Nghiên cứu khảo sát khả năng nhân giống dâu tây Nhật “Penihuble”. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ các ngó dâu tây đạt tỷ lệ sống 93,33%, hình thành mô sẹo 60%, phôi sinh dưỡng (5,33 phôi/mẫu) trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA.
An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), 19 – 27 NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY NHẬT (FRAGARIA ANANASSA “PENIHUBLE”) TỪ NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG Trần Thị Ngọc Lan1 Trường Cao đẳng Kinh tế Kỹ thuật Lâm đồng Thông tin chung: Ngày nhận bài: 18/01/2018 Ngày nhận kết bình duyệt: 18/02/2018 Ngày chấp nhận đăng: 04/2018 Title: The process of micropropagation of Fragaria ananassa “Penihuble” through apical meristem culture Keywords: α-naphtaleneacetic acid (NAA), 6-benzyladenine (BA), Apical meristem, Fragaria ananassa “Penihuble”, somatic embryos Từ khóa: α-naphtaleneacetic acid (NAA), 6-benzyladenine (BA), dâu tây, đỉnh sinh trưởng, Fragaria ananassa “Penihuble”, phôi sinh dưỡng ABSTRACT A regeneration system was carried out to examine the competence of micropropagation from apical meristem culture of strawberry Fragaria ananassa “Penihuble” The results showed that calli and somatic embryos were formed from apical meristem culture of runner tips on the MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, g/l agar, 0.2 mg/l NAA, 0.5 mg/l BA (with the highest survival rate of 93.33%, the best induction callus rate of 60%, 5.33 somatic embryos/sample) Calli which was multiplied with 8.56 - fold fresh mass, formed somatic embryos with 15.78 embryos/initial callus when they were subcultured on the MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, g/l agar, 0.5 mg/l BA These embryos converted into normal plants on the ½ MS medium with the best regeneration rate of 100% without plant growth regulators Histological observation showed that these calli contained embryogenic cells In the ex-vitro culture, the highest survival rate was observed with mixture of Tribat substrate and rice husk ash in the ratio of 1:1 (72.33%) and no morphological variations were observed in these plantlets TÓM TẮT Nghiên cứu khảo sát khả nhân giống dâu tây Nhật “Penihuble” Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ ngó dâu tây đạt tỷ lệ sống 93,33%, hình thành mơ sẹo 60%, phơi sinh dưỡng (5,33 phôi/mẫu) môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA Mô sẹo tiếp tục nhân lên đạt tỷ lệ tăng trưởng 8,56 lần, hình thành phơi sinh dưỡng (15,78 phôi/mẫu) môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar, 0,5 mg/l BA Môi trường ½ MS phù hợp cho phơi sinh dưỡng phát triển thành với tỷ lệ 100% mà không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật Quan sát mơ học mơ sẹo cho thấy có nhiều tế bào có tiềm phát sinh phơi Cây trồng tự nhiên với giá thể thích hợp hỗn hợp đất Tribat trấu hun (tỷ lệ 1:1), tỷ lệ sống 72,33% Khơng có sai hình ghi nhận từ sau 30 ngày nuôi trồng GIỚI THIỆU dâu tây giàu chất khống, hợp chất nhóm flavonoid chống oxi hóa, giàu loại vitamin nhóm B đặc biệt lượng vitamin C cao, cao cam, dưa hấu Đây đặc điểm ưu việt dâu tây, giúp tăng sức đề Cây dâu tây (Fragaria ananassa) thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) loại cho ngon, màu sắc hương thơm quyến rũ, sử dụng làm thực phẩm với nhiều ăn ngon, đa dạng Quả 19 An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), 19 – 27 kháng, chống nhiễm trùng, nhiễm độc, cảm cúm, tốt cho tim mạch chống stress Quả dâu tây chứa nhiều acid ellagic, xem chất kháng ung thư (ICAR news, 2005) Vì vậy, loại có tiềm kinh tế lớn Trong giống dây tây, giống dâu tây Nhật nhập nội cho to, màu sắc đỏ, đẹp, đặc biệt có độ mùi hương hấp dẫn Tuy nhiên, nhân giống dâu tây, phương pháp nhân giống sinh dưỡng từ ngó dâu thường dễ nhiễm bệnh thối hóa giống, phương pháp gieo hạt thường cho biến dị, nhỏ 0,2 mg/l kinetin để nhân chồi, rễ môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l BA 0,2 mg/l IBA Ashrafuzzaman cs (2013) nhân giống chồi từ ngó dâu tây môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA, rễ môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA Husaini cs (2008) có cơng bố hình thành phơi sinh dưỡng từ mơ sẹo dâu tây hình thành từ mẫu mơi trường MS bổ sung mg/l TDZ Tuy nhiên, phương pháp tạo phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chưa đề cập Đây phương pháp hữu hiệu nhân giống gia tăng tỷ lệ khơng nhiễm virus Vì vậy, nghiên cứu này, mục tiêu mà hướng đến nhân giống hàng loạt từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng qua đường phát sinh phôi sinh dưỡng với giống dâu tây Nhật nhập nội có giá trị kinh tế cao Trên giới có cơng bố vi nhân giống dâu tây Wang, Wergin Zimmerman (1984), nuôi cấy phôi chưa trưởng thành dâu tây để tạo phôi sinh dưỡng Hassan cs (2010), nhân giống mắt đốt dâu tây Fragaria x ananassa Duch môi trường MS bổ sung mg/l BA 0,1 mg/l NAA để nhân chồi, rễ môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l IAA cho thấy sử dụng GA3 hay nước dừa không ảnh hưởng đáng kể đến trình nhân chồi dâu tây Mir cs (2010), nhân chồi từ mắt đốt dâu tây môi trường MS bổ sung mg/l BA 0,5 mg/l NAA Moradi, Otroshy Azimi (2011), nhân giống mắt đốt dâu tây gieo hạt in vitro môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Đối tượng nghiên cứu: ngó giống dâu tây (Fragaria ananassa “Penihuble”), có xuất xứ từ Nhật, giống dâu cho trái to, đẹp nhập nội (Hình 1a, 1b) Trên thị trường Đà lạt, kg dâu tây loại có giá khoảng 400000 Việt Nam đồng Hình Cây dâu tây (Fragaria ananassa “Penihuble”) a Cây mang b Một đoạn ngó dâu tây 20 An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), 19 – 27 Môi trường nuôi cấy bản: MS (Murashige, Skoog, 1962), pH điều chỉnh 5,7, hấp vô trùng 121 οC, atm 2.2 agar nồng độ khác BA (0, 0,5 mg/l) NAA (0, 0,2 mg/l) Ni cấy mẫu có khối lượng 50 mg/bình, thể tích 250 ml với 40 ml mơi trường ni cấy Mỗi nghiệm thức gồm bình Quan sát thu nhận số liệu tỷ lệ tăng trưởng (khối lượng mô sẹo sau nuôi cấy/khối lượng mô sẹo trước ni cấy), số phơi sinh dưỡng trung bình hình thành sau 30 ngày nuôi cấy Phương pháp 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên q trình ni cấy đỉnh sinh trưởng dâu tây Xử lý nhiệt chồi dâu tây 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ môi trường MS lên sinh trưởng phôi sinh dưỡng dâu tây Các ngó dâu tây bỏ ngồi, có chiều dài từ cm – 1,25 cm, rửa vòi nước chảy, rửa lại nước rửa chén Sunlight, rửa lại vòi nước chảy, khử trùng tủ cấy ethanol 900, rửa nước hấp vô trùng, khử trùng tiếp HgCl2 0,1% phút, bỏ bớt ngồi, lại chồi mang từ - non, rửa nước hấp vô trùng lần Nuôi cấy chồi môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar, cường độ ánh sáng 2000 lux độ ẩm khơng khí 70%, ủ điều kiện chiếu sáng 16/24 37 οC ngày nhằm tiêu diệt virus (nếu có) Ni cấy mẫu/bình tích 250 ml với 20 ml mơi trường ni cấy Các phơi sinh dưỡng thu nhận từ thí nghiệm nuôi cấy loại môi trường: MS ắ MS v ẵ MS b sung 20 g/l sucrose, g/l than hoạt tính (AC) g/l agar để khảo sát sinh trưởng, hình thành phát triển phôi Nuôi cấy 20 mẫu/bình tích 500 ml với 70 ml mơi trường nuôi cấy Quan sát thu nhận số liệu tỷ lệ hình thành (số phơi hình thành số phôi nuôi cấy *100), chiều cao, màu sắc cây, số lá, số rễ chiều dài rễ trung bình/cây sau 30 ngày ni cấy 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng giá thể môi trường lên khả sống sót sinh trưởng dâu tây sau 30 ngày nuôi trồng điều kiện ex vitro Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Các chồi nuôi in vitro tách tiếp bao chồi, rửa nước hấp vô trùng lần, dùng dao kẹp tách lấy đỉnh sinh trưởng mang từ - sơ khởi (thao tác thực kính lúp, Hình 2a1.) cấy vào môi trường MS bổ sung BA (0, 0,5 mg/l), có kết hợp hay khơng kết hợp NAA (0, 0,2 mg/l), 30 g/l sucrose g/l agar Mỗi nghiệm thức gồm mẫu Ni cấy mẫu/bình tích 250 ml với 20 ml mơi trường ni cấy Theo dõi sống sót, phát sinh mô sẹo, phôi sinh dưỡng hay chồi mẫu cấy sau 15 ngày 30 ngày nuôi cấy Cây từ ni cấy in vitro giữ ngun bình, chuyển ngồi vườn ươm tuần để thích ứng Sau đó, lấy ra, rửa môi trường bám lên rễ, trồng loại giá thể: vỏ trấu hun, đất (Tribat 10 kg/bao) hay hỗn hợp tro trấu hun đất (tỷ lệ 1:1), có độ ẩm 85% Cây trồng bầu nhựa polyethylene, đường kính bầu cm; tưới lần/ngày Quan sát sống sót sinh trưởng dâu tây Số liệu thu nhận sau 30 ngày nuôi trồng 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên tăng trưởng mô sẹo hình thành phơi sinh dưỡng dâu tây có nguồn gốc từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 2.2.5 Quan sát mô học Làm loại tiêu mô sẹo với việc cắt lát theo chiều ngang mẫu mô sẹo cần quan sát, ngâm dung dịch javel 10% 15 phút, rửa nước, ngâm dung dịch acid acetic 45% 15 phút, rửa nước, nhuộm màu thuốc Các mơ sẹo dâu tây hình thành từ ni cấy đỉnh sinh trưởng (50 mg/mẫu) nuôi cấy tiếp tục môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, g/l 21 An Giang University Journal of Science – 2018, Vol 19 (1), 19 – 27 nhuộm hai màu đỏ carmin xanh iod 15 phút, rửa nước quan sát kính hiển vi quang học Olympus, Nhật với độ phóng đại 40 - 400 lần Quan sát đỉnh sinh trưởng dâu tây độ phóng đại 100 lần xác suất P < 0,05) với phần mềm xử lý thống kê SPSS (Statistical Program Scientific System) 16.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 2.2.6 Điều kiện thí nghiệm Tất thí nghiệm nhân giống in vitro ex vitro bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, lặp lại ba lần Nhiệt độ phòng ni: 25 οC ± οC, cường độ ánh sáng 2000 lux độ ẩm khơng khí 70% Chu kỳ chiếu sáng ngày: 16 sáng tối Trong thí nghiệm khảo sát thích nghi điều kiện ex vitro sử dụng vườn ươm (có lưới che 50% ánh sáng 15 ngày đầu), có nhiệt độ dao động ngày đêm 17 οC – 25 οC ± οC, cường độ ánh sáng: 7000 lux độ ẩm khơng khí: 80% Ảnh hưởng NAA BA lên q trình ni cấy đỉnh sinh trưởng dâu tây Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng dâu tây với việc bổ sung nồng độ khác NAA BA, kết nhận thể qua Bảng Quan sát mẫu đỉnh sinh trưởng dâu tây kính hiển vi có hình vòm (Hình 2a1) Đây nơi chứa tế bào mơ phân sinh với tế bào kích thước nhỏ, nhân to có tiềm phân chia mạnh mẽ Có thể gọi đỉnh sinh trưởng nơi chứa tế bào gốc, nơi biệt hóa quan sau Thông thường, virus di chuyển dễ dàng thể thực vật thông qua hệ thống mạch dẫn, cấu trúc mà đỉnh phân sinh Chính vậy, mơ phân sinh đỉnh thường khó nhiễm virus (Morel, 1960) Hơn nữa, hoạt tính trao đổi chất cao trình phân chia tế bào mô phân sinh nồng độ auxin nội sinh cao đỉnh chồi ức chế sinh sản, chép virus 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm bố trí theo thể thức hồn tồn ngẫu nhiên, thí nghiệm lặp lại lần Các số liệu thu giá trị trung bình lần lặp lại Số liệu thu thập xử lý phần mềm Excel 2010 phân tích thống kê phép thử Duncan (sự khác biệt có ý nghĩa mức Bảng Ảnh hưởng NAA BA lên q trình ni cấy đỉnh sinh trưởng dâu tây sau 30 ngày nuôi cấy Môi trường nuôi cấy bổ sung NAA(mg/l) BA(mg/l) Tỷ lệ sống sót (%) Tỷ lệ hình thành mơ sẹo (%) Số phơi/mẫu Tỷ lệ hình thành chồi (%) 0 66,67b* 20,00d 1,67c 46,67a 0,2 26,67d 26,67c 1,67c 0,00e 0,5 66,67b 40,00b 2,00c 26,67c 0,2 0,5 93,33a 60,00a 5,33a 33,33b 0,2 53,33c 40,00b 3,67b 13,33d Chú thích: *: Các mẫu tự khác (a,b, ) cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa với P