Đang tải... (xem toàn văn)
Rạn san hô trên toàn thế giới đang đối mặt với sự huỷ diệt, một trong những nguyên nhân chính là do vi khuẩn gây bệnh và những tác động của môi trường. Nghiên cứu về hệ vi khuẩn sống cùng san hô và mối tương quan giữa vi khuẩn, san hô và các yếu tố môi trường là quan trọng và cấp thiết.
Vietnam Journal of Marine Science and Technology; Vol 19, No 2; 2019: 271–283 DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/19/2/10814 https://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst A study on bacteria associated with three hard coral species from Ninh Thuan waters by epifluorescence and most diluted culture method Pham Thi Mien*, Nguyen Kim Hanh, Nguyen Minh Hieu, Phan Minh Thu, Hoang Trung Du, Vo Hai Thi, Nguyen Trinh Duc Hieu, Le Tran Dung, Nguyen Huu Huan Institute of Oceanography, VAST, Vietnam * E-mail: mien.pham@gmail.com Received: 11 Febuary 2018; Accepted: July 2018 ©2019 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) Abstract Coral associated bacteria and their host are currently one of the interested issues for research and scientists worldwide The densities of zooxanthellae and bacteria associated with three most prevalent species Acropora hyacinthus, Acropora muricata and Acropora robusta in Hang Rai, Ninh Thuan was evaluated over time by staining with SYBR Gold and direct counting with epifluorescence method The most dominant bacteria were isolated by culture dependent method The densities of zooxanthellae and bacteria ranged from 0.39–1.83×107 cell/g, and 0.83–2.52×108 cell/g, respectively Bacterial density in the months was significantly different compared to the density of the bacteria in ambient water Total heterotrophic bacteria, comma shaped bacteria and bacillus form showed negatively correlated with pH, PO4, while zooxanthellae showed no correlation with all factors Keywords: Symbiotic microbes, bacteria, Acropora hyacinthus, Acropora muricata, Acropora robusta, environmental parameters, Ninh Thuan Citation: Pham Thi Mien, Nguyen Kim Hanh, Nguyen Minh Hieu, Phan Minh Thu, Hoang Trung Du, Vo Hai Thi, Nguyen Trinh Duc Hieu, Le Tran Dung, Nguyen Huu Huan, 2019 A study on bacteria associated with three hard coral species from Ninh Thuan waters by epifluorescence and most diluted culture method Vietnam Journal of Marine Science and Technology, 19(2), 271–283 271 Tạp chí Khoa học Công nghệ Biển, Tập 19, Số 2; 2019: 271–283 DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/19/2/10814 https://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst Nghiên cứu vi sinh vật sống số lồi san hơ cứng Hang Rái, Ninh Thuận phƣơng pháp nhuộm huỳnh quang kết hợp nuôi cấy tới hạn Phạm Thị Miền*, Nguyễn Kim Hạnh, Nguyễn Minh Hiếu, Phan Minh Thụ, Hoàng Trung Du, Võ Hải Thi, Nguyễn Trịnh Đức Hiệu, Lê Trần Dũng, Nguyễn Hữu Huân Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Việt Nam * E-mail: mien.pham@gmail.com Nhận bài: 11-2-2018; Chấp nhận đăng: 7-7-2018 Tóm tắt Rạn san hơ tồn giới đối mặt với huỷ diệt, nguyên nhân vi khuẩn gây bệnh tác động môi trường Nghiên cứu hệ vi khuẩn sống san hô mối tương quan vi khuẩn, san hô yếu tố môi trường quan trọng cấp thiết Vi tảo Symbiodinium sp., vi khuẩn sống lồi san hơ cứng Acropora hyacinthus, Acropora muricata Acropora robusta phổ biến Ninh Thuận đánh giá vào thời điểm trước, sau san hô bị tẩy trắng phương pháp đếm huỳnh quang pha loãng tới hạn Mật độ tảo Symbiodinium khác có ý nghĩa thống kê (dao động 0,39–1,83×107 tb/g) lồi san hơ khác Tuy nhiên, mật độ tảo cộng sinh khơng có khác biệt lớn tháng nghiên cứu Mật độ vi khuẩn dao động từ 0,83–2,52×108 tb/g có sai khác có ý nghĩa thống kê khơng lồi san hơ mà thời điểm trước sau tẩy trắng Tổng vi khuẩn, phẩy khuẩn trực khuẩn có tương quan nghịch có ý nghĩa mặt thống kê với số pH hàm lượng PO4 Ngược lại, mật độ tảo hoàn toàn không tương quan với yếu tố môi trường Từ khóa: Vi tảo cộng sinh, vi khuẩn, Acropora hyacinthus, Acropora muricata, Acropora robusta, thông số môi trường, Ninh Thuận MỞ ĐẦU Rạn san hơ biển Việt Nam có tổng diện tích 110.000 với 28 vùng rạn san hô phân bố ven bờ từ Bắc đến Nam vùng khơi Hoàng Sa, Trường Sa [1] Rạn san hơ biển Nam Trung Bộ có thành phần loài đa dạng với 351 loài ghi nhận Nha Trang [2] Rạn san hơ Việt Nam nơi cư ngụ cho nhiều lồi nguồn lợi có giá trị, có đến 70–90% lồi cá có vòng đời phụ thuộc rạn san hô giai đoạn q trình sinh sống, thực rạn san hơ khơng mang lại lợi ích sinh thái mà mang lại lợi ích kinh tế cho Việt Nam [3] Hiện trạng chung toàn cầu 272 diễn rạn san hô chúng bị tác động nóng lên nhiệt độ nước biển dẫn đến nguy suy thoái, chí có dự đốn rạn san hơ thành rạn hải miên sinh vật khác-không phải san hơ [4] Cũng có nghiên cứu cơng bố, san hơ bị ảnh hưởng tẩy trắng, hải miên chiếm đóng thay chỗ san hơ, làm tăng cường đe dọa san hô [5] Hiện tượng tẩy trắng san hô-một tượng biết đến phổ biến gây chết hàng loạt cho san hơ tồn giới quan sát thấy vùng biển Nam Châu Á Thái Bình Dương Việt Nam vào năm 1998, có số nơi quan Nghiên cứu vi sinh vật sống số lồi san hơ sát thấy xảy nghiêm trọng với 30% san hô khu vực bị tẩy trắng Hiện tượng tẩy trắng quan sát thấy vịnh Thái Lan, vịnh Nha Trang, vịnh Vân Phong số nơi khác vào năm 2010, nguyên nhân cho ảnh hưởng tượng El Niño làm cho nhiệt độ nước biển tầng mặt tăng [6] Hơn thế, có nhiều giả thuyết nêu nhiệt độ tầng mặt nước biển tăng dẫn đến suy giảm số lượng tiêu diệt hoàn toàn tảo cộng sinh bắt buộc (Symbiodinium) san hơ, tảo cộng sinh làm suy yếu miễn dịch san hô thiếu dinh dưỡng, stress số nguyên nhân khác [7] Đồng thời, điều kiện thuận lợi điều kiện tương thích nhiệt độ, vi khuẩn gây bệnh hội sống san hơ có hội bùng phát công san hô để cạnh tranh nơi ở, thức ăn, Kết san hô bị chết hàng loạt hệ thống miễn dịch không đủ mạnh để chống lại công vi sinh vật gây bệnh hội [8] Vi sinh vật sống có vai trò định vật chủ san hô, chúng nhà cung cấp chất dinh dưỡng cho san hô [9] tham gia vào chế phòng vệ tự nhiên, chống lại vi sinh vật gây bệnh qua việc sản sinh chất có khả kháng vi sinh vật, ví dụ peptides thuốc kháng sinh [10, 11] điều hòa cạnh tranh lồi vi sinh vật vật chủ [12] Thành phần vi sinh vật san hơ dần chứng minh có liên quan mật thiết đến lồi san hơ riêng biệt, vai trò chúng san hô làm rõ dần Roseobacter, Spongiobacter (trực khuẩn Gram âm), Vibrio Alteromonas-(phẩy khuẩn) vi khuẩn chủ yếu tham gia vào chu trình sinh địa hóa sulfur tìm thấy san hô Montipora aequituberculata san hô A millepora Chúng chứng minh có liên quan đến việc sản sinh tiêu thụ sulfur từ nguồn vật chủ, thí nghiệm với dimethylsulfoniopropionate (DMSP) chất hữu giầu sulfur tạo chủ yếu nhờ tảo cộng sinh với san hô [13, 14] Bằng phương pháp sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy, Vibrio phát san hô A millepora trước tẩy trắng, thời gian tẩy trắng Vibrio xác định nhóm chiếm ưu với số lượng tăng cao sau thời gian tẩy trắng số lượng có xu hướng giảm dần đến ngang với số lượng trước tẩy trắng Bên cạnh nhóm vi khuẩn Spongiobacter sp trực khuẩn Gram âm, coi chiếm ưu mẫu san hô không bị tẩy trắng Mặc dù Vibrio biết đến vi khuẩn gây bệnh cho san hô, việc phát chúng san hô khỏe mạnh, san hô bị tẩy trắng sau bị tẩy trắng cho thấy chúng nhóm hội đối ứng với trạng thái sức khỏe san hơ trước tác động từ ngồi mơi trường sống ví dụ nhiệt độ, pH Hơn nghiên cứu Bourne et al., [15], tảo cộng sinh có tương quan nghịch với nhiệt độ, tổng protein coral holobiont (host symbiont combined = san hô sinh vật sống cùng), khơng có tương quan với nhiệt độ nước biển tầng mặt suốt thời gian dài nghiên cứu 2,5 năm Những nghiên cứu gần Garren et al., [16] mối tương quan san hô bị căng thẳng nhiệt chất nhầy tiết môi trường xung quanh chất DMSP với nồng độ cao gấp lần, nồng độ cao chất DMSP có hóa lực (chemotaxis) thu hút vi khuẩn gây bệnh san hô Vibrio DMSP chất hữu giàu dinh dưỡng nguồn C S vi khuẩn gây bệnh lại khơng đồng hóa DMSP thời gian thí nghiệm 24 giờ, điều cho thấy để phán ứng với căng thẳng mơi trường san hơ tiết chất hóa học có hóa lực vi khuẩn gây bệnh, chất tín hiệu hóa học san hơ chuyển mơi trường Một nghiên cứu khác nhóm tác giả Rainna [17] đáng ý công bố tìm thấy vi khuẩn Pseudovibrio sp chủng P12 phẩy khuẩn thường tìm thấy san hơ tạo rạn, vi khuẩn đồng hóa DMSP sinh chất kháng sinh tropodithietic acid (TDA), phân tích cấu trúc cho thấy chất kháng sinh có sulfur hình thành từ việc đồng hóa DMSP vi khuẩn, TDA có khả kìm hãm phát triển vi khuẩn gây bệnh cho san hô V coralliilyticus, V owensii nồng độ thấp 0,5 µg/ml Góp phần tìm hiểu vi sinh vật sống san hô biển Việt Nam, nghiên cứu thực với việc đánh giá mật độ vi tảo cộng sinh, vi khuẩn dị dưỡng vi khuẩn chiếm ưu ni cấy lồi san hơ tạo rạn phổ 273 Phạm Thị Miền nnk biến Hang Rái, Ninh Thuận thời điểm khác (mẫu thu tháng 5, 6/2016 thời gian có ghi nhận san hô khu vực thu mẫu bị tẩy trắng mẫu thu tháng 8/2016 tương ứng với thời gian san hô sau tẩy trắng) Kết nghiên cứu giúp hiểu rõ hệ vi sinh vật biến động thành phần tương ứng vào thời điểm điều kiện môi trường khác đặc biệt thời gian tháng 5,6 có ghi nhận san hô bị tẩy trắng tháng thời điểm sau tẩy trắng PHƢƠNG PHÁP Địa điểm thời gian thu mẫu, xử lý mẫu Ba loài san hô dùng để nghiên cứu đề tài Acropora hyacinthus, Acropora muricata, Acropora robusta thu lần khảo sát vào tháng 5, tháng năm 2016 Hang Rái - Ninh Hải - Ninh Thuận Mẫu san hô sống thu nhờ thợ lặn có khí tài (SCUBA) độ sâu 5–7 m vị trí có tọa độ 109o18’28,1”E, 11o67’71,7”N, Hang Rái-Ninh Thuận (hình 1) San hơ thu vào túi nilơng vơ trùng, bảo quản tối, đặt bình đá lạnh vận chuyển phòng thí nghiệm khoảng thời gian nhanh (ca giờ), sau thực thí nghiệm Các thông số môi trường nhiệt độ (độ C), pH độ mặn đo máy đa yếu tố cầm tay (HORIBA Model U10Nhật Bản) Những thông số khác DO, BOD5, NH4, NO2, NO3, TOM, Chl-a, PO4 phân tích theo phương pháp chuẩn chất lượng môi trường nước biển [18] Phƣơng pháp nuôi cấy phân tích mẫu Mẫu san hơ sau lấy về, cân g mẫu đồng 18 ml nước biển lọc vơ trùng qua màng lọc 0,02 µm để nồng độ 10-1 Mẫu san hô dùng để đếm tổng số lượng vi khuẩn phương pháp đếm trực tiếp kính hiển vi huỳnh quang cố định với formaldehyde đến nồng độ cuối 3%, làm lạnh nhanh ni tơ lỏng bảo quản 80oC phân tích Xử lý mẫu san hơ với dung dịch potassium citrate 1% nhằm loại chất bắt màu huỳnh quang có sẵn san hơ, sau lọc qua màng lọc 0,02 µm (AnodiscTM Whatman) nhuộm với SYBR Gold (Invitrogen) [19] soi kính hiển vi quang học huỳnh quang Tổng số vi khuẩn, hình dạng vi khuẩn (hình cầu, que, phẩy khuẩn, ) đếm với kính hiển vi huỳnh quang Olympus Provis AX70, xử lý hình ảnh với phần mềm chụp ảnh kỹ thuật số (OlympusDP71) Hình Bản đồ vị trí lấy mẫu 274 Nghiên cứu vi sinh vật sống số lồi san hơ Đếm vi khuẩn phương pháp pha lỗng san hơ A muricata dao động từ 3,92 × 106 tb/g tới hạn: Vi khuẩn cấy truyền liên tiếp đến đến 5,48 × 106 tb/g A robusta dao động từ nồng độ 10-8 vào mơi trường Sea Water Broth khoảng 3,99–6,17×106 tb/g (SWB-peptone g/l, yeast extract 2,5 g/l, glucose g/l, MgSO4.7H2O 0,1 g/l, K2HPO4 tb/g san hô Tảo cộng sinh 2,40E+07 0,1 g/l, NaCl 30 g/l) Quan sát tồn 2,20E+07 Tháng phát triển vi khuẩn sau 24, 48, 72 nuôi 2,00E+07 Tháng 1,80E+07 cấy nhiệt độ phòng 30oC so sánh với lơ đối 1,60E+07 Tháng chứng có mơi trường mà khơng cấy mẫu 1,40E+07 Tính số lượng tổng vi sinh vật g mẫu 1,20E+07 1,00E+07 san hô từ nồng độ pha loãng liên tiếp cao 8,00E+06 có vi khuẩn theo phương pháp tới hạn A(cfu/g) 6,00E+06 4,00E+06 = N/(n1Vf1 +…+ niVfi) Trong đó: A: Khuẩn lạc 2,00E+06 vi khuẩn g mẫu (cfu/g); N: Tổng số 0,00E+00 A hyacinthus A muricata A robusta khuẩn lạc đếm đĩa chọn; n1, ni: Số lượng đĩa cấy nồng độ Hình Tổng số tảo cộng sinh đếm với kính pha lỗng thứ thứ i; V: Thể tích dịch Hình Tổng số tảo cộng sinh đếm với kính hiển vi quang học huỳnh quang vi quang học huỳnh quang mẫu (ml) cấy vào đĩa; fi: Nồng độ pha Sự sai khác mật độhiển tảo cộng sinh ba lồi san hơ nghiên cứu có ý nghĩa loãng tương ứng Xác định, định danh vi khuẩn gây bệnh Sự sai khác mật độ tảo cộng sinh hội chiếm ưu thế: Từ mẫu san hơ ba lồi san hơ nghiên cứu có ý nghĩa mặt đồng nước biển lọc vô trùng, dùng thống kê, kiểm tra ANOVA chiều cho ml mẫu cấy lên môi trường Thiosulfate- thấy sai khác phụ thuộc vào lồi tảo citrate-bile salts-sucrose agar (TCBS) agar (Fsanhơ= 6,81 > F0,05 = 3,42 Psanhô = 0,0045 < (HiMedia, Ấn Độ) nhằm phân lập Vibrio, vi 0,05) Hơn kiểm tra hệ số di truyền (0 ≤ khuẩn gây bệnh hội đường ruột nhóm h2 ≤ 1) xem thực có tác động đến sai khác Enterobacteriaceae môi trường tảo hay không, cho thấy hệ số di truyền tương MacConkey (HiMedia, Ấn Độ) Vi khuẩn gây đối cao với h2 =0,8 khẳng định số bệnh hội nhóm Vibrio vi khuẩn lượng tảo thực phụ thuộc vào lồi san hơ Enterobacteriaceae phân loại đến lồi Trong số lượng tảo A robusta biến động dựa vào phương pháp nuôi cấy truyền nhất, ngược lại số lượng tảo A hyacinthus thống/hoặc dùng KIT sinh hóa API20E biến động lớn Nhìn chung số lượng tảo (Biomerieux, Pháp) lồi san hơ tháng nằm giới hạn thơng thường tính cm2 bề mặt Phƣơng pháp xử lý số liệu Toàn số liệu xử lý phần mềm mơ san hơ sống 1–5×10 tế bào Tuy nhiên, thống kê R -R Development Core Team, [20], số lượng7 tảo A hyacinthus tháng đồ trạm vị thu mẫu xây dựng 1,83×10 tb/g cao mức thông thường khoảng 100 lần Khi phân tích mối tương quan phần mềm Surfer MapInfo số lượng tảo vi khuẩn thơng số mơi trường (bảng 2) cho thấy mật độ tảo KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tổng số vi tảo cộng sinh đếm trực tiếp dƣới khơng có tương quan thuận tương quan nghịch tất yếu tố so sánh kính hiển vi quang học huỳnh quang Số lượng tảo (tế bào/g san hô tươi) Nghiên cứu vi sinh vật 34 tập đồn Acropora trình bày hình biểu diễn giá trị trung millepora sống Grear Barrier Reef (Australia) bình độ lệch chuẩn Hình cho thấy tảo từ tháng 10 năm 2000 đến tháng năm 2003 cộng sinh A hyacinthus tháng cao bao gồm thời gian san hô bị tẩy trắng so với hai lồi san hơ A muricata A tẩy trắng mật độ tảo cộng sinh robusta Số lượng tảo cộng sinh tìm thấy giảm đến 64% có tương quan nghịch với A hyacinthus dao động từ 5,69 × 106 tb/g nhiệt độ, ngược lại tỷ lệ phần trăm tảo cộng đến 1,83 × 107 tb/g, tảo cộng sinh sinh bị thối hóa (degenerate zoox-) có tương 275 Phạm Thị Miền nnk 276 Tổng số vi khuẩn đếm huỳnh quang ni cấy pha lỗng tới hạn Tổng số vi khuẩn (tế bào/g san hô = tb/g, tế bào/ml nước = tb/ml) đếm trực tiếp qua kính hiển vi huỳnh quang epifluorescence microscope-EFM trình bày hình biểu diễn giá trị trung bình độ lệch chuẩn 3,50E+02 Bacteria EFM Tháng Tháng 3,00E+02 106 tb/g san hô 104 tb/ml nước quan thuận [15] Một số nghiên cứu khác nghiên cứu tảo cộng sinh với ba lồi san hơ Acropora hyacinthus, Acropora japonica Cyphastrea chalcidicum vịnh Tanabe, Nhật Bản tảo đánh giá biến động số lượng qua thời gian dài năm, Symbiodinium clade C cho nhóm tảo ưu nhiệt độ thấp [21] Symbiodinium clade D nhóm ưu tìm thấy nâng nhiệt độ cao thí nghiệm với san hô Porites rặng san hô Palau [22] Trong xảy tượng tẩy trắng Symbiodinium C3 phát loài chiếm ưu trải qua thời gian chịu nhiệt sau tượng tẩy trắng xảy người ta phát Symbiodinium D1a chiếm ưu [23] Tuy nhiên nghiên cứu khác nhiệt độ không làm ảnh hưởng đến tảo cộng sinh hệ vi sinh vật sống san hô, đồng thời đề nghị linh hoạt mối quan hệ sinh lý san hô hệ vi sinh vật sống giúp san hô vượt qua ảnh hưởng bất lợi nhiệt độ môi trường tăng lên [24] Nghiên cứu tìm hiểu số lượng tảo qua phương pháp nhuộm đếm kính hiển vi huỳnh quang khơng thể nhóm tảo cụ thể có mặt san hơ Khơng có Symbiodinium (dinoflagellate alga) có mối quan hệ tương hỗ cộng sinh san hô cứng, Chromera velia phân lập từ san hô Plesiastrea versipora cảng Sydney san hô Leptastrea purpurea đảo One Tree Queensland, Australia [25] gần đây, Chromera velia -động vật nguyên bào ký sinh thuộc ngành apicomplexan có tổ tiên với tảo quang hợp Symbiodinium phát từ san hô Montipora digitata cho động vật nguyên bào apicomplexan không quang hợp nội cộng sinh với ấu trùng san hô Acropora digitifera san hô A tenuis [26] Nghiên cứu dùng phương pháp nhuộm đếm kính hiển vi huỳnh quang, đưa mật độ tảo san hơ vào thời điểm san hô tẩy trắng (tháng 5, 6) sau tẩy trắng (tháng 8), mà nhóm tảo cụ thể có mặt san hô tỷ lệ tảo sống tảo chết Do cần nhiều nghiên cứu chuyên sâu để đưa nhận định biến thiên tảo cộng sinh san hô trạng thái tẩy trắng sau tẩy trắng Tháng 2,50E+02 2,00E+02 1,50E+02 1,00E+02 5,00E+01 0,00E+00 A hyacinthus A.muricata A robusta water Hình Tổng vi khuẩn dị dưỡng đếm huỳnh quang EFM Tổng số vi khuẩn có mặt mẫu san hô A hyacinthus dao động 1,17–2,25×108 tb/g mẫu A muricata 0,83–2,52×108 tb/g A robusta 1,10–2,08×108 tb/g Trong nghiên cứu tổng số vi khuẩn thấp tìm thấy A muricata vào tháng 0,83±0,22×108 tb/g cao vào tháng với 2,52±0,43×108 tb/g Vi khuẩn nước biển dao động từ 0,82–1,04×106 tb/ml Vi khuẩn có mặt san hô cao nhiều (khoảng 200 lần) so với vi khuẩn nước biển đếm trực tiếp phương pháp nhuộm đếm huỳnh quang Kết tương đồng với nghiên cứu tương tự Nguyen et al., [27, 28] Tổng số vi khuẩn dị dưỡng qua ni cấy pha lỗng tới hạn trình bày hình 4, biểu diễn giá trị trung bình độ lệch chuẩn Hình cho thấy mẫu san hơ có số lượng tổng vi khuẩn thấp nước, vi khuẩn nước cao vào tháng với 1,04±0,0016×107 cfu/ml, tháng tháng gần tương đương với 9,43±0,64×106 cfu/ml 9,98±2,15×106 cfu/ml Tổng số vi khuẩn thấp cao tìm thấy san hơ A muricata tương ứng vào tháng với 7,96±0,18×105 cfu/g tháng với 5,38±6,42×106 cfu/g Nghiên cứu vi sinh vật sống số lồi san hơ cfu/g san hơ cfu/ml nước 1,20E+07 Tổng vi khuẩn (NA) 1,00E+07 8,00E+06 6,00E+06 4,00E+06 2,00E+06 0,00E+00 Tháng Tháng Tháng A hyacinthus 2,86E+06 4,15E+06 1,32E+06 A muricata 1,22E+06 7,96E+05 5,38E+06 Nước 9,43E+06 9,98E+06 1,04E+07 A robusta 4,81E+06 6,22E+05 1,36E+06 Hình Tổng vi khuẩn nuôi cấy NA Trong nghiên cứu vi khuẩn đồng nước biển lọc qua màng lọc 0,02 µm hạn chế tối đa vi khuẩn bên xâm nhiễm cấy truyền trực tiếp vào mơi trường dinh dưỡng khơng qua pha lỗng với muối sinh lý nhằm khắc phục hạn chế nuôi cấy truyền thống Do thấy số lượng vi sinh vật tổng số loài san hô cứng cao so với nghiên cứu phân lập vi sinh vật lồi san hơ mềm vịnh Nha Trang [29] Qua hình cho thấy vi khuẩn nước cao vi khuẩn san hô Mơi trường SWB NA có thành phần dinh dưỡng thông thường nhằm phân lập vi sinh vật từ mơi trường biển, chúng mơi trường thích hợp cho vi khuẩn có nước biển mà khơng phải mơi trường ưu thích vi khuẩn san hô Trong nghiên cứu đa dạng vi khuẩn sống san hô Alcyonium digitatum biển Baltic, có vi khuẩn phân lập từ mơi trường ghèo dinh dưỡng BSA có agar nước biển Baltic sau nuôi cấy tuần 28oC, ngược lại môi trường BSA 10oC có số lượng vi khuẩn nhiều đa dạng [30] Khi kiểm tra sai khác số lượng vi khuẩn san hơ nước có thực khác hay khơng phân tích ANOVA cho thấy khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p = 0,0038 Fsan hô = 5,57 > F0,05 = 2,93 hệ số di truyền h2 = 0,82) Tuy nhiên kiểm tra ANOVA hai yếu tố (san hô thời gian: tháng 5, tháng 6, tháng 8) cho thấy yếu tố thời gian chi phối sai khác số lượng vi khuẩn san hơ Trong Ptháng = 0,01 < 0,05 Ftháng = 17,58 > F0,05 = 6,94 Psan hô = 0,39 > 0,05 Fsan hô = 1,19 < F0,05 = 6,94 A muricata A hyacinthus 100% 100% 80% 80% 60% 60% 40% 40% 20% 20% 0% 0% tháng tháng cầu khuẩn trực khuẩn tháng tháng phẩy khuẩn sợi khuẩn cầu khuẩn trực khuẩn tháng tháng phẩy khuẩn sợi khuẩn Nước A robusta 100% 100% 80% 80% 60% 60% 40% 40% 20% 20% 0% 0% tháng tháng tháng tháng tháng tháng cầu khuẩn phẩy khuẩn cầu khuẩn phẩy khuẩn trực khuẩn sợi khuẩn trực khuẩn sợi khuẩn Hình Thành phần vi khuẩn đếm trực tiếp EFM 277 Phạm Thị Miền nnk Trong nghiên cứu hình dạng tế bào vi khuẩn phân biệt qua đếm soi trực tiếp kính hiển vi huỳnh quang thể qua hình Số lượng vi khuẩn loài san hô mẫu thu tháng thấp mẫu thu vào tháng tháng (hình 4) Thành phần vi khuẩn A hyacinthus, A robusta mẫu nước tháng gần tương tự nhau, với thành phần chiếm đa số cầu khuẩn, phẩy khuẩn trực khuẩn nhất, ngược lại A muricata thành phần phẩy khuẩn chiếm tỷ lệ cao Trực khuẩn tìm thấy tăng dần vào tháng tháng mẫu nước, san hô A muricata A robusta So với mẫu nước, thành phần vi khuẩn lồi san hơ có thay đổi theo thời gian mẫu nước cầu khuẩn chiếm tỷ lệ cao tiếp đến phẩy khuẩn trực khuẩn Những vi khuẩn sản sinh sử dụng nitơ trực khuẩn Gram âm nhóm Roseobacter, Spongiobacter phẩy khuẩn Gram âm Vibrio Alteromonas tìm thấy mơ san hơ có mối liên quan với vật chủ mà thực chất mối liên quan mật thiết dinh dưỡng [13, 14] Bảng So sánh tương quan theo Pearson’s Product moment So sánh Vi khuẩn PO4 Vi khuẩn pH Trực khuẩn pH Trực khuẩn PO4 Trực khuẩn độ mặn Trực khuẩn nhiệt độ Phẩy khuẩn NO3 Phẩy khuẩn DO Phẩy khuẩn Chl-a Phẩy khuẩn BOD5 Phẩy khuẩn TOM Phẩy khuẩn PO4 Phẩy khuẩn NH4 Phẩy khuẩn NO3 r (n = 27) -0,521 -0,573 -0,553 -0,422 0,562 -0,453 -0,462 -0,735 -0,630 -0,545 -0,543 -0,516 -0,497 -0,462 p 0,01 0,01 0,01 0,05 0,01 0,05 0,05 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,05 Trong tháng có pH thấp so với tháng lại pH tháng thấp quan sát thấy trực khuẩn A muricata A robusta tăng, phẩy khuẩn chiếm ưu A hyacinthus Kết kiểm định hệ 278 số tương quan Pearson cho thấy tổng vi khuẩn, trực khuẩn có tương quan nghịch với pH (bảng 1) pH thấp tổng vi khuẩn cao nhóm phẩy khuẩn, trực khuẩn chiếm ưu Nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu Meron et al., [31, 32] san hô Acropora eurystoma vịnh Eilat, Biển Đỏ, pH = 7,3 hệ vi khuẩn sống san hô đa dạng thành phần số lượng so với hệ vi khuẩn sống pH = 8,2 nhóm Vibrionaceae and Alteromonadaceae chiếm ưu Đặc biệt vi khuẩn có khả sinh kháng sinh đa số phân lập từ san hô pH = 7,3 số 54 chủng sinh kháng sinh có đến 50% chủng thuộc Vibrionaceae 29% thuộc Rhodobacteraceae Rõ ràng thấy san hơ ni điều kiện pH thấp hệ vi sinh vật liên quan đến bệnh tật căng thẳng cho san hơ tăng Mặt khác vi khuẩn có tiềm kháng khuẩn tăng san hô pH thấp Trong tháng hàm lượng PO4 thấp phẩy khuẩn trực khuẩn tăng lấn át cầu khuẩn Kiểm tra mức độ tương quan cho thấy, vi khuẩn sống san hơ nhóm trực khuẩn phẩy khuẩn có tương quan tỷ lệ nghịch có ý nghĩa mặt thống kê (bảng 1) với hàm lượng PO4, tỷ lệ cầu khuẩn, trực khuẩn phẩy khuẩn mẫu nước qua tháng thay đổi không đáng kể kiểm tra anova cho biết sai khác khơng có ý nghĩa (p > 0,05) thống kê Định danh số vi khuẩn chiếm ƣu Vi khuẩn hội nhóm Vibrio khơng tìm thấy mẫu san hơ vào tháng 5, tháng có khuẩn lạc xuất TCBS (ít 10 khuẩn lạc cho mẫu san hô/tháng) Số lượng phẩy khuẩn TCBS lồi san hơ vào tháng 30 khuẩn lạc cho mẫu san hô Số lượng phẩy khuẩn có tương quan nghịch có ý nghĩa thống kê với thông số môi trường DO, Chl-a, BOD5, TOM, NH4 NO3 (bảng 1) thông số vào tháng 5, cao vào tháng Không có vi khuẩn từ mẫu san hơ thu tháng 5, tháng xác định ưu định danh đến lồi Vì chúng xuất TCBS không phát triển nuôi cấy để làm thuần, khơng thể phân lập định danh đến lồi Có thể chúng cần chất dinh dưỡng đặc biệt đó, cần điều kiện nuôi Nghiên cứu vi sinh vật sống số lồi san hơ cấy khác mà nghiên cứu khơng đáp ứng Sự thật hiểu biết vi sinh vật biển 0,01% sinh thái, di truyền đặc tính sinh học, vi sinh vật ni cấy ước tính khoảng 0,1% số lồi phát [33] Tuy nhiên nuôi cấy thơng thường cho thấy nhóm phẩy khuẩn Vibrio sp vi khuẩn chiếm ưu chất nhầy mô san hô Acropora digitifera vịnh Mannar [34], san hô cứng Mussismilia hispida biển Brazil [35] san hô cứng Acropora hyacinthus, Stylophora pistillata Great Barrier Reef [10] Gần có nhiều phát cho thấy kể vi khuẩn thường cho liên quan đến gây bệnh Vibrio, Shewanella… chúng khai thác từ động vật khơng xương sống ví dụ Shewanella algae trực khuẩn Gram âm phân lập từ hải miên Callyspongia diffusa biển Ấn Độ chủng thể kháng lại nhiều vi khuẩn đồng thời có khả kháng nấm gây bệnh [36] Nghiên cứu xác định đến loài hai chủng vi khuẩn gây bệnh hội chủng TCBS 3.1 (v) xác định Enterobacter amnigenus chủng TCBS 3.3 xác định Pseudomonas aeruginosa Hai chủng tìm thấy vi khuẩn chiếm ưu từ san hơ A muricata Hình dạng khuẩn lạc kết dịnh danh KIT API20E cho hai chủng trình bày hình 6–7 Hình Khuẩn lạc chủng TCBS 3.1 (v) TCBS 3.3 Hình Kết KIT API 20E cho TCBS 3.1 (v) TCBS 3.3 279 Phạm Thị Miền nnk Cả hai vi khuẩn E amnigenus P aeruginosa chiếm ưu trực khuẩn Gram âm So sánh tương quan trực khuẩn thông số môi trường cho thấy trực khuẩn có tương quan nghịch có ý nghĩa thống kê với nhiệt độ, pH PO4 (bảng 1) Vào tháng 8, thông số pH PO4 thấp tháng tháng 6, trực khuẩn chiếm tỷ lệ cao thành phần vi khuẩn sống san hô Đặc biệt hai chủng chiếm ưu định danh đến lồi có tương quan với thông số môi trường pH PO4 Khả sử dụng phốt (P-phosphorus) vô vi khuẩn có tương quan mật thiết với pH môi trường, vi khuẩn phải tiết axit hữu nhằm giảm pH để hòa tan khống chất có chứa phốt dạng phốt dạng ion PO4 (phosphate) giải phóng phốt ngồi Vi khuẩn có khả sử dụng P vơ sử dụng làm phân bón sinh học từ năm 1950 Một số vi khuẩn có khả hòa tan P vơ hiệu phải kể đến chủng thuộc chi Enterobacter Pseudomonas [37] Trong số trường hợp thiếu hụt phosphate (PO4) thúc đẩy q trình hòa tan phosphate [38] KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Mật độ tảo cộng sinh với san hơ ba lồi san hơ có khác biệt có ý nghĩa thống kê phụ thuộc vào lồi san hơ, mặt khác khác biệt mật độ tảo tháng có ý nghĩa mặt thống kê Vi khuẩn san hơ qua nhuộm đếm trực tiếp kính hiển vi huỳnh quang vi khuẩn ni cấy NA có chênh lệch lớn đến 200 lần Vibrio vi sinh vật gây bệnh hội chiếm ưu thế, ngược lại, trực khuẩn Gram âm E amnigenus P aeruginosa tình cờ xác định vi khuẩn chiếm ưu có mối tương quan mật thiết đến thông số PO4 (phosphate) pH kết bất ngờ đáng ý nghiên cứu KIẾN NGHỊ Nghiên cứu dừng lại mức độ đếm tổng số tảo cộng sinh không đưa thành phần lồi cụ thể có mặt mẫu san hô Để hiểu rõ clade tảo 280 cộng sinh Symbiodinium hay chí vi tảo khác (Chromera sp.) cộng sinh với san hô, cần có nghiên cứu chun sâu áp dụng phương pháp xác định gen Sử dụng thuốc nhuộm DNA loại bỏ chất bắt màu huỳnh quang sẵn có mơ san hơ để nhuộm đếm vi khuẩn san hô lần thực lồi san hơ tạo rạn kết bật nghiên cứu Với chênh lệch vi khuẩn có mặt thực vi khuẩn ni cấy theo phương pháp truyền thống cho vi khuẩn san hô thực cần chất dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy đặc biệt điều giúp ích cho nghiên cứu đa dạng vi sinh vật sống san hô phụ thuộc ni cấy tương lai Mặt khác, nhóm phẩy khuẩn (hình dạng điển hình Vibrio) xác định vi khuẩn gây bệnh hội cho san hơ, có mối tương quan nghịch có ý nghĩa thống kê với số thông số môi trường, mở cách nhìn vi khuẩn sống san hô đồng thời gợi hướng nghiên cứu cho tương lai Lời cảm ơn: Đề tài thực nguồn kinh phí cấp cho đề tài sở năm 2016 phòng Sinh thái biển, Viện hải dương học Chúng xin gửi lời cảm ơn chân thành Ban Lãnh đạo Viện Hải dương học, đưa ý tưởng tìm hiểu tác động ENSO giúp đỡ tài để chúng tơi thực nghiên cứu Chúng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Phan Kim Hoàng số cán thuộc phòng Nguồn lợi thủy sinh, Viện Hải dương học thực thu mẫu phân loại san hô cứng chuyến thực địa thuộc đề tài ĐTĐL.CN-28/17 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Vo, S T., Pernetta, J C., and Paterson, C J., 2013 Status and trends in coastal habitats of the South China Sea Ocean & Coastal Management, 85, 153–163 [2] Võ Sĩ Tuấn, Lyndon DeVantier, Nguyễn Văn Long, Hứa Thái Tuyến, Nguyễn Xuân Hòa, Phan Kim Hòang, 2002 Nghiên cứu thành phần lồi, cấu trúc quần xã trạng rạn san hô nhằm đề xuất giải pháp quản lý đa dạng sinh học khu Nghiên cứu vi sinh vật sống số lồi san hơ [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] bảo tồn biển Hòn Mun, vịnh Nha Trang Hội nghị khoa học “Biển Đông-2002” Nxb Nông nghiệp Tr 649–690 Tuan, V S., 2002 Report on status of coral reefs in Vietnam: 2000 In Proceedings of the Ninth International Coral Reef Symposium, Bali, 23–27 October 2000, (Vol 2, pp 891–899) Bell, J J., Davy, S K., Jones, T., Taylor, M W., and Webster, N S., 2013 Could some coral reefs become sponge reefs as our climate changes? Global Change Biology, 19(9), 2613–2624 Carballo, J L., Bautista, E., Nava, H., Cruz‐Barraza, J A., and Chávez, J A., 2013 Boring sponges, an increasing threat for coral reefs affected by bleaching events Ecology and Evolution, 3(4), 872–886 Tun, K., Chou, L M., Low, J., Yeemin, T., Phongsuwan, N., Setiasih, N.,Wilson, J., Amri, A Y., Adzis, K A A., Lane, D., Bochove, J-W V., Kluskens, B., Nguyen, V L., Vo, S T., and Gomez, E., 2010 Regional overview on the 2010 coral bleaching event in Southeast Asia In: Status of Coral Reefs in East Asian Seas Regions: 2010 Ministry of the Environment of Japan, 9–27 Rowan, R., Knowlton, N., Baker, A., and Jara, J., 1997 Landscape ecology of algal symbionts creates variation in episodes of coral bleaching Nature, 388(6639), 265–269 Rosenberg, E., Kushmaro, A., Kramarsky-Winter, E., Banin, E., and Yossi, L., 2009 The role of microorganisms in coral bleaching The ISME Journal, 3(2), 139–146 Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., and Zilber-Rosenberg, I., 2007 The role of microorganisms in coral health, disease and evolution Nature Reviews Microbiology, 5(5), 355–362 Kvennefors, E C E., Sampayo, E., Kerr, C., Vieira, G., Roff, G., and Barnes, A C., 2012 Regulation of bacterial communities through antimicrobial activity by the coral holobiont Microbial Ecology, 63(3), 605– 618 [11] Shnit-Orland, M., Sivan, A., and Kushmaro, A., 2012 Antibacterial activity of Pseudoalteromonas in the coral holobiont Microbial Ecology, 64(4), 851–859 [12] Ritchie, K B., 2006 Regulation of microbial populations by coral surface mucus and mucus-associated bacteria Marine Ecology Progress Series, 322, 1–14 [13] Raina, J B., Dinsdale, E A., Willis, B L., and Bourne, D G., 2010 Do the organic sulfur compounds DMSP and DMS drive coral microbial associations? Trends in Microbiology, 18(3), 101–108 [14] Raina, J B., Tapiolas, D., Willis, B L., and Bourne, D G., 2009 Coral-associated bacteria and their role in the biogeochemical cycling of sulfur Applied and Environmental Microbiology, 75(11), 3492–3501 [15] Bourne, D., Iida, Y., Uthicke, S., and Smith-Keune, C., 2008 Changes in coralassociated microbial communities during a bleaching event The ISME Journal, 2(4), 350–363 [16] Garren, M., Son, K., Raina, J B., Rusconi, R., Menolascina, F., Shapiro, O H., Tout, J., Bourne, D G., Seymour, J R., and Stocker, R (2014) A bacterial pathogen uses dimethylsulfoniopropionate as a cue to target heat-stressed corals The ISME journal, 8(5), 999–1007 [17] Raina, J B., Tapiolas, D., Motti, C A., Foret, S., Seemann, T., Tebben, J., Willis, B L., and Bourne, D G., 2016 Isolation of an antimicrobial compound produced by bacteria associated with reef-building corals PeerJ, 4, e2275 [18] Baird, R B., Eaton, A D., and Clesceri, L S., 2012 Standard methods for the examination of water and wastewater (Vol 10) E W Rice (Ed.) Washington, DC: American Public Health Association [19] Leruste, A., Bouvier, T., and Bettarel, Y., 2012 Enumerating viruses in coral mucus Applied and Environmental Microbiology, 78(17), 6377–6379 [20] Team, R C., 2013 R: A language and environment for statistical computing 281 Phạm Thị Miền nnk [21] Lien, Y T., Fukami, H., and Yamashita, Y., 2012 Symbiodinium clade C dominates zooxanthellate corals (Scleractinia) in the temperate region of Japan Zoological Science, 29(3), 173–181 [22] Fabricius, K E., Mieog, J C., Colin, P L., Idip, D., and van Oppen, M J., 2004 Identity and diversity of coral endosymbionts (zooxanthellae) from three Palauan reefs with contrasting bleaching, temperature and shading histories Molecular Ecology, 13(8), 2445–2458 [23] Silverstein, R N., Cunning, R., and Baker, A C., 2015 Change in algal symbiont communities after bleaching, not prior heat exposure, increases heat tolerance of reef corals Global change biology, 21(1), 236–249 [24] Bellantuono, A J., Hoegh-Guldberg, O., and Rodriguez-Lanetty, M., 2011 Resistance to thermal stress in corals without changes in symbiont composition Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 279(1731), 1100–1107 [25] Moore, R B., Oborník, M., Janouškovec, J., Chrudimský, T., Vancová, M., Green, D H., Wright, S W., Davies, N W., Bolch, C J S., Heimann, K., Šlapeta, J., Hoegh-Guldberg, O., Logsdon, J M., and Carter, D A., 2008 A photosynthetic alveolate closely related to apicomplexan parasites Nature, 451(7181), 959–963 [26] Cumbo, V R., Baird, A H., Moore, R B., Negri, A P., Neilan, B A., Salih, A., van Oppen, J H., Wang, Y., and Marquis, C P., 2013 Chromera velia is endosymbiotic in larvae of the reef corals Acropora digitifera and A tenuis Protist, 164(2), 237–244 [27] Hanh, N K., Bettarel, Y., Bouvier, T., Bouvier, C., Hai, D N., Lam, N N., Thuy, N T., Huy, T Q., and Brune, J., 2015 Coral mucus is a hot spot for viral infections Applied and Environmental Microbiology, 81(17), 5773–5783 [28] Nguyen‐Kim, H., Bouvier, T., Bouvier, C., Doan‐Nhu, H., Nguyen‐Ngoc, L., Rochelle‐Newall, E., Baudoux, A C., Desnues, C., Reynaud, S., Ferrier‐Pages, 282 [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] C., and Bettarel, Y., 2014 High occurrence of viruses in the mucus layer of scleractinian corals Environmental Microbiology Reports, 6(6), 675–682 Phạm Thị Miền, Võ Hải Thi, Lê Hoài Hương Hoàng Xuân Bền, 2010 Phân lập vi khuẩn từ san hô mềm Sinularia spp thử nghiệm hoạt tính kháng Tetracycline, Gentamicin, Cefazolin chúng Tuyển tập nghiên cứu biển, 17, 183–195 Pham, T M., Wiese, J., WenzelStorjohann, A., and Imhoff, J F., 2016 Diversity and antimicrobial potential of bacterial isolates associated with the soft coral Alcyonium digitatum from the Baltic Sea Antonie Van Leeuwenhoek, 109(1), 105–119 Meron, D., Atias, E., Kruh, L I., Elifantz, H., Minz, D., Fine, M., and Banin, E., 2011 The impact of reduced pH on the microbial community of the coral Acropora eurystoma The ISME Journal, 5(1), 51–60 Meron, D., Rodolfo-Metalpa, R., Cunning, R., Baker, A C., Fine, M., and Banin, E., 2012 Changes in coral microbial communities in response to a natural pH gradient The ISME Journal, 6(9), 1775–1785 Simon, C., and Daniel, R., 2011 Metagenomic Analyses: Past and Future Trends Applied and Environmental Microbiology, 77(4), 1153–1161 Nithyanand, P., and Pandian, S K., 2009 Phylogenetic characterization of culturable bacterial diversity associated with the mucus and tissue of the coral Acropora digitifera from the Gulf of Mannar FEMS Microbiology Ecology, 69(3), 384–394 de Castro, A P., Araújo, S D., Reis, A M., Moura, R L., Francini-Filho, R B., Pappas, G., Rodrigues, T B., Thompson, F L., and Krüger, R H., 2010 Bacterial community associated with healthy and diseased reef coral Mussismilia hispida from eastern Brazil Microbial Ecology, 59(4), 658–667 Nghiên cứu vi sinh vật sống số lồi san hơ [36] Rachanamol, R S., Lipton, A P., Thankamani, V., Sarika, A R., and Selvin, J., 2014 Molecular characterization and bioactivity profile of the tropical sponge-associated bacterium Shewanella algae VCDB Helgoland marine research, 68(2), 263–269 [37] Yazdani, M., Bahmanyar, M A., Pirdashti, H., & Esmaili, M A (2009) Effect of phosphate solubilization microorganisms (PSM) and plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield and yield components of corn (Zea mays L.) World Academy of Science, Engineering and Technology, 49, 90–92 [38] Gyaneshwar, P., Parekh, L J., Archana, G., Poole, P S., Collins, M D., Hutson, R A., and Kumar, G N., 1999 Involvement of a phosphate starvation inducible glucose dehydrogenase in soil phosphate solubilization by Enterobacter asburiae FEMS microbiology letters, 171(2), 223–229 283 ... kiện nuôi Nghiên cứu vi sinh vật sống số lồi san hơ cấy khác mà nghiên cứu không đáp ứng Sự thật hiểu biết vi sinh vật biển 0,01% sinh thái, di truyền đặc tính sinh học, vi sinh vật ni cấy ước... Tuy nhiên nghiên cứu khác nhiệt độ không làm ảnh hưởng đến tảo cộng sinh hệ vi sinh vật sống san hô, đồng thời đề nghị linh hoạt mối quan hệ sinh lý san hô hệ vi sinh vật sống giúp san hô vượt... 19, Số 2; 2019: 271–283 DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/19/2/10814 https://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst Nghiên cứu vi sinh vật sống số lồi san hơ cứng Hang Rái, Ninh Thuận phƣơng pháp nhuộm