Đánh giá hiệu lực của vacxin cúm AH5N1 chủng RE 1 do trung quốc sản xuất đối với virus cúm gia cầm AH5N1 clade 1 1 trên gà, vịt và ngan

Tuy nhiên trong điều kiện biến đổi của virus cúm gia cầm hiện nay, cầntiến hành nghiên cứu hiệu lực của vacxin đối với các biến chủng mới của viruscúm gia cầm trên các loài gia cầm khác

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực củabản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân vàtập thể

Trước hết tôi xin gửi cảm ơn chân thành tất cả các thầy cô giáo trong toàntrường và các thầy cô giáo trong khoa thú y đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trongsuốt 5 năm dưới mái trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, TS Nguyễn Bá Hiên,trưởng Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, người trực tiếp hướng dẫn tôi thựchiện đề tài này

Qua đây, tôi xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả Cán bộcông tác tại Trung tâm Chẩn Đoán Thú y Trung ương, đặc biệt là ThS NguyễnTùng cùng các cô chú, các anh chị đang làm việc tại Phòng Virus - Trung tâmChẩn Đoán Thú y Trung ương đã tận tình chỉ bảo giúp đỡ tôi trong suốt thờigian thực tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã độngviên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nôi, ngày 10 tháng 05 năm 2012 Sinh viên

NGUYỄN THỊ ÁI

MỤC LỤC

Phần I: MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2

Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 KHÁI NIỆM BỆNH CÚM GIA CẦM 3

2.2 LỊCH SỬ BỆNH CÚM GIA CẦM 3

2.2.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm trên thế giới 3

2.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam 5

2.3 CĂN BỆNH BỆNH CÚM GIA CẦM 7

2.3.1 Cấu trúc chung của virus cúm type A 7

2.3.2 Kháng nguyên của virus 8

2.3.3 Độc lực của virus 9

2.3.4 Khả năng biến chủng của virus 10

2.3.5 Sức đề kháng của virus 11

2.4 DỊCH TỄ HỌC BỆNH CÚM GIA CẦM 11

2.4.1 Loài vật mang virus 11

2.4.2 Động vật cảm nhiễm 12

2.4.3 Sự truyền lây 13

2.5 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH BỆNH CÚM GIA CẦM 13

2.5.1 Triệu chứng 13

2.5.2 Bệnh tích 14

2.6 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH CÚM GIA CẦM 15

2.6.1 Chẩn đoán dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích 15

2.6.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 15

2.7 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG VIRUS CÚM GIA CẦM 15

2.7.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 15

2.7.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu 16

2.8 PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM GIA CẦM 17

2.9 SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM GIA CẦM 18

2.9.1 Các loại vacxin được dùng hiện nay 18

2.9.2 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên thế giới 19

2.9.3 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Việt Nam 20

2.9.4 Những điểm chú ý khi sử dụng vacxin cúm gia cầm 21

Phần III: ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23

3.2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

3.2.1 Nguyên liệu 23

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 30

3.3 CHỈ TIÊU THEO DÕI VÀ ĐÁNH GIÁ 31

3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 32

Phần IV: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 33

4.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA GÀ, VỊT VÀ NGAN SAU KHI TIÊM VACXIN 33

4.2 KẾT QUẢ CÔNG CƯỜNG ĐỘC 36

4.1.1 Kết quả công cường độc ở gà 37

4.2.2 Kết quả công cường độc trên vịt 39

4.2.3 Kết quả công cường độc trên ngan 42

4.2.4 Tổng hợp kết quả công cường độc của gà, vịt và ngan: 44

4.3 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS BÀI THẢI SAU KHI CÔNG CƯỜNG ĐỘC 45

4.3.2 Mức độ bài thải virus sau công cường độc của vịt 48

4.3.3 Mức độ bài thải virus sau công cường độc của ngan 50

4.3.4 Tổng hợp kết quả mức độ bài thải virus sau công cường độc 52

4.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH SAU CÔNG CƯỜNG ĐỘC 53

Phần V: KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 55

5.1 KẾT LUẬN 55

5.2 ĐỀ NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 59

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Công thức pha hỗn hợp gen cho Real time RT-PCR 28

Bảng 3.2 Sơ đồ thí nghiệm: 30

Bảng 3.3 Bảng theo điểm lâm sàng 31

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng cúm sau khi tiêm vacxin của gà bằng phản ứng HI 33

Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng cúm sau khi tiêm vacxin của vịt và ngan bằng phản ứng HI 33

Bảng 4.3 Kết quả công cường độc ở gà 38

Bảng 4.4 Kết quả công cường độc ở vịt 41

Bảng 4.5 Kết quả công cường độc ở ngan 43

Bảng 4.6 Tổng hợp kết quả CCĐ 45

Bảng 4.7 Điểm đánh giá mức bài thải virus thông qua giá trị Ct 46

Bảng 4.8 Mức độ bài thải virus sau công cường độc của gà 47

Bảng 4.9 Mức độ bài thải virus sau công cường độc của vịt 49

Bảng 4.10 Mức độ bài thải virus sau công cường độc của ngan 51

Bảng 4.11 Tổng hợp kết quả bài thải virus sau công cường độc 53

Bảng 4.12 Hiệu giá kháng thể trung bình trước và sau công cường độc 54

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc virus cúm type A 7

Hình 4.1: Hàm lượng kháng thể rung bình sau tiêm vacxin mũi 1 34

Hình 4.2: Tỷ lệ bảo hộ sau tiêm vacxin mũi 1 35

Hình 4.3 Hàm lượng kháng thể trung bình sau tiêm vacxin mũi 2 35

Hình 4.4 Tỷ lệ bảo hộ sau tiêm vacxin mũi 2 36

Hình 4.5.Tỷ lệ chết theo ngày của gà 40

Hình 4.6: Tỷ lệ chết theo ngày của vịt 42

Hình 4.7: Tỷ lệ chết theo ngày của ngan 44

Hình 4.8: Mức độ bài thải virus của gà sau công cường độc 47

Hình 4.9 Mức độ bài thải virus của vịt sau công cường độc 50

Hình 4.10 Mức độ bài thải virus của ngan sau công cường độc 52

Hình 4.11 Hiệu giá kháng thể trung bình trước và sau công cường độc 55

GMT : Geometric Mean Titre – Hiệu giá kháng thể trung bình

HA : Hemagglutination test – Phản ứng ngưng kết hồng cầu

HI : Hemagglutination Inhibition test – Phản ứng ức chế ngưng kết

hồng cầuHPAI : Highly Pathogenic Avian Influenza – Bệnh cúm độc lực cao

LPAI : Low Pathogenic Avian Influenza – Bệnh cúm độc lực thấp

PBS : Photphat Buffered Saline

RT- PCR : Reverse Transcription– Polymerase Chain Reaction

RRT- PCR : Rea-time Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction

Ct : Threshold cycle – chu kỳ ngưỡng

Phần I

MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh cúm gia cầm đã và đang là mối quan tâm lớn của thế giới nói chung

và Việt Nam nói riêng Bệnh đã gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho ngànhchăn nuôi gia cầm và để lại những thiệt hại nặng nề về kinh tế Đặc biệt viruscúm gia cầm chủng độc lực cao H5N1 không chỉ lây truyền bệnh cho gia cầm

mà nó còncó khả năng lây truyền bệnh sang cho người và gây tử vong Bệnh doVirus cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, là một ARN virus có hệgen phân đoạn, có khả năng đột biến mạnh tạo nên các chủng virus mới Bệnhđược Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) xếp vào bảng A - các bệnh truyền nhiễmcực kỳ nguy hiểm

Bệnh cúm gia cầm xuất hiện ở Việt Nam từ cuối năm 2003, tới nay đã cónhiều đợt dich xảy ra với số lượng gia cầm bị chết và bị tiêu hủy do dịch ướctính lên tới hàng nghìn tỷ đồng Các biện pháp phòng chống dịch đã được triểnkhai và áp dụng, song việc tiêm phòng bằng vaxcin cho toàn đàn gia cầm đượckhuyến cáo là một trong những biện pháp chủ động phòng chống dịch bệnh vàlàm giảm thiệt hại do bệnh gây ra đối với ngành chăn nuôi gia cầm Nhưng hiệnnay việc tiêm phòng bằng vacxin đang gặp những khó khăn do virus cúm gia cầm

đã có sự biến đổi gen và xuất hiện các nhánh virus mới Trong đó, virus thuộcnhóm kháng nguyên (clade) 2.3.2 lưu hành ở miền Bắc, duyên hải miền Trung vàTây nguyên Clade 1.1 lưu hành ở các tỉnh phía Nam phân lập được vào khoảngcuối năm 2011 đầu năm 2012 (Lê Thị Bích Nga, Lê Thanh Hòa, 2012)

Tiêm phòng cho đàn gia cầm của Việt Nam chủ yếu dựa vào nguồnvacxin nhập khẩu từ Trung Quốc Giai đoạn 2007-2010, Việt Nam sử dụngvacxin cúm gia cầm chủng RE-1 do Trung Quốc sản xuất khá hiệu quả trong việckhống chế và làm giảm thiệt hại của dịch cúm gia cầm Tuy nhiên từ năm 2010

Trung Quốc chuyển sang sản xuất vacxin cúm gia cầm chủng RE-5 và kì vọngthay thế được vacxin RE-1 Nhưng một số nghiên cứu trong và ngoài nước chorằng vacxin RE-5 không cho hiệu quả như mong đợi Hiện nay ở Việt Nam lưuhành một số loại vacxin cúm khác nhau (do Trung Quốc, Pháp, Hà Lan, Đức sảnxuất),trong đó vacxin RE-1 vẫncho kết quả khá tốt trong thực nghiệm cũng nhưthực tế Tuy nhiên trong điều kiện biến đổi của virus cúm gia cầm hiện nay, cầntiến hành nghiên cứu hiệu lực của vacxin đối với các biến chủng mới của viruscúm gia cầm trên các loài gia cầm khác nhau, từ đó có thể giúp cho công tácphòng chống dịch bệnh cúm gia cầm ở nước ta Chính vì vậy chúng tôi thực hiện

đề tài:

“ Đánh giá hiệu lực của vacxin cúm A/H5N1 chủng RE-1 do Trung Quốc sản xuất đối với virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1 trên gà, vịt và ngan”

2.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Đánh giá được hiệu lực của vacxin cúm A/H5N1 chủng RE-1 do TrungQuốc sản xuất đối với virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1 trên gà, vịt và ngan

Phần II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI NIỆM BỆNH CÚM GIA CẦM

Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus cúm typ A

thuộc họ Orthomyxoviridae Đây là một tác nhân gây bệnh dịch rất lớn, có tính

chất khốc liệt trên gia cầm nói chung

Trước đây, bệnh được gọi là bệnh dịch tả gà (Fowl plague) nhưng từ Hội

nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ (1981) đã thay

thế tên này bằng tên bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly pathogenic

avian influenza-HPAI) (Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, 2004), để chỉ các virus

cúm typ A có độc lực mạnh, lây lan nhanh và gây tỷ lệ tử vong cao ở loài mẫncảm

2.2 LỊCH SỬ BỆNH CÚM GIA CẦM

2.2.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm trên thế giới

Bệnh cúm gia cầm đã xuất hiện cách đây từ rất lâu và được Hippocrates

mô tả từ năm 412 trước công nguyên Trong hơn 100 năm qua, có 4 vụ đại dịchcúm xảy ra vào các năm 1889, 1918, 1957, 1968 (Trần Hữu Cổn, Bùi QuangAnh, 2004)

Năm 1878, tại Italia đã xảy ra một bệnh gây tử vong rất cao đàn gia cầm

và được gọi là bệnh dịch tả gia cầm Năm 1901, Centanni và Savunozzi đã đềcập đến ổ dịch này và xác định được căn nguyên siêu nhỏ qua lọc là yếu tố gây

bệnh (filterable agent).

Năm 1955, Schaffer mới xác định được căn nguyên gây bệnh thuộc nhómvirus cúm type A (H7N7 và H7N1) gây chết nhiều gà, gà tây, chim hoang ở Bắc

Mỹ, Nam Mỹ, Châu Phi, Trung Cận Đông (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự, 2004)

Năm 1963, virus cúm type A được phân lập ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm ditrú dẫn nhập vào đàn gà Cuối thập kỷ 60, kết quả phân lập type H1N1 thấy ở lợn

có liên quan đến những ổ dịch ở gà tây với những triệu chứng đặc trưng ở đường

hô hấp và giảm đẻ Mối liên hệ giữa lợn và gà tây là những dấu hiệu đầu tiên vềvirus cúm ở động vật có vú có thể lây nhiễm và gây bệnh ở gia cầm Nhữngnghiên cứu còn cho thấy phân type H1N1 ở vịt còn truyền cho lợn

Sự lây nhiễm từ chim hoang dã sang gia cầm đã có bằng chứng từ trướcnăm 1970 nhưng chỉ được công nhận khi xác định được tỷ lệ nhiễm virus cúmcao ở một số loài thuỷ cầm di trú (Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ, 2004)

Năm 1971, Beard đã mô tả khá kỹ virus gây bệnh và đặc điểm lâm sàng của

gà trong các ổ dịch cúm gà, gà tây xảy ra ở Bắc Mỹ và gây chủng H7N1 Năm

1979, bệnh được phát hiện ở Canada, Mexico, Achentina (Phạm Sỹ Lăng, 2004)

Những công trình nghiên cứu có hệ thống về bệnh này cũng lần lượt đượccông bố ở Australia (1975), ở Anh (1979) và ở Mỹ (1983-1984), ở Ailen (1983-1984) về đặc điểm sinh học, bệnh học, dịch tễ học, các phương pháp chẩn đoánmiễn dịch và biện pháp phòng chống

Từ sau khi phát hiện ra virus cúm type A, các nhà khoa học thấy rằngvirus cúm có ở nhiều loài chim hoang dã và gia cầm nuôi những vùng khác nhautrên thế giới Bệnh xảy ra nghiêm trọng nhất với gia cầm thuộc subtype H5 và H7

Dịch cúm gia cầm bùng nổ liên tục khắp các châu lục trên thế giới đã thúcđẩy hiệp hội chăn nuôi và các nhà khoa học tổ chức nhiều hội thảo chuyên đề vềbệnh cúm gia cầm Từ đó đến nay, trong các hội thảo về dịch tễ trên thế giới,bệnh cúm gia cầm luôn là một trong những nội dung được coi trọng

Năm 1997, ở Hồng Kông dịch cúm gà xảy ra do virus cúm type A subtypeH5N1 Toàn bộ gia cầm của lãnh thổ này đã bị tiêu huỷ vì bệnh đã gây tử vongcho người (Nguyễn Hoài Tạo, Nguyễn Tuấn Anh, 2004)

Từ cuối năm 2003-2005 đã có 11 nước và vùng lãnh thổ xuất hiện dịchcúm gia cầm H5N1 gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Lào,Indonesia, Trung Quốc, Malaysia, Hồng Kông và Việt Nam Ngoài ra có 7 nước

và vùng lãnh thổ khác có dịch cúm gia cầm các chủng khác là Pakistan, Hoa Kỳ,

Canada, Nam Phi, Ai Cập, Triều Tiên và Đài Loan Trong đợt dịch cúm này cókhoảng 120 triệu gia cầm gồm gà, gà tây, gà sao, gà lôi, vịt, ngan, ngỗng, chimcút, bồ câu và một số loài chim hoang dã đã bị nhiễm bệnh và nằm trong vùngdịch phải tiêu hủy Hàng trăm người bị lây nhiễm, trong đó có trên 20 người bịchết (Vũ Thị Mỹ Hạnh, Tô Long Thành và cộng sự, 2008).

Năm 2005, dịch cúm gia cầm H5N1 đã xảy ra ở Myanmar, Kazăctan,Nga, Ukraina, Rumani và H7 gây ra ở Bình Nhưỡng

Cho đến năm 2006, đầu 2007, nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới

đã có báo cáo về các ổ dịch cúm H5N1 ở gia cầm, đặc biệt tại Indonesia, dịch cúmtấn công làm chết nhiều gia cầm và người Các quốc gia khác có ngành chăn nuôitiến tiến như: Hàn Quốc, Nhật Bản, Nga, Hungari, Rumani, Anh cũng đều ghinhận nhiều ổ dịch cúm ở gia cầm

2.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam

Dịch cúm gia cầm xuất hiện lần đầu tiên ở nước ta vào cuối tháng12/2003 Theo Cục Thú y có thể chia làm 6 đợt dịch như sau:

- Đợt 1: từ tháng 12/2003 đến tháng 3/2004: dịch bệnh đã xảy ra ở 2.574

xã, phường, 381 huyện, thị thuộc 57 tỉnh, thành phố Các tỉnh đã xảy ra nặnggồm: Long An 185 xã, Tiền Giang 135 xã, An Giang 145 xã, Đồng Tháp 116 xã,

Hà Tây 134 xã, Hải Dương 144 xã Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ

là 43,9 triệu con (gà: 30.4 triệu; thuỷ cầm: 13.5 triệu)

- Đợt 2: từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ

ở các hộ gia đình chăn nuôi gia cầm, bệnh xuất hiện ở 46 xã, phường tại 32huyện, quận, thị xã thuộc 17 tỉnh Thời gian cao điểm nhất là tháng 7, sau đógiảm dần, đến tháng 11 cả nước chỉ có 1 điểm phát dịch Tổng số gia cầm mắcbệnh, chết và tiêu huỷ là 84.078 con (gà: 55.999; vịt: 8.132)

- Đợt 3: từ tháng 12/2004 đến tháng 5/2005: trong khoảng thời gian nàydịch đã xuất hiện ở 670 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố Số gia cầmtiêu huỷ là 470.495 gà, 825.689 vịt, ngan

- Đợt 4: từ tháng 10/2005 đến 01/2006: dịch xảy ở cả 3 miền với 24 tỉnh,thành tái phát Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 3.972.763 con, trong đó, gà:1.338.523; thuỷ cầm và loài khác: 2.135.081.

- Đợt 5: bắt đầu và kéo dài trong suốt năm 2007 Dịch không tập trung màrải rác, lẻ tẻ ở khắp nơi và có thể chia nhiều đợt:

+ Từ 12/2006 đến 3/2007 dịch xảy ra trên 83 xã, phường của 33 quận,huyện thuộc 11 tỉnh Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 103.092con, trong đó có 13.622 gà; 89.472 ngan, vịt

+ Từ 5/2007 đến 8/2007, dịch xảy ra ở 167 xã, phường của 10 huyện, thịthuộc 23 tỉnh, thành Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 294.894 con(21.525 gà, 264.549 vịt và 8.775 ngan) Sau khi bị khống chế trong vòng 1tháng, đến tháng 10/2007, dịch lại tái ở 15 xã, phường của 9 huyện, quận, thịtrấn thuộc 6 tỉnh, thành phố

- Đợt 6: từ đầu năm 2008: xảy ra rải rác với 74 đàn gia cầm tại 57 xã,phường của 40 huyện thị thuộc 21 tỉnh phát dịch Tổng số gia cầm tiêu huỷ là60.090 con, trong đó có 23.498 gà, 36.592 thuỷ cầm

Năm 2009, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở 68 xã, phường, thị trấn của 34huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêuhủy trên 127.000 con

Năm 2010, dịch cúm gia cầm xuất hiện ở 63 xã, phường của 37 huyện,quận thuộc 24 tỉnh, thành trên cả nước, làm hơn 75.000 gia cầm chết.

Năm 2011, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở 82 xã, phường của 43 huyện,quận thuộc 22 tỉnh, thành phố, với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là151.356 con

Từ đầu năm 2012 đến nay, dịch cúm gia cầm xảy ra ở 30 xã, phường của

23 huyện, quận thuộc 12 tỉnh, thành phố, với tổng số gia cầm mắc bênh, chết vàtiêu hủy là 35.130 con Trong đó, gà là 4.888 con, vịt là 29.876 con, ngan là 366con

2.3 CĂN BỆNH BỆNH CÚM GIA CẦM

Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc virus cúm type A

Nguyên nhân gây bệnh cúm gia cầm là virus cúm type A, một thành viên

thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm các nhóm virus cúm A, nhóm virus cúm

B, nhóm virus cúm C và nhóm Thogovirus

2.3.1 Cấu trúc chung của virus cúm type A

Hạt virus có dạng hình khối tròn, hình trứng, hoặc dạng khối kéo dài,đường kính khoảng 80-120 nm, phân tử lượng khoảng 250 triệu Dalton

Vỏ virus có bản chất là protein, lipid và hydrocarbon Protein bề mặt cócấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu HA

(hemagglutinin), protein enzym cắt thụ thể (neurominidase) và protein đệm MA (matrix) Đó là những gai, mấu có độ dài 10-14nm, đường kính 4-5nm.

Nucleocapsid bao bọc nhân của virus là tập hợp nhiều protein phân đoạn,

có cấu trúc đối xứng xoắn, độ dài 130-150nm Hệ gen của virus chỉ chứa duynhất axit ribonucleic (RNA) một sợi, có cấu trúc là sợi âm, chia thành 8 phânđoạn, mã hoá cho các loại protein của virus là: HA, NA, PB1, PB2, M1, M2,

NP, PA, NS1, NS2 (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự, 2004)

HA: là một trimer có bản chất glycoprotein type I có chức năng bám dínhvào thụ thể tế bào.

NA: là một tetramer, có nhiệm vụ cắt acid sialic, giúp HA gắn vào thụ thể

và giúp giải phóng RNA từ endosome (thể nội bào) và tạo hạt virus mới

M2: là tetramer có chức năng tạo khe H+ nhằm giúp cởi vỏ virus

M1: tập hợp (assembly) các thành phần của virus và gây ra hiện tượngnảy chồi để giải phóng virus mới hình thành

PB1, PB2, NP và PA: có nhiệm vụ bảo vệ, sao chép, biên dịch RNA

NS2: kết hợp với M1 có nhiệm vụ chuyển RNA từ trong nhân tế bào

ra ngoài nguyên sinh chất

NS1: là protein không cấu trúc (không là đơn vị tạo thành hạt virus)được tổng hợp trong quá trình nhân lên của virus và có nhiệm vụ cắt xénRNA và kích thích sự phiên mã trong quá trình nhân lên của virus (NguyễnTiến Dũng, 2008)

2.3.2 Kháng nguyên của virus

Yếu tố ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin viết tắt là HA) và enzym trung hoà (Neuraminidase viết tắt là NA) là những kháng nguyên có vai trò quan

trọng trong miễn dịch bảo hộ Có tất cả 16 biến thể HA (H1 đến H16) và 9 biếnthể NA (N1 đến N9) HA được coi là yếu tố vừa quyết định tính kháng nguyên,vừa quyết định độc lực của virus cúm A (Nguyễn Tiến Dũng, 2008)

Mỗi một hợp thể kháng nguyên HA và NA tạo nên một subtype Vềmặt huyết thanh học, giữa các subtype không hoặc rất ít có phản ứng chéo.Đây là trở ngại cho việc nghiên cứu vacxin

Các kháng nguyên của virus có thể kích thích cơ thể sinh ra nhiều loạikháng thể, nhưng chỉ có loại kháng thể kháng HA mới có vai trò trung hoàvirus cho bảo hộ miễn dịch Một số kháng thể khác, có tác dụng kìm hãm sốlượng virus nhân lên Ví dụ, kháng thể kháng NA có tác dụng ngăn cản virusgiải phóng, kháng thể M2 ngăn cản chức năng M2 không cho quá trình bao

gói virus xảy ra Nhưng thông thường động vật và người chết rất nhanhtrước khi hệ miễn dịch sản sinh kháng thể (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự, 2004).

2.3.3 Độc lực của virus

Đánh giá độc lực của virus cúm bằng phương pháp gây bệnh cho gà 3-6tuần tuổi: tiêm vào tĩnh mạch cách 0,2ml nước trứng đã được gây nhiễm virusvới tỷ lệ pha loãng 1/10, sau đó đánh giá mức độ bệnh của gà để cho điểm (chỉ

số IVPI) Điểm tối đa là 3 và đó là virus có độc lực cao nhất Theo quy định củaOIE, virus cúm nào có chỉ số IVPI >1.2 trên gà 6 tuần tuổi, hoặc bất cứ viruscúm nào thuộc subtype H5 hoặc H7 có trình tự axit amin trùng với trình tự axitamin của chủng độc lực cao, đều thuộc loại độc lực cao

Biến chủng virus cúm gây bệnh ở loài chim được phân chia theo tính gâybệnh với 2 mức độ độc lực khác nhau Loại virus có độc lực cao gọi là HPAIthường gây chết 100% gia cầm nhiễm bệnh, sau vài giờ đến vài ngày gây nhiễm.Người ta đã phân lập được 19 chủng cúm A thuộc loại HPAI từ loài lông vũ,trong đó, một số đã lây nhiễm và thích ứng gây bệnh trên người Loại thứ hai có

độc lực thấp, gọi là LPAI (Low pathogenic avian influenza) thường nhiễm ở gia

cầm nhưng không hoặc có rất ít biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ chết cũng rất thấp

Sự bội nhiễm vi khuẩn hoặc các bệnh khác cùng với cúm gà làm cho LPAI trởnên có độc lực hơn và gây bệnh ác liệt hơn Bằng chứng cho thấy các chủng cóđộc lực thấp LPAI trong quá trình lưu cữu trong thiên nhiên và đàn gia cầm, sẽđột biến nội gen, hoặc biến đổi tái tổ hợp trở thành các chủng HPAI (Phạm SỹLăng và cộng sự, 2004)

Theo Mary-Jackwood và cộng sự (2008), tất cả các virus cúm phân lậpđược của Việt Nam trong năm 2005-2007 không chỉ có độc lực cao với gà, màcòn gia tăng đáng kể độc lực đối với vịt so với các virus phân lập trước đó Sựtăng độc tính này là hệ quả của sự gia tăng virus nhân lên trong các cơ quan nộitạng và sự thích nghi ở diện rộng hơn của virus đối với các cơ quan nội tạng Sự

thay đổi độc tính của các virus đang lưu hành có ảnh hưởng lớn tới dịch tễ họccủa virus và công tác khống chế.

2.3.4 Khả năng biến chủng của virus

Đột biến điểm (hiện tượng lệch về kháng nguyên - antigen drift) là kiểu

đột biến thường xảy ra, đặc biệt là đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N,tạo ra những sự thay đổi nhỏ về trình tự nucleotit của gen mã hoá Kết quả là tạo

ra các phân type cúm khác với phân type ở giai đoạn đầu ổ dịch

Đột biến do tái tổ hợp di truyền (đột biến thay đổi bản chất kháng nguyên

- antigenic shift) là sự tái tổ hợp di truyền xảy ra định kỳ trong đó có sự sắp xếp

lại các nucleotit do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus cúm khác nhau Điều đó đã tạonên những sai khác cơ bản về bộ gen của virus đời con so với đời bố mẹ Dokiểu gen của virus type A gồm 8 đoạn gen nên từ 2 virus bố mẹ có thể xuất hiện

256 tổ hợp của các virus thế hệ sau (Nguyễn Tiến Dũng, 2008)

Từ đợt dịch cúm đầu tiên tại Việt Nam, virus cúm type A/H5N1 vẫn luôntồn tại trong môi trường và đã có những biến đổi về mặt kháng nguyên

Theo Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (2004), virus cúm gây bệnh từ cuốinăm 2003 đến nay chỉ là một loại duy nhất, có nguồn gốc từ virus cúm lưu

hành ở Trung Quốc, là virus A/Gs/Guangdong/1/96/H5N1 Sự xâm nhập của

subtype virus H5N1 gennotype Z-được WHO ký hiệu là nhánh 1 (clade 1)-từTrung Quốc đã gây nên các ổ dịch lan tràn chưa từng thấy tại Việt Nam suốt từBắc đến Nam Tuy nhiên, đến năm 2005, một nhánh mới của subtype H5N1 làclade 2.3.2 (gennotype G) đã được nhận biết tại nước ta, dần thay thế cho clade

1 tại miền Bắc Trong khi đó virus cúm thuộc clade 1 vẫn tiếp tục gây bệnh tạicác tỉnh phía Nam

Ken Inui (2008), cũng cho biết, trong vòng 10 năm, virus cúm gia cầm

H5N1 (Gs/GD/1/96) đã biến đổi và tạo ra 9 clade HA trong dòng này Trung

Quốc có tất cả các clade này còn các nước láng giềng chỉ có một số Tại ViệtNam, các clade 3, 5 và 8 khó bám rễ, nhưng các clade 1 và 2 có thể tồn tại và

gây thành dịch lớn Tuy nhiên, các loại vacxin cúm được sử dụng ở Việt Namhiện vẫn có hiệu quả đối với các clade này.

2.3.5 Sức đề kháng của virus

Virus cúm type A tương đối nhạy cảm với các chất hoá học như:formalin, natri hypochlorite 5.52%, axit pha loãng 2%… cồn 70% diệt virusnhanh chóng

Chất sát trùng alpha terpineol từ tinh dầu tràm có khả năng sát khuẩn vàlàm giảm sự nhân lên của virus cúm A/H5N1 trên môi trường tế bào Tuy nhiên,

cơ chế tác động của chất này như thế nào cần nghiên cứu tiếp (Trương VănDũng, 2008)

Virus không bền với nhiệt độ, ở 50-600C chỉ vài phút là virus mất độctính Ở nhiệt độ thấp, virus vẫn có thể tồn tại trong phân ít nhất là 3 tháng Trongnước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30oC và trên 30 ngày ở nhiệt độ

0oC, vô hạn định ở nơi nguyên liệu bị đông lạnh Dưới ánh nắng mặt trời chiếutrực tiếp virus chỉ sống được 40 giờ Tia cực tím có thể diệt virus dễ dàng

Virus cúm gia cầm A/H5N1 còn có khả năng gây nhiễm sau 35 ngày sốngtrong phân, nước và đất ở chuồng gia cầm Trong phủ tạng gà, virus tồn tại 24-

39 ngày Trong máu và thịt gia cầm đông lạnh, virus sống được tới 3 tuần

2.4 DỊCH TỄ HỌC BỆNH CÚM GIA CẦM

2.4.1 Loài vật mang virus

Virus cúm gia cầm đã được phân lập ở hầu hết các loài chim hoang dãnhư vịt trời, thiên nga, hải âu, vẹt, mòng biển, diều hâu, chim họ sẻ tuy nhiên,tần suất và số lượng virus phân lập được ở loài thuỷ cầm đều cao hơn các loàikhác Điều tra thuỷ cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non bị nhiễmvirus do tập hợp đàn trước khi di trú

Trong các loài thuỷ cầm thì vịt trời có tỷ lệ nhiễm virus cao hơn cả.Những virus này không gây bệnh cho vật chủ, mà được nhân lên trong đường

ruột và bài thải ra ngoài, trở thành nguồn reo rắc virus cho các loài khác, đặcbiệt là gia cầm (Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kì, 2004).

Cuối tháng 10/2004, OIE, FAO và WHO đã lưu ý các nước đã trải quadịch cúm gia cầm A/H5N1 rằng vịt nuôi có thể đóng vai trò quan trọng trongviệc làm lây lan chủng virus cúm gia cầm A/H5N1 thể độc lực cao cho các giacầm khoẻ và rất có thể lây truyền virus trực tiếp cho con người vì vịt nuôi và gànhiễm bệnh cùng bài thải lượng virus như nhau, nhưng vịt nuôi thường khôngthể hiện các triệu chứng lâm sàng bệnh lý Hiện FAO và OIE đang phối hợpđánh giá vai trò của vịt nuôi nhằm đưa ra chiến lược lâu dài với mục đích khốngchế các ổ dịch cúm gia cầm ở châu Á

Virus cúm gia cầm A/H5N1 lưu hành ở một số khu vực châu Á có độc lựcvới gà, chuột đã được tăng lên và đã mở rộng phổ gây bệnh của nó trên cả loàimèo Một số động vật có vú như cầy vằn, chồn hay chó cũng nhiễm bệnh và bàithải virus (Tô Long Thành, 2005)

2.4.2 Động vật cảm nhiễm

Bệnh cúm được phát hiện ở tất cả các loài chim thuần dưỡng (gia cầm, thuỷcầm) hoặc chim hoang dã Gà, gà tây, chim cút, bồ câu, vịt, ngan đều mắc bệnh.Hiện đã phân lập được virus từ vịt bầu, ngỗng, chim cút, gà gô, gà lôi Vịt nuôinhiễm virus cúm nhưng khó phát hiện triệu chứng do vịt có sức đề kháng với virusgây bệnh, kể cả với chủng có độc lực cao Các loài dã cầm cũng có thể bị bệnhnhưng khó có thể phát hiện được do cách sống hoang dã và đặc tính di trú củachúng Đây là nguồn tàng trữ và reo rắc virus nguy hiểm nhất (Phạm Sỹ Lăng vàcộng sự, 2004)

Gà, ngan, vịt, chim cút mọi lứa tuổi đều mắc bệnh cúm, nhưng ở 4-6 tuầntuổi là mẫn cảm nhất Gia cầm dễ mắc bệnh và có tỷ lệ chết cao nhất ở nơi bệnhphát ra lần đầu và trong tuổi sắp đẻ hoặc thời kỳ đẻ cao nhất Gia cầm có khảnăng sản xuất càng cao thì càng mẫn cảm với virus Con non và già mẫn cảmvới mầm bệnh hơn con trưởng thành

Không chỉ đối với loài chim, virus có thể gây bệnh cho các loài động vật

có vú khác như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu, cá voi và cả con người Nhiều nghiêncứu mới đây cho thấy loài mèo, vốn được coi là không cảm nhiễm với cúm,cũng mắc bệnh và chết (Tô Long Thành, 2005)

2.4.3 Sự truyền lây

Khi gia cầm nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp vàđường tiêu hoá Sự truyền lây được thực hiện theo 2 phương thức là trực tiếp vàgián tiếp:

- Lây trực tiếp do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thôngqua các hạt khí dung được bài tiết từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn vànước uống bị nhiễm

- Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gầnhoặc những dụng cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lâyqua chim, thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển, côn trùng

Như vậy, virus cúm gia cầm dễ dàng truyền qua những vùng khác do conngười, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi

Đối với gia cầm nuôi, nguồn dịch đầu tiên thường thấy là:

- Từ các loài gia cầm nuôi khác nhau ở trong cùng một trang trại hoặctrang trại khác liền kề (như vịt lây sang gà)

- Lây truyền qua trứng

- Từ gia cầm nhập khẩu

- Từ chim di cư, đặc biệt các loài chim nước di trú

- Từ người và các động vật có vú khác (Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, 2004)

2.5 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH BỆNH CÚM GIA CẦM

2.5.1 Triệu chứng

Thời kỳ ủ bệnh từ vài giờ đến 3 ngày Thể quá cấp tính (hay gặp): xảy ra

từ vài giờ đến 24 giờ Thể cấp tính từ 1 đến 4 ngày Thể á cấp tính (ít gặp) có thểtới 7 ngày Bệnh lây lan rất nhanh, gây chết ác tính, chết nhanh và nhiều Biểu

hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh khác nhau, nó phụ thuộc nhiều yếu tố:chủng virus gây độc, số lượng virus xâm nhập, loài cảm nhiễm, tuổi, giới tính,chế độ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm, môitrường, sự cộng nhiễm cùng với các virus, vi khuẩn khác.

Triệu chứng điển hình của bệnh cúm thể độc lực cao ở gia cầm là:

- Chết cao đột ngột, tỷ lệ tử vong cao, có khi đến 100%

- Có các biểu hiện ở đường hô hấp như hắt hơi, thở khò khè, viêm xoang,chảy nhiều nước mắt, nước mũi, dịch nhày màu xám hoặc đỏ xám

- Sưng phù đầu và mặt, mào, tích sưng phù màu tím sẫm

- Xuất huyết dưới da (đặc biệt dưới da chân), tím tái

- Triệu chứng tiêu hoá: ỉa chảy

- Triệu chứng thần kinh: run rẩy, chệnh choạng, co giật, mất thăng bằng,vận động xoay tròn

Trong một số trường hợp, bệnh bùng phát nhanh, trước khi gia cầm chếtkhông thấy có biểu hiện lâm sàng (Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, 2004)

Gia cầm bị nhiễm các chủng virus cúm có độc lực yếu hơn cũng có nhữngtriệu chứng tương tự, với mức độ nhẹ hơn và tỷ lệ chết thấp hơn

Các loài thuỷ cầm (vịt, ngan, ngỗng ) ít khi biểu hiện triệu chứng, nhưngnếu phát bệnh thì viêm xoang, viêm mí mắt, viêm đường hô hấp, tỷ lệ chết cao

2.5.2 Bệnh tích

Khi mổ khám gia cầm chết do cúm có thể thấy các bệnh tích đặc trưng:

- Mào, tích sưng to tím sẫm, phù mí mắt Phù keo nhày và xuất huyết dưới

da đầu, cơ đùi Xuất huyết thành dải, vệt dưới da chân

- Viêm cata và viêm tơ huyết niêm mạc khí quản, niêm mạc đường tiêuhoá Khí quản phù, chứa nhiều dịch nhầy

- Tăng sinh túi khí, viêm tơ huyết tương mạc của các cơ quan nội tạngnhư: màng bao tim, màng gan, màng ruột xuất huyết mỡ vành tim

- Ruột viêm cata và xuất huyết Nội tạng xuất huyết, có thể hoại tử

- Lách, gan, thận, phổi sưng to, hoại tử Viêm ống dẫn trứng, vỡ trứng non.Bệnh gây ra do các chủng virus có độc lực cao thì thấy tụ huyết, xuấthuyết ở da, gan, thận, tim, lách, phổi Nhưng gia cầm chết đột ngột không có cácbệnh tích này (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự, 2004).

2.6 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH CÚM GIA CẦM

2.6.1 Chẩn đoán dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích

Bệnh xảy ra dồn dập, nhanh chóng thành dịch Gà mọi lứa tuổi đều mắcnhưng hay gặp nhất là gà từ 4 đến 6 tuần tuổi Triệu chứng điển hình: thở khó,viêm tịt mũi, sưng đầu, phù mặt, thuỷ thũng, xuất huyết, hoại tử mào, tích, xuấthuyết dưới da thành vệt đỏ Bệnh tích điển hình: thịt thâm, viêm dính phúc mạc,

cơ quan nội tạng bị teo, viêm xuất huyết và hoại tử buồng trứng, ống dẫn trứngviêm, vỡ trứng non

2.6.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Chẩn đoán virus học: nuôi cấy, phân lập virus trên trứng gà có phôi ấp 9-11 ngày hoặc trên môi trường tế bào thận chó MDCK Giám định virus trongdịch nuôi cấy bằng các phản ứng HA, HI

Giám định virus bằng kỹ thuật Real time RT-RCR: cho phép xác địnhvirus với lượng rất nhỏ Khẳng định chắc chắn subtype H5 và H7 căn cứ vàoPrimer đặc thù

Chẩn đoán huyết thanh học: dùng phản ứng HI để phát hiện và xác địnhhiệu giá kháng thể trong huyết thanh gia cầm

Ngoài ra có thể dùng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể

2.7 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG VIRUS CÚM GIA CẦM

2.7.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu là hàng rào phòng thủ đầu tiên chốnglại bất cứ vật ngoại lai nào xâm nhập vào cơ thể Chức năng này được thể hiệnqua các cơ chế:

- Các hàng rào vật lý, hoá học: gồm da, màng nhầy, khu hệ sinh vậtthường trú, các lông mao, axit trong dạ dày và các men tiêu hoá protein.

- Các yếu tố kháng khuẩn có trong dịch tiết của cơ thể: gồm các Enzym,Interferon , các yếu tố gây hoại tử mô bào, tế bào thực bào (Nguyễn Bá Hiên,Trần Thị Lan Hương, 2010)

2.7.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

a Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Trong miễn dịch qua trung gian tế bào, có sự tham gia của các tế bàolympho T, B và các đại thực bào Tế bào T nhận biết kháng nguyên lạ sau khi

nó được các tế bào trình diện kháng nguyên xử lý và trình diện Tế bào Bthành thục trong túi Fabricius nhận biết các kháng nguyên hoà tan và trìnhdiện chúng trên bề mặt Các tế bào TCD4 nhận biết các tế bào có khángnguyên gắn với MHC lớp II, tiết ra các lymphokin kích thích các tế bào Bhoạt hoá thành tương bào sản xuất kháng thể tiêu diệt kháng nguyên Các tếbào TCD8 (T gây độc) có tác dụng gây dung giải các tế bào có mang khángnguyên gắn với MHC lớp I Các tế bào T diệt tự nhiên có khả năng nhận biếtnhiều loại kháng nguyên ngoại lai và kháng nguyên của chính cơ thể vật chủ

đã bị biến đổi, đóng vai trò quan trọng trong tuần tra miễn dịch và tiêu huỷcác tế bào lạ (Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2010)

b Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Các globulin miễn dịch (Immuno globulin-Ig) hay kháng thể được tiết rabởi các tế bào lympho B (sau khi được hoạt hoá trở thành tương bào) là thànhphần chính của miễn dịch dịch thể Kháng thể có trong các dịch của cơ thể vàđược định lượng trong huyết thanh hoặc huyết tương Ở gia cầm có các lớp Igchính là IgM, IgY, IgG và IgA

Một đáp ứng miễn dịch điển hình của gia cầm bắt đầu bằng sự sản xuấtIgM Sau đó đáp ứng miễn dịch chuyển sang sản xuất IgG Đây là kháng thểchính sinh ra trong miễn dịch thứ phát và chiếm ưu thế trong máu của gia cầm

Kháng thể liên kết một cách đặc hiệu với kháng nguyên và trung hoà khángnguyên, đặc biệt đối với các kháng nguyên là virus Những virus bị trung hoàkhông thể bám vào điểm tiếp nhận trên bề mặt của tế bào đích và bởi vậy bịngăn cản tái tổ hợp Đối với mầm bệnh là vi khuẩn, có thể nhân lên ngoài tế bào,nếu mầm bệnh bị bao bọc bởi kháng thể thì có thể bị nuốt vào trong tế bào và bịphá huỷ bởi thể thực bào Kháng thể bao quanh bề mặt mầm bệnh cũng có thểhoạt hoá bổ thể và sản xuất protein bổ thể mới Protein bổ thể gắn với receptorcủa thể thực bào, kích thích cho sự thực bào phân huỷ mầm bệnh (Nguyễn BáHiên, Trần Thị Lan Hương, 2010).

Trí nhớ miễn dịch và đáp ứng miễn dịch thứ phát: đáp ứng miễn dịch

tiên phát xuất hiện khi tiếp xúc lần đầu với kháng nguyên, có độ dài miễn dịchngắn, kết quả là tạo ra một nhóm các tế bào lympho T nhớ có tác dụng làm chođáp ứng miễn dịch khi phơi nhiễm lần sau với cùng loại kháng nguyên được tăngcường mạnh hơn Đáp ứng miễn dịch này có sự tham gia ngay từ đầu của các tếbào T nhớ Kháng thể được sản xuất ra nhanh hơn, nhiều hơn và đáp ứng miễndịch kéo dài hơn so với đáp ứng miễn dịch tiên phát Cơ thể gia cầm tạo đượctrạng thái miễn dịch đối với kháng nguyên đó và trí nhớ miễn dịch được duy trì.Đây chính là cơ sở của việc tiêm phòng vacxin cúm và nhắc lại sau một thời gian

ở gia cầm

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành kháng thể:

- Bản chất kháng nguyên

- Đường xâm nhập của kháng nguyên

- Liều lượng kháng nguyên

- Số lần đưa kháng nguyên vào cơ thể

- Chất bổ trợ kháng nguyên

- Trạng thái sức khỏe, dinh dưỡng, cân đối axit amin trong khẩu phần, cácyếu tố stress có hại

2.8 PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM GIA CẦM

Phòng chống dịch cúm gia cầm là chương trình tổng hợp của công tácgiám sát, chẩn đoán bệnh, kiểm dịch vận chuyển, giết mổ gia cầm kết hợp vớicác biện pháp an toàn sinh học tăng cường, tiêu huỷ, tiêu độc, khử trùng các ổdịch, đồng thời tuyên truyền, giáo dục người dân về dịch bệnh Tiêu huỷ toànđàn gia cầm bị bệnh và đàn gia cầm có tiếp xúc với đàn bị bệnh là biện pháp bắtbuộc để tránh bệnh lây lan (Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, 2004)

Hiện nay, việc sử dụng vacxin được coi là cách để làm giảm thiệt hại dobệnh cúm gia cầm gây ra đối với ngành chăn nuôi gia cầm ở Châu Á Song điềunày có thể dẫn đến sự tiến hoá của các chủng virus đang lưu hành thành cácchủng mới (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự, 2004) Do đó, sử dụng vacxin phải kếthợp chặt chẽ với giám sát sau tiêm phòng, giám sát lưu hành virus ở các đàn đãđược tiêm phòng để có biện pháp xử lý kịp thời

- Vacxin vô hoạt đồng chủng: hiệu lực của vacxin này trong việc ngăn

ngừa bệnh và giảm thải lượng virus ra ngoài môi trường đã được chứng minhqua các thử nghiệm Tuy nhiên nhược điểm của các loại vacxin này là khôngphân biệt được gia cầm đã tiêm vacxin với những con tiếp xúc với mầm bệnh,trừ những con chưa tiêm phòng được nhốt riêng ở trong chuồng Ví dụ: VacxinH5N1 của hãng Weike (Trung Quốc)

- Vacxin vô hoạt dị chủng: loại vacxin này có đặc điểm là chủng virus

vacxin có kháng nguyên H giống với chủng virus trên thực địa nhưng có kháng

nguyên N dị chủng Đáp ứng miễn dịch sinh ra bởi nhóm kháng nguyên H đồngchủng, trong khi kháng thể chống N sản sinh ra bởi virus thực địa có thể coi nhưchất đánh dấu sự lây nhiễm trên thực địa Ví dụ: Vacxin vô hoạt dị chủng H5N2của Intervet (Hà Lan), vacxin H5N2 của Weike (Trung Quốc).

Trong hai loại vacxin đồng chủng và dị chủng, mức độ bảo hộ lâm sàng

và việc làm giảm thải trừ virus ra môi trường của vacxin đồng chủng cải thiệnhơn, do cùng một khối lượng vacxin thì vacxin đồng chủng có nhiều khángnguyên hơn Việc lựa chọn vacxin dị chủng cho phép áp dụng chiến lược DIVA

(Difference Infection between Vaccination) nhằm phân biệt con nhiễm bệnh tự

nhiên với con tiêm vacxin (Tô Long Thành, 2007)

b Vacxin tái tổ hợp

Vacxin tái tổ hợp cho phép phân biệt giữa động vật nhiễm bệnh và độngvật được tiêm vacxin, vì chúng không sản sinh kháng thể chống lại khángnguyên nucleoprotein phổ biến ở tất cả các virus cúm gia cầm Chỉ những độngvật nhiễm bệnh trên thực địa mới tạo ra kháng thể nhóm A (nucleoprotein) vàphát hiện ra kháng thể này qua phản ứng kết tủa ngưng kết kép trên thạch hoặcphản ứng ELISA Việc sử dụng các vacxin này cũng được giới hạn với nhữngloài mà virus đích sẽ nhân lên hoặc chỉ giới hạn trong đàn gà có huyết thanh âmtính đối với virus đích Ví dụ: vacxin sống TROVAC (virus đậu tái tổ hợp cúmH5) của Merial và H5N1 của Weike (Trung Quốc)

2.9.2 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên thế giới

Mặc dù có một số loại vacxin đã được nghiên cứu và thử nghiệm trongphòng thí nghiệm về khả năng ứng dụng ngoài thực địa nhưng chỉ có 2 loạivacxin được cấp giấy phép và được sử dụng đối với gia cầm: các loại vacxincúm toàn thân vô hoạt và vacxin vector đậu gà tái tổ hợp với gen AI H5 nhận từvirus cúm của gà tây

Sử dụng vacxin đã được sử dụng trên thực địa chưa được các thông báo

cụ thể, nhưng có một số nguồn thông tin cho rằng Mexico đã sử dụng 1 tỷ 300

triệu liều virus vô hoạt và 850 triệu liều vacxin tái tổ hợp đậu gà trong chươngtrình sử dụng vacxin chống bệnh cúm từ đầu tháng 1/1995 và đã thanh toánđược bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao do virus H5N2 và tháng 6/1995, mặc dùvirus H5N2 chủng độc lực thấp vẫn lưu hành Indonexia cũng sử dụng vacxin AIH5 vô hoạt Từ năm 1995, Pakistan cũng sử dụng vacxin phòng cúm ở cả ổ dịchH7N3 thể độc lực cao Các vacxin vô hoạt chế từ chủng virus H9N2 độc lựcthấp đã và đang được sử dụng ở một số nước châu Á, vùng Cận Đông và Đông

Âu Gần đây, vacxin vô hoạt nhũ dầu H7 đã được dùng cho các vùng nguy cơcao ở phía Bắc Italia và tại một công ty nuôi gà con một ngày tuổi ở Mỹ

Trung Quốc là nước sử dụng nhiều vacxin cúm nhất Trung Quốc đã cóbản tường trình về kết quả của các loại vacxin đang được sử dụng tại nước này,bao gồm:

- Vacxin vô hoạt chủng H5, N-28: được phê chuẩn từ tháng 12/2003 vàđược sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc trong các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lựccao vào đầu năm 2004

- Vacxin vô hoạt virus cúm tái tổ hợp (subtype H5N1, chủng Re-1): đượcphê chuẩn tháng 1/2005 Vacxin được đánh giá là rất có hiệu quả trong tạo miễndịch chống cúm với hiệu giá kháng thể cao và thời gian bảo hộ dài hơn Thuỷcầm được tiêm vacxin này không bị nhiễm và bài thải virus cúm

- Vacxin sống virus đậu tái tổ hợp phòng cúm gia cầm H5: được phêchuẩn tháng 1/2005 và được nhiều nước sử dụng như Trung Quốc, Mexico sửdụng loại vacxin này có thể phân biệt được miễn dịch do tiêm phòng vacxin hay

bị nhiễm tự nhiên

- Hiện Trung Quốc đã và đang đưa vào sử dụng vacxin dạng vô hoạt nhũdầu H5N1 chủng Re-5 và dự định trong thời gian tới sẽ đưa ra thị trường mộtloại vacxin mới là Re-6

2.9.3 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Việt Nam

Từ tháng 7/2005, “Dự án sử dụng vacxin nhằm khống chế và thanh toánbệnh cúm gia cầm” đã triển khai tại Việt Nam Nước ta đã tiến hành tiêm phòngthử nghiệm các loại vacxin cúm gia cầm ngoại nhập trên địa bàn tỉnh Nam Định

và Tiền Giang Sau đó đã triển khai tiêm phòng trên địa bàn cả nước và thựchiện liên tục qua các năm Mỗi năm có 2 đợt tiêm phòng vào tháng 4-5 và tháng9-10, trước thời điểm dịch cúm gia cầm có nguy cơ bùng phát cao nhất Một sốloại vacxin được sử dụng ở Việt Nam như:

- Vacxin nhũ dầu vô hoạt H5N2 (Trung Quốc): là loại vacxin dị chủng bấthoạt, sử dụng chủng virus A/Turkey/England/N28/73 (H5N2)

- Vacxin vô hoạt dạng nhũ dầu H5N1 (Trung Quốc): là loại vacxin đồngchủng bất hoạt, sử dụng chủng virus A/Harbin/Re-1/2003

- Vacxin Nobilis Influenza H5 (Hà Lan): đây là loại vacxin dị chủng, sửdụng chủng virus A/chicken/Mexico/232/94/CPA

- Vacxin Trovac AIV H5 (vacxin đậu-cúm dạng sống, đông khô): làvacxin chứa virus đậu gà sống làm vectơ có mang gen virus cúm gia cầm chủng

2.9.4 Những điểm chú ý khi sử dụng vacxin cúm gia cầm

Theo quan điểm của OIE, FAO, thì vacxin nên được sử dụng trong mộtchiến lược toàn diện phòng chống bệnh cúm gia cầm, bao gồm 5 bước là: antoàn sinh học, nâng cao nhận thức người dân, chẩn đoán và giám sát, loại bỏ giacầm nhiễm bênh và sử dụng vacxin (Lê Văn NăM, 2007)

Trước khi sử dụng vacxin cần phải lưu ý những vấn đề sau:

- Vacxin sử dụng phải cùng subtype H và phải được chứng minh trên bảnđộng vật là có đủ khả năng bảo hộ chống lại sự xâm nhập của virus thực địa

- Vacxin cần phải được sản xuất theo công nghệ đã tiêu chuẩn hoá để đảmbảo có một vacxin hiệu quả và phù hợp về chủng virus.

- Cần có các hoạch định trước về bảo quản tốt vacxin, phân phối sử dụngvacxin hợp lý

- Đảm bảo được việc giám sát huyết thanh học và virus học để xác địnhvirus cường độc có lưu hành trong đàn gia cầm được dùng vacxin hay không

- Phải có một kế hoạch loại trừ để phòng tránh việc sử dụng vĩnh viễnvacxin

Phần III

ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà, vịt và ngan được tiêm vacxin cúmA/H5N1 chủng RE-1 của Trung Quốc trước khi công cường độc

- Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin bằng phương pháp công cườngđộc với virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1

- Đánh giá mức độ bài thải virus từ gà, vịt và ngan nhiễm virus sau côngcường độc ra môi trường

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà, vịt và ngan sống sót sau khi côngcường độc

3.2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.2.1 Nguyên liệu

- Gà, vịt và ngan khỏe mạnh, chưa có miễn dịch với virus cúm gia cầm A/H5N1 và được nuôi dưỡng theo quy trình chăn nuôi của Trung tâm nghiên cứugia cầm Thụy phương

- Vacxin cúm gia cầm tái tổ hợp vô hoạt subtyp H5N1 chủng Re-1 doTrung Quốc sản xuất

- Virus: virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1 thuộc clade 1, do Trung tâmchẩn đoán thú y Trung ương phân lập từ ổ dịch tại Kiên Giang vào tháng 2 năm2012

- Kháng nguyên chuẩn A/H5N1 của Anh để kiểm tra đáp ứng kháng thểtrước và sau khi công cường độc bằng phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng

cầu (HI-Hemoglutination Inhibition).

- Kit Rneasy Mini Kit Qiagen chiết tách RNA do hãng Qiagen sản xuất

- Kit Invitrogen Superscript One-step RT-PCR và primer/probe để pháthiện gen M, H5, N1 do CDC (USA) cung cấp để kiểm tra sự bài thải virus sau

khi công cường độc bằng phương pháp Real time RT-PCR

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Trước và sau công sử dụng các phương pháp sau để theo dõi và kiểm tradiễn biến cũng như các kết quả của nghiên cứu:

a Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

- Dịch ngoáy họng, khí quản: đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáythu lấy dịch nhày, sau đó từ từ rút tăm bông ra rồi đưa vào ống chứa dung dịchbảo quản, cắt que vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp

- Mẫu huyết thanh: lấy 3-5ml máu tĩnh mạch cánh gia cầm vào ốngnghiệm, để nghiêng, chờ máu đông chắt lấy huyết thanh Mẫu huyết thanh có thể

để ở nhiệt độ 40C trong 1 tuần, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở nhiệt độ -200C

- Mẫu tổ chức bệnh phẩm: lấy kéo cắt phần tổ chức cần lấy cho vào ốnglưu mẫu hoặc túi nilon sạch, bảo quản lạnh Mẫu tổ chức có thể cho vào dungdịch bảo quản Bệnh phẩm sau khi cho vào dung dịch vận chuyển có thể bảoquản ở 40C từ 1-2 ngày, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở nhiệt độ -200C

b Phương pháp mổ khám gia cầm

Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, các lỗ tự nhiên, khớp, cáctổn thương

Mổ khám kiểm tra bên trong:

- Nhúng ướt lông gia cầm bằng nước có pha dung dịch sát trùng virkon s

- Đặt gia cầm nằm ngửa, dùng kéo hoặc dao cắt da giữa vùng bụng và bẹnhai bên chân, bẻ chân sang hai bên đồng thời kéo da bộc lộ hai cơ đùi

- Cắt da vùng giữa lỗ huyệt và xương lưỡi hái, một tay cầm hai chân, taykia cầm phần da trên xương hái kéo ngược lên tới tận vùng diều bộc lộ cơ ngực

- Kiểm tra cơ ngực, cơ đùi, xương lưỡi hái về tình trạng khô cơ, xuấthuyết, biến dạng v.v

- Dùng kéo hoặc dao rạch da từ phần diều lên tận phía dưới mỏ bộc lộdiều, thực quản, khí quản, tuyến thymus để kiểm tra bên ngoài.

- Dùng kéo cắt ngang phần cơ giữa lỗ huyệt và xương lưỡi hái, cắt tiếp lênphía trên hai bên sụn sườn qua xương đòn, xương quạ, loại những tổ chức dính,nhấc bỏ xương lưỡi hái ra ngoài, bộc lộ xoang bụng và xoang ngực

- Quan sát các túi khí và phía ngoài các cơ quan nội tạng trong xoangbụng và xoang ngực

- Lấy máu tim và các tổ chức nội tạng cho nuôi cấy xét nghiệm

- Lấy gan, mật, lách ra để kiểm tra màu sắc, kích thước, hoại tử v.v

- Kiểm tra tuyến tuỵ

- Cắt đứt phía trên dạ dày tuyến, lật toàn bộ dạ dày, ruột ra phía sau đểkiểm sau tránh nhiễm bẩn dụng cụ và các tổ chức khác

- Kiểm tra toàn bộ cơ quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng, dịchhoàn, ống dẫn tinh)

- Kiểm tra thận, ống dẫn niệu

- Kiểm tra túi Fabricius bên ngoài và bên trong về hình dáng, kích thước,màu sắc, dịch

- Dùng kéo mở một bên cạnh mỏ quan sát xoang miệng Cắt ngang mỏtrên, kiểm tra xoang

- Cắt dọc thực quản thẳng tới diều kiểm tra dịch, chất chứa và mùi bên trong

- Cắt dọc khí quản kiểm tra dịch, xuất huyết, hoại tử bên trong

- Kiểm tra xoang bao tim, dịch bên trong, mở tim kiểm tra cơ, các xoang

và van v.v

- Tách phổi khỏi các xương sườn kiểm tra về màu sắc, độ xốp

- Bộc lộ dây thần kinh cánh ở trước xương sườn thứ nhất, dây thần kinhhông ở trong cơ đùi hoặc trong xoang chậu dưới thận để kiểm tra

- Rạch khớp gối kiểm tra dịch, bẻ xương đùi kiểm tra độ cứng mềm, chẻdọc xương đùi kiểm tra tuỷ

- Cắt đầu gia cầm ở đốt sống atlas, lột da, dùng kéo cắt xương sang haibên từ lỗ chẩm đến cạnh trước xương đỉnh, lật hộp sọ bộc lộ não Dùng kéocong vô trùng tách màng não, cắt các dây thần kinh lấy não.

- Dùng dụng cụ vô trùng lấy mẫu bệnh phẩm cho xét nghiệm

- Dùng kéo rạch ruột rạch từ dạ dày tuyến xuống tận hậu môn, kiểm tracác tổn thương, hoại tử, xuất huyết

Xử lý hấp tiêu độc xác gia cầm (Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, 2005)

c Phương pháp phát hiện kháng ngyên.

Phản ứng ngưng kết hồng cầu - HA dùng để kiểu tra hiệu giá kháng

nguyên và chuẩn độ kháng nguyên dùng trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (chi tiết xem phụ lục 1)

d Phương pháp phát hiện kháng thể.

Phát hiện kháng thể và xác định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngăntrở ngưng kết hồng cầu-HI (chi tiết xem phụ lục 2)

e Phương pháp Real time RT-PCR.

+ Chiết tách ARN bằng kit Rneasy Mini Kit Qiagen.

- Cho 600l dung môi RLT vào ống 1,5ml

- Lấy 200l mẫu (dịch nổi) vào ống có chứa dung dịch RLT

- Lắc đều (Votex) trong 15 giây

- Cho 400l cồn Ethanol 100% (cồn tuyệt đối)

- Rửa lần 2: lấy 500l dung dịch RPE nhỏ vào cột lọc, ly tâm ở tốc đô

10000 vòng trong 15 giây

- Chuyển cột lọc sang ống thu mới

- Cho tiếp 500 l dung dịch RPE vào cột lọc ly tâm 10000 vòng 15 giây

- Chuyển cột lọc vào ống thu mới

- Ly tâm cột lọc 12000 vòng/phút trong 2 phút

- Thu RNA: chuyển cột lọc sang ống 1,5ml mới

- Cho 50l nước sạch RNase vào cột lọc Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

- Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút

- Bỏ cột lọc, hút nước có chứa ARN sang ống 1,5ml (ống sạch Rnase)mới

- Cất mẫu ARN ở 40C trong ngày nếu chạy phản ứng PCR ngay và cất ở

-200C để lưu mẫu trong thời gian dài

+ Tiến hành phản ứng Real time RT-PCR

Khái quát Real time PCR:

Real time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thànhhàng tỷ bản sao dựa quang vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ốngphản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuyếch đại xảy ra để có thể đọcđược sau mỗi chu kỳ nhiệt

Sự phát hiện sản phẩm PCR sẽ dựa vào cường độ huỳnh quang của bìnhphản ứng Hàm lượng chất phát huỳnh quang sẽ tăng dần theo chu kỳ nhiệt và tỷ

lệ thuận với sản phẩm được nhân bản Cường độ phát huỳnh phụ thuộc vào hàmlượng chất phát huỳnh quang (Phạm Hùng Vân, 2008)

Phương pháp Real time PCR định lượng khắc phục được một số hạn chếcủa PCR cổ điển như: độ đặc hiệu và nhạy cảm cao hơn, thời gian phát hiện kếtquả phản ứng ngắn, không cần chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR, có thể địnhlượng chính xác được sản phẩm PCR, trong khi sử dụng PCR cổ điển việc phânbiệt dựa vào độ lớn của vạch thu được sau điện di

Phương pháp Real time RT-PCR là kỹ thuật để phát hiện với virus cónhân là RNA, như virus cúm H5N1 Phản ứng cần qua bước phiên mã ngược(Reverse transcription) để chuyển RNA của virus thành DNA, làm khuônmẫu cho quá trình PCR.

Nguyên liệu phương pháp Real time RT-PCR dùng cho xác định lượng virus cúm H5N1:

- Khuôn RNA là đoạn cần nhân bản

- Nước cất vô trùng (Rnase-free)

- RNA đối chứng dương tính M, H5, H7 của virus cúm H5N1

- Hai đoạn mồi oligonucleotit (primer), và probe (mẫu dò)

- Enzym DNA polymerase chịu nhiệt

- Các nucleotit tự do: dATP, dGTP, dCTP, dTTP

- Dung dịch đệm, Mg2+

Thực hiện kỹ thuật Real time RT-PCR: phải thực hiện trong khu vực

“sạch” gồm có buồng cấy vô trùng, tủ âm, các dụng cụ và khu vực nhân gen.Không được để các chất có RNA vào khu vực “sạch” và phải luôn thay găng taytrước khi vào khu vực “sạch”

- Trong buồng vô trùng “sạch”, chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix)với các thành phần đủ dùng cho số lượng mẫu cần xét nghiệm

- Phản ứng Real time RT-PCR được tiến hành với những thành phần saucùng với cặp mồi và chu kỳ thích hợp

- Công thức pha hỗn hợp nhân gen cho Real time RT-PCR (Invitrogen

Superscript One-step RT-PCR) :

Bảng 3.1 Công thức pha hỗn hợp gen cho Real time RT-PCR

2X Reaction mix 12.5l

- Chuyển Master mix sang buồng cho mẫu RNA và cho hỗn dịch phảnứng (20l) vào ống Smart Cycler

- Cho 5l mẫu RNA vào ống Smart Cycler Đóng nắp ống, số ống phảnứng tương ứng với với mẫu xét nghiệm

- Cho 5l RNA đối chứng dương vào ống đối chứng dương tính và 5lnước sạch RNase vào ống đối chứng âm tính

- Đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR,bắt đầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu đối chứng dương tính, âmtính và phần ký hiệu mẫu trong bảng kết quả Lưu chương trình chạy máy

- Cài đặt chương trình phân tích dữ liệu cho máy chu kỳ nhiệt SmartCycler và chạy chương trình

Phân tích kết quả xét nghiệm: phân tích kết quả dựa vào chu kỳ ngưỡng Ct(threshold cycle) Chu kỳ ngưỡng hay Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm nàythiết bị real-time ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứngbắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền Để có thể xác định được cường độhuỳnh quang nền, thiết bị real-time thường ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnhquang xuất hiện trong ống phản ứng trong một số chu kỳ đầu, chúng ta gọi làcác chu kỳ nền, và lấy trung bình cộng của các cường độ huỳnh quang này làmcường độ huỳnh quang nền Đường cắt ngang đi qua cường độ huỳnh quang nền

này được gọi là đường nền Chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu

kỳ mà ở đó đường nền cắt đường biểu diễn khuếch đại

Vacxin RE-1,mũi 1

Vacxin RE-1,mũi 1

Vacxin RE-1,

Đối

(Ghi chú: mũi 1: 0.3ml/con, mũi 2: 0.5ml/con)

- Lấy máu gà, vịt và ngan trước khi công cường độc để kiểm tra hàmlượng kháng thể bằng phản ứng HI

- Tiến hành công cương độc bằng virus cường độc A/H5N1 clade 1.1thuộc clade 1 phân lập được vào cuối năm 2011 đầu năm 2012 và theo dõi trong

12 ngày

- Mổ khám gà, vịt và ngan chết để kiểm tra bệnh tích