, lọc tiếp tuyến siêu ly tâm Chúng lựa chọn quy trình tinh chế vi rút siêu ly tâm qua dung dịch đờng nồng độ liên tục 10 40% 3.3.2 Quy trình sản xuất vắc xin dại thử nghiệm tế bào Vero đợc lựa chọn Nuôi cấy tế bào Vero lớp (đời 142), tÕ bµo kÝn 80% CÊy vi rót Vnukovo-V06 WSV với MOI l 5VR/100TB Thêm môi trờng MEM 2% FCS, đ ngµy − Rưa tÕ bµo b»ng PBS lần Cho môi trờng Parker không serum pH 7,4 Thu hoạch vi rút ngày thứ 7, 10 13 sau gây nhiễm Kiểm tra hiệu giá vi rút, chọn lô gặt có hiệu giá >10-6,0 LD50/ml Ly tâm 3.500 vòng/ phút/ 30 phút Loại bỏ cặn; nớc đợc lọc qua màng lọc 0,45 m 17 Bất hoạt propiolactone nồng độ cuối 1/4000 24 giờ, tiếp ủ 370C/ Cô đặc 10 lần màng 100KD, áp lực dòng chảy Bar, nén 0,3 Bar Siêu ly tâm 35.000 vòng/ phút x 17 qua nồng độ đờng liên tục 10 40% Thu hoạch phân đoạn chứa pick G protein Chạy trao đổi ion lần với PBS pH 7,4 máy siêu lọc màng 10KD để loại bỏ đờng Bán thành phẩm cất -30oC Kiểm tra bán thành phẩm vô khuẩn, bất hoạt, protein công hiệu (ELISA) Pha vắc xin PBS (-) theo hiệu giá vắc xin bán thành phẩm, kiểm tra chất lợng vắc xin thư nghiƯm 3.3.3 KÕt qu¶ s¶n xt thư nghiƯm 03 loạt vắc xin dại tinh chế quy trình đợc xây dựng Bảng 3.7 Kết kiểm định nơi sản xuất 03 loạt vắc xin KQ An toàn An toàn Protein TP Công hiệu Vô kiểm chung đặc hiệu khuẩn (IU/ml) (g/ml) định (CTT) (CTT) pH 010808 Đạt 118% 155% 108 2,95 7,13 020908 Đạt 125% 162% 102 2,7 7,2 031008 Đạt 130% 173% 113 2,65 7,19 X CV Yêu cầu ADN tồn d Không đo đợc Không đo đợc Không đo đợc 124,3 163,39 107,6 ± 5,5 2,77 ± 0,16 7,17±0,03 4,8 5,5 5,1 5,8 0,5 Tiêu chuẩn vắc xin dại tế bào Vero TCYTTG Cht Cht kh kh ≥ 2,5 IU/ 7,0 – 7,4 10ng/ Đạt 180 g/ml mạnh, mạnh, liều liều tăng cân tăng cân 18 Bảng 3.8 Kết kiểm định 03 loạt vắc xin sản xuất thử nghiệm công ty vắc xin sinh phẩm số KQ kiểm định Vô khuẩn An toàn An toàn chung đặc hiƯu (CTT) (CTT) C«ng Protein TP hiƯu pH (IU/ml) 010808 §¹t 140% 207% 109 μg/ml 2,6 7,23 020908 §¹t 147,5% 181,9% 37 g/ml 2,7 7,3 031008 Đạt 110,6% 191,9% 110 g/ml 2,5 7,25 Kết kiểm định 03 loạt vắc xin dại tinh chế tế bào Vero sản xuất thử nghiệm đạt tiêu chuẩn TCYTTG vô khuẩn, an toàn, bất hoạt, pH, protein công hiệu Chơng Bn luận 4.1 Thích nghi chủng sản xuất vắc xin dại Vnukovo-32 tế bào Vero Nguồn gốc, chất lợng tế bào, chủng vi rút dùng thích nghi chủng sản xuất thử nghiệm vắc xin: Tế bào Vero CCL 81, đời 134 đợc mua theo vận đơn số 163983 Dòng tế bào TCYTTG lựa chọn cất giữ ngân hàng tế bào châu Âu (ECACC) để cung cấp cho nhà sản xuất vắc xin tế bào Vero sử dụng cho ngời Tế bào đợc nhân giống tạo WCB (đời 137) đợc kiĨm tra c¸c u tè nhiƠm trïng tiỊm Èn nh− vi khn, nÊm, mycoplasma, vi rót ngo¹i lai theo h−íng dẫn tạo ngân hàng tế bào dùng sản xuất vắc xin chế phẩm sinh học TCYTTG Hoa Kỳ Chủng Vnukovo- 32 viện Bại Liệt viêm não Mát xơ va cung cấp có đầy đủ hồ sơ hộ chiếu chủng Chủng đợc kiểm tra đảm bảo chất lợng chủng giống sản xuất vắc xin dại Chủng Vnukovo-32 nằm hệ thống chủng Quốc tế dùng để sản xuất vắc xin dại Nh nguyên liệu 19 nguồn sử dụng để thích nghi chủng giống nguyên liệu cho phép sử dụng để sản xuất vắc xin chÕ phÈm sinh häc sư dơng cho ng−êi ™ Ph−¬ng pháp thích nghi chủng giống: sử dụng phơng pháp cấy truyền liên tiếp, phơng pháp đợc ứng dụng để tạo nhiều chủng sản xuất vắc xin dại Việc xác định MOI tối u đờng cong phát triển chủng gốc Vnukovo-32 tế bào Vero để lựa chọn điều kiện tối u cho cấy truyền liên tiếp việc thích nghi chủng giống điều kiện tiên quyết, định thành công trình thích nghi Đối với chủng vi rút dại cố định liều gây nhiễm thờng khoảng 0,01 - 0,3 MOI Khi sử dụng liều gây nhiễm cao gây nên tợng ức chế cạnh tranh tạo hạt vi rút không hoàn chỉnh Các hạt vi rút không hoàn chỉnh khả gây nhiễm nhân lên, nhng lại cạnh tranh với hạt vi rút hoàn chỉnh làm giảm khả xâm nhập hạt vi rút hoàn chỉnh vào tế bào Song song với việc lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng gốc Vnukovo-32 tế bào Vero việc xác định biểu đồ phát triển vi rút dòng tế bào đóng vai trò quan trọng vào trình thích nghi thành công thích nghi Lựa chọn vi rút pha phát triển hàm số mũ để cấy truyền lần tiếp theo, hiệu giá vi rút giai đoạn thấp hiệu giá vi rút ë ®Ønh pha sinh tr−ëng nh−ng ë ®ã cã nhiỊu hạt vi rút hoàn chỉnh khả xâm nhập vào tế bào tốt so với vi rút thu hoạch đỉnh pha sinh trởng pha khác Việc xác định mức độ thích nghi chủng vi rút qua đời cấy truyền đợc thể hiệu giá vi rút đạt đợc qua đời cấy truyền mà đợc chứng minh xâm nhập, nhân lên vi rút tế bào Vero thông qua nhuộm tế bào gây nhiễm với kháng thể đơn dòng kháng N protein vi rút dại gắn huỳnh quang mức độ ổn định hiệu giá vi rút qua đời P6, P7, P8 20 Lùa chän ®êi cÊy trun P6 lµm MSV, P7 lµm WSV vµ P8 lµm vi rút sản xuất vắc xin phù hợp chủng Vnukovo-32 hoàn toàn thích nghi tế bào Vero đời cấy truyền thứ 6, ổn định hiệu giá biểu đồ phát triển qua ba đời cấy truyền (đỉnh cao hiệu giá đạt đợc ngày thứ 11 sau gây nhiễm) Hơn nữa, chủng Vnukovo- 32 gèc cho phÐp cÊy trun sau ®êi 35 (WSV) 10 đời để sản xuất vắc xin Chủng giống gốc Vnukovo-32 mà sử dụng để thích nghi tế bào Vero đời 29, tổng số ®êi cÊy trun cho phÐp sÏ lµ 16 ®êi Qua sáu đời cấy truyền liên tiếp tế bào Vero để tạo Vnukovo-V06 MSV 10 đời cấy truyền để làm WSV sản xuất vắc xin Nh vậy, ngân hàng chủng giống vi rút Vnukovo-V06 đạt tiêu chuẩn đảm bảo cung cấp đủ số lợng chủng giống cho sản xuất vắc xin 4.2 Điều chế chủng giống chất lợng chủng giống Phơng pháp tạo ngân hàng vi rút giống: đợc tuân thủ nghiêm ngặt theo hớng dẫn tạo ngân hàng chủng giống dùng cho sản xuất vắc xin chế phẩm sinh học TCYTTG Hoa Kỳ Chủng vi rút thích nghi Vnukovo-V06 đợc xây dựng hệ thống ngân hàng chủng giống tầng bao gåm vi rót gièng cha mĐ, MSV vµ WSV Chất lợng chủng giống: Ngân hàng chủng giống sản xuất vắc xin dại tế bào Vero Vnukovo-32 đợc kiểm tra đầy đủ đặc tính vi khuẩn, nấm, mycoplasma, độc lực, cố định, khả sinh miễn dịch vi rút ngoại lai theo hớng dẫn tạo ngân hàng chủng giống sản xuất vắc xin TCYTTG Hoa Kỳ Kiểm tra chủng giảm độc lực cố định: chủng Vnukovo-V06 đợc thích nghi cấy truyền 06 lần liên tiếp chủng Vnukovo-32 tế bào Vero Việc cấy truyền liên tiếp tạo nên chủng vi rút tăng độc lực, việc kiểm tra chủng cố định giảm độc lực điều vô quan trọng, định chủng sau thích nghi sử dụng để sản xuất vắc xin hay không Việc kiểm tra chủng giảm độc lực cố định đợc thực phối hợp nhiều thử nghiệm bao gồm thử nghiệm động vật, hệ thống tế bào phơng pháp di 21 truyền học (giải trình tự gien độc lực gien P, so sánh với chủng gốc Vnukovo-32) chứng minh chủng Vnukovo-V06 chủng cố định giảm độc lùc KiĨm tra c¸c u tè nhiƠm trïng tiỊm Èn: viƯc kiĨm tra c¸c u tè nhiƠm trïng tiỊm Èn (NTTA) xác định khả chủng giống vi rút bị nhiễm yếu tố NTTA phụ thuộc vào nguồn gèc cđa chđng vi rót còng nh− ngn gèc cđa tế bào nguyên liệu nguồn (môi trờng, trypsin, huyết sử dụng) sử dụng trình thích nghi, nh©n gièng chđng gièng vi rót Chđng gièng gèc Vnukovo-32 chủng đợc kiểm tra thoả mãn đầy đủ đặc tính chủng sản xuất vắc xin, chủng đợc chứng minh không nhiễm yếu tố nhiễm trùng tiềm ẩn TCYTTG công nhận chđng Vnukovo-32 thc hƯ thèng chđng gièng vi rót d¹i dùng sản xuất vắc xin sử dụng cho ngời Tế bào Vero sử dụng để thích nghi nh©n gièng chđng Vnukovo-V06 cã m· sè Vero - WHO CCL 81 đợc TCYTTG công nhận dòng tế bào đủ tiêu chuẩn dùng sản xuất vắc xin c¸c chÕ phÈm sinh häc sư dơng cho ng−êi TÕ bào Vero đợc nhập đời cấy truyền 134, sử dụng toàn nguyên liệu nguồn (môi trờng nuôi cấy tế bào, huyết thanh, trypsin môi trờng cất tế bào) sản phẩm thơng mại hoá đợc cấp phép cho sản xuất vắc xin chế phẩm sinh học để nhân giống WCB (đời 137) Tế bào WCB đợc kiểm tra xác định vô trùng, không nhiễm vi rút ngoại lai, kiểm tra nhận dạng theo hớng dẫn cách xây dựng kiểm tra ngân hàng tế bào sử dụng cho sản xuất vắc xin chế phẩm sinh học sử dụng cho ngời TCYTTG Các nguyên liệu nguồn dùng trình thích nghi nhân giống chủng giống Vnukovo-V06 nh môi trờng nuôi cấy tế bào, huyết bê bào thai, trypsin sản phẩm thơng mại dùng cho sản xuất vắc xin chế phẩm sinh học Chính vậy, yếu tố nhiễm trùng tiềm ẩn mà chủng Vnukovo-V06 phơi nhiễm 22 trình thích nghi tạo ngân hµng chđng vi rót gièng gèc chØ cã thĨ lµ vi khuẩn, nấm mycoplasma Vấn đề chủng bị phơi nhiễm với vi rút ngoại lai khó cã thĨ x¶y ViƯc kiĨm tra vi khn, nÊm mycoplasma đợc thực nghiêm ngặt giai đoạn thích nghi chủng nh tạo ngân hàng chủng vi rút giống, kỹ thuật sử dụng để kiểm tra vi khuẩn, nấm mycoplasma có độ nhạy độ đặc hiệu cao (môi trờng thioglycholate, soybean PCR phát mycoplasma) đảm bảo chủng hoàn toàn không nhiễm vi khuẩn, nấm mycoplasma Tuy việc thích nghi nhân giống tạo ngân hàng chủng giống Vnukovo-V06 đợc thực nghiêm ngặt từ khâu lựa chọn nguyên liệu nguồn để hạn chế tối đa nhiễm vi rút ngoại lai, nhng chủng Vnukovo-V06 đợc kiểm tra nhiễm vi rút ngoại lai cách cấy truyền mù liên tiếp lần chủng MSV sau trung hoà với huyết kháng dại lên nhiều dòng tế bào khác để xác định vi rút ngoại lai gây huỷ hoại tế bào Đối với vi rút không gây huỷ hoại tế bào đợc xác định thông qua việc kiểm tra hình ảnh phơng pháp hiển vi điện tử (nhuộm âm lát cắt mỏng) tiêm truyền cho động vật bao gồm cht ỉ vµ cht swiss 11 – 13 gam KiĨm tra khả sinh miễn dịch: Khả sinh miễn dịch chủng sản xuất yếu tố vô quan trọng chủng sản xuất vắc xin, chủng Vnukovo-V06 gây đáp ứng miễn dịch cho chuột tiêm mũi miễn dịch 0,97IU/ml (RFFIT) Theo TCYTTG ngỡng kháng thể trung hoà có khả bảo vệ 0,5IU/ml Để khẳng định chủng giống sản xuất vắc xin Vnukovo- V06 Vnukovo- 32 có khả gây miễn dịch chống lại vi rút dại lu hành Việt Nam Hai chủng đợc giải trình tự gien N, so sánh với chủng vi rút dại hoang dại lu hành Việt Nam vài năm qua Kết cho thấy chủng vi rút dại sản xuất vắc xin Vnukovo-32, Vnukovo-V06 chủng vi rút dại hoang dại lu hành ngời động vật gần ngời (chó) Việt Nam thuộc kiểu gien 1, phân bố thành dới nhóm, 23 chøng tá chđng Vnukovo-V06 lµ chđng vi rót thÝch hợp dùng để sản xuất vắc xin phòng bệnh dại Việt Nam 4.3 Sản xuất thử nghiệm vắc xin Việc nghiên cứu quy trình sản xuất vắc xin dại tế bào Vero đợc thực qua giai đoạn từ nuôi cấy tế bào, nuôi cấy vi rút, bất hoạt, cô đặc tinh chế vi rút Mỗi giai đoạn đợc thực với nhiều phơng pháp khác để xác định phơng pháp, kỹ thuật tối u Riêng quy trình tinh chế vi rút đợc thử nghiệm với nhiều phơng pháp tinh chế tiên tiến giới sử dụng để tinh chế vi rút dại nh tinh chế sắc ký cét ¸i lùc (celloluse fine sulfate); tinh chÕ b»ng läc qua gel sepharose CL6B; tinh chÕ b»ng siªu läc vi lọc sử dụng màng lọc tiếp tuyến có MWCO kích thớc khác nhau; tinh chế siêu ly tâm qua dung dịch đờng có nồng độ liên tục 10 40% Các thử nghiệm tinh chế vi rút đợc thực 03 lần xác định tính lặp lại thử nghiệm, đánh giá hiệu suất tinh chế hiệu tinh phơng pháp, từ lựa chọn quy trình sản xuất tối u điều kiện sở vật chất trang thiết bị có Quy trình sản xuất thử nghiệm vắc xin sử dụng phơng pháp cô đặc siêu lọc tinh chế vi rút siêu ly tâm qua dung dịch đờng nồng độ 10 40% quy trình đợc nhiều nhà sản xuất vắc xin dại giới sử dụng 03 loạt vắc xin sản xuất thử nghiệm theo quy trình tìm đợc đạt tiêu chuẩn vắc xin dại TCYTTG vô khuẩn, an toàn, bất hoạt, pH, protein công hiệu.Tuy nhiên quy trình sản xuất thử nghiệm vắc xin dại tinh chế cha đạt hiệu suất cao (28,8 0,7%), cần phải có nghiên cứu để hoàn thiện quy trình sản xuất vắc xin nâng cao hiƯu st 24 KÕt ln Chđng Vnukovo-V06 chủng sản xuất vắc xin dại Vnukovo-32 thích nghi tế bào Vero đạt yêu cầu chủng giống sản xuất vắc xin - Hiệu giá 10-7,12LD50/ml, ổn định qua đời cấy truyền; MOI 5VR/100TB - Chủng cố định, giảm độc lực; đạt yêu cầu vô trùng (không bị nhiễm khuẩn, nấm mycoplasma); không nhiễm vi rút ngoại lai - Khả sinh miễn dịch 0,94IU/ml (RFFIT) Tạo đợc ngân hàng chủng giống MSV WSV đạt tiêu chuẩn chủng giống sản xuất vắc xin dại tế bào Sản xuất vắc xin thử nghiệm Xây dựng đợc quy trình sản vắc xin dại tế bào có hiệu suất 28,8 0,7% Sản xuất đợc 03 loạt vắc xin dại tế bào Vero đạt tiêu chuẩn TCYTTG - Vô khuẩn: đạt yêu cầu 03/03 loạt - Bất hoạt: đạt yêu cầu 03/03 loạt - An toàn chung: đạt yêu cầu, chuột tăng trọng 124,3 % - An ton đặc hiệu: đạt yêu cầu, chuột tăng trọng 163,3 % - Protein: đạt yêu cầu, protein trung bình 107,6 5,5 g/ml - pH : đạt yêu cầu, pH trung bình 7,17 0,03 - Công hiệu: đạt yêu cầu 2,5IU/ml Kiến nghị Hoàn thiện quy trình sản xuất vắc xin dại tế bào Vero có hiệu suất cao, đạt tiêu chuẩn chÊt l−ỵng cđa TCYTTG sư dơng cho ng−êi; Xin đợc đào tạo kỹ thuật trang bị thiết bị cần thiết để hoàn thiện kỹ thuật kiểm định ADN tồn d vắc xin dại tế bào sản xuất tế bào Vero; Sử dụng kháng nguyên tinh chế để sản xuất sinh phẩm dùng chẩn đoán nghiên cứu vi rút dại Danh mục bi báo liên quan đến luận án đ công bố Nguyễn Thị Kiều Anh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Quý, Hoàng Minh Hiền (2006) Xây dựng tiêu chuẩn hiệu giá virut dại sản xuất vắc xin dại tế bào theo FFU dựa tiêu chuẩn LD50, tạp chí Y học dự phòng XVI, 2(80), tr 16-20 Nguyễn Thị Kiều Anh, Ngô Châu Giang, Nguyễn Vĩnh Đông, Manen Kuazaki, Akira Nishizono, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2008) Bớc đầu thử nghiệm thích nghi chủng sản xuất vaccine dại Vnukovo-32 tế bào Vero, tạp chÝ nghiªn cøu y häc, tËp 53, sè 2, tr 62 67 Nguyễn thị Kiều Anh, Ngô Châu Giang, Nguyễn Vĩnh Đông, Nguyễn thị Hồng Hạnh (2009) Thử nghiệm tinh chế virus dại siêu ly tâm qua dung dịch đờng nồng độ 10% - 40%, tạp chí Y häc dù phßng, tËp XIX, sè (106), tr 88 – 94 Ngun thÞ KiỊu Anh, Ngun thÞ Hồng Hạnh, Đinh Kim Xuyến, Ngô Châu Giang, Nguyễn Vĩnh Đông (2009) Thử nghiệm sản xuất kháng nguyên virus dại tế bào cô đặc phơng pháp siêu lọc, tạp chÝ Y häc dù phßng, tËp XIX, sè (106), tr 95 101 Nguyễn Thị Kiều Anh, Ngô Châu Giang, Nguyễn Vĩnh Đông, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2009) Thích nghi chủng sản xuất vaccine dại Vnukovo-32 tế bào Vero, tạp chí nghiên cứu Y học, tập 65 sè 6, tr 16-25 ... cha sản xuất vắc xin dại tế bào nớc Vì lý thực đề tài Thích nghi chủng sản xuất vắc xin dại Vnukovo-32 tế bào Vero để thử nghi m sản xuất vắc xin Mục tiêu nghi n cứu Thích nghi chủng sản xuất vắc. .. tiêu chuẩn chủng giống sản xuất vắc xin dại tế bào Sản xuất vắc xin thử nghi m X y dựng đợc quy trình sản vắc xin dại tÕ bµo cã hiƯu st 28,8 ± 0,7% Sản xuất đợc 03 loạt vắc xin dại tế bào Vero đạt... chứng tỏ chủng Vnukovo-V06 chủng vi rút thích hợp dùng để sản xuất vắc xin phòng bệnh dại Việt Nam 4.3 Sản xuất thử nghi m vắc xin Việc nghi n cứu quy trình sản xuất vắc xin dại tế bào Vero đợc