đánh giá hiệu lực của vacxin cúm gia cầm chủng re 1 và re 5 do trung quốc sản xuất đối với virus h5n1 phân nhóm 2 3 2 1a trên đàn gà nuôi thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ QUANG TUYẾN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA VACXIN CÚM GIA CẦM CHỦNG RE-1 VÀ RE-5 DO TRUNG QUỐC SẢN XUẤT ĐỐI VỚI VIRUS H5N1 PHÂN NHÓM 2.3.2.1A TRÊN ĐÀN GÀ NUÔI THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ QUANG TUYẾN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA VACXIN CÚM GIA CẦM CHỦNG RE-1 VÀ RE-5 DO TRUNG QUỐC SẢN XUẤT ĐỐI VỚI VIRUS H5N1 PHÂN NHÓM 2.3.2.1A TRÊN ĐÀN GÀ NUÔI THÍ NGHIỆM CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS LẠI THỊ LAN HƯƠNG HÀ NỘI, NĂM 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Mọi giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2016 Tác giả luận văn Ngô Quang Tuyến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, cố gắng nỗ lực thân, nhận giúp đỡ động viên nhiều cá nhân tập thể Nhân dịp xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú y, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam tạo điều kiện cho theo học chương trình đào tạo Thạc sĩ học viện Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô TS Lại Thị Lan Hương giảng viên môn Giải phẫu – Tổ chức, Khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tới tất Giảng viên, cán công tác Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, Khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Đặc biệt PGS.TS Nguyễn Thị Lan tận tình giúp đỡ trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp gia đình giúp đỡ, động viên hoàn thành chương trình học tập thực đề tài Hà Nội ngày 10 tháng 01 năm 2016 Tác giả luận văn Ngô Quang Tuyến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii MỤC LỤC Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục bảng viii Danh mục biểu đồ ix Danh mục chữ viết tắt x MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm .3 1.2.1 Lịch sử cúm gia cầm giới .3 1.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm Việt Nam 1.2.3 Các phân nhóm (clade) virus cúm H5N1 Việt Nam 1.3 Virus cúm gia cầm 10 1.3.1 Hình thái cấu trúc chung virus cúm type A 10 1.3.2 Kháng nguyên virus cúm gia cầm 11 1.3.3 Độc lực virus cúm gia cầm 12 1.3.4 Khả biến chủng virus cúm gia cầm 12 1.3.5 Sức đề kháng virus cúm gia cầm 13 1.3.6 Nuôi cấy lưu giữ virus cúm gia cầm 14 1.4 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 14 1.4.1 Loài vật mắc bệnh 14 1.4.2 Sự truyền lây 14 1.5 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus cúm A tế bào vật chủ 15 1.6 Triệu chứng bệnh tích bệnh cúm gia cầm 16 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 1.6.1 Triệu chứng 16 1.6.2 Bệnh tích 17 1.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm 18 1.7.1 Chẩn đoán dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng bệnh tích 18 1.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 18 1.8 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm gia cầm 18 1.8.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 18 1.8.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu 19 1.9 Phòng chống bệnh cúm gia cầm 20 1.10 Sử dụng vacxin phòng chống bệnh cúm gia cầm 21 1.10.1 Các loại vacxin dùng 21 1.10.2 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm giới 22 1.10.3 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm Việt Nam 23 1.10.4 Những điểm ý sử dụng vacxin cúm gia cầm 24 1.11 Nghiên cứu nước bệnh cúm gia cầm 24 1.11.1 Kết nghiên cứu nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 Việt Nam 24 1.11.2 Kết nghiên cứu lưu hành virus cúm gia cầm Việt Nam 24 1.11.3 Kết nghiên cứu phân nhóm (clade) virus cúm H5N1 Việt Nam 25 CHƯƠNG II NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nguyên liệu 26 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu bảo quản mẫu 27 2.3.2 Phương pháp mổ khám gia cầm 27 2.3.3 Phương pháp phát kháng nguyên 28 2.3.4 Phương pháp phát kháng thể 28 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v 2.3.5 Phương pháp Real-time RT-PCR (Real-time reverse- transcription polymerase chain reaction) 29 2.4 Bố trí thí nghiệm 32 2.5.Chỉ tiêu theo dõi đánh giá 33 2.6 Xử lý số liệu 33 CHƯƠNG III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 34 3.1 Kết kiểm tra đáp ứng miễn dịch gà sau tiêm vacxin 34 3.1.1 Kết kiểm tra đáp ứng miễn dịch gà sau tiêm vacxin Re-1 34 3.1.2 Kết kiểm tra đáp ứng miễn dịch gà sau tiêm vacxin Re-5 36 3.1.3 So sánh đáp ứng miễn dịch gà lô vacxin Re-1 lô vacxin Re-5 38 3.1.4 So sánh đáp ứng miễn dịch gà tiêm vacxin mũi mũi đạt trước công 40 3.2 Kết công cường độc 42 3.2.1 Kết công cường độc gà với lô vacxin Re-1 44 3.2.2 Kết công cường độc gà với lô vacxin Re-5: 47 3.2.3 So sánh kết công cường độc gà lô vacxin Re-1 lô vacxin Re-5: 50 3.3 Kết định lượng virus thải sau công cường độc 52 3.3.1 Mức độ thải virus sau công cường độc gà thí nghiệm với vacxin Re-1 52 3.3.2 Mức độ thải virus sau công cường độc gà thí nghiệm với vacxin Re-5 54 3.3.3 So sánh kết thải virus sau công cường độc lô vacxin Re-1 lô Vacxin Re-5: 56 3.4 Kết kiểm tra đáp ứng miễn dịch sau công cường độc 57 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 61 Kết luận 61 Đề nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 64 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC BẢNG Số bảng 3.1 Tên bảng Trang Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể gà sau tiêm vacxin Re-1 35 3.2 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể gà sau tiêm vacxin Re-5 37 3.3 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể H5N1 trước công phản ứng HI 38 3.4 Kết kiểm tra đáp ứng miễn dịch gà trước công cường độc 40 3.5 Kết công cường độc gà với lô vacxin Re-1 44 3.6 Kết công cường độc gà với lô vacxin Re-5 48 3.7 Tổng hợp kết sau công cường độc lô tiêm vacxin Re-1 lô tiêm vacxin Re-5 50 3.8 Mức độ thải virus sau công cường độc gà thí nghiệm với vacxin Re-1 52 3.9 Mức độ thải virus sau công cường độc gà thí nghiệm với vacxin Re-5 55 3.10 Tổng hợp kết thải virus sau công cường độc hai nhóm vacxin Re-1 Re-5 57 3.11 Hiệu giá kháng thể trước sau công cường độc 58 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Số biểu đồ 3.1 Tên biểu đồ Trang Phân bố mức hiệu giá kháng thể huyết gà tiêm vacxin Re-1 35 3.2 Phân bố mức hiệu giá kháng thể huyết gà tiêm vacxin Re-5 37 3.3 Hiệu giá kháng thể trung bình sau tiêm vacxin 39 3.4 Tỷ lệ bảo hộ mặt huyết học sau tiêm vacxin 39 3.5 Biểu đồ hàm lượng kháng thể trung bình gà sau tiêm vacxin 41 3.6 Biểu đồ tỷ lệ bảo hộ gà mặt huyết học sau tiêm vacxin 41 3.7 Tỷ lệ chết theo ngày gà thí nghiệm với vacxin Re-1 47 3.8 Tỷ lệ chết theo ngày gà thí nghiệm với vacxin Re-5 50 3.9 Mức độ thải virus gà thí nghiệm với vacxin Re-1 53 3.10 mức độ thải virus gà thí nghiệm với vacxin Re-5 56 3.11 Hiệu giá kháng thể trung bình trước sau công cường độc với lô vacxin Re-1 59 3.12 Hiệu giá kháng thể trung bình trước sau công cường độc với lô vacxin Re-5 59 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix Bảng 3.11 Hiệu giá kháng thể trước sau công cường độc Ký hiệu GMT (log2) ngày GMT (log2) ngày 10 KN UK KN A1207 KN UK KN A1207 5.5 5.1 8.8 8.6 8 3 10 7 10 10 5 8 4 8 7 9 5 8 10 10 6.8 6.2 9.2 8.5 7 9 10 9 5 8 7 7 8 8 6 7 10 10 10 9 Nhóm VX Re-1 Nhóm VX Re-5 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 10 8.8 8.6 GMT (log2) 5.5 5.1 Ngày Ngày 10 KN UK KN A1207 Biểu đồ 3.11 Hiệu giá kháng thể trung bình trước sau công cường độc với lô vacxin Re-1 10 9.2 8.5 GMT (log2) 6.8 6.2 Ngày Ngày 10 KN UK KN A1207 Biểu đồ 3.12 Hiệu giá kháng thể trung bình trước sau công cường độc với lô vacxin Re-5 Qua bảng 3.11 biểu đồ 3.11, biểu đồ 3.12 cho thấy: sau công cường độc tất gà sống sót lô cho kết dương tính với kháng thể kháng virus cúm H5N1, đồng thời hiệu giá kháng thể tiêm vacxin tăng cao so với trước công cường độc virus cường độc xâm nhập Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 vào thể làm kích thích hệ thống miễn dịch thể hoạt động tạo kháng thể đặc hiệu để trung hòa kháng nguyên virus, tạo thay đổi hàm lượng kháng thể thể đến ngày thứ 10 sau công cường độc hàm lượng kháng thể tạo cao nhiều so với trước công cường độc Với vacxin Re-1 8.8log2 kiểm tra với kháng nguyên chuẩn 8.6log2 kiểm tra với virus A1207 Với vacxin Re-5 9.2log2 kiểm tra với kháng nguyên chuẩn 8.5log2 kiểm tra với virus A1207 Những gà, sống sót có trình đáp ứng miễn dịch chống lại mầm bệnh lúc nhiễm virus cúm Ở lô tiêm vacxin, virus cường độc xâm nhập vào thể làm kích thích hệ thống miễn dịch thể hoạt động tạo kháng thể đặc hiệu để trung hòa kháng nguyên virus, tạo thay đổi hàm lượng kháng thể thể đến ngày thứ 10 sau công hàm lượng kháng thể tạo tăng từ 5.5log2 lên 8.8log2 kiểm tra với kháng nguyên chuẩn lô vacxin Re-1 tăng từ 6.8log2 lên 9.2log2 lô vacxin Re-5 Ở lô không tiêm vacxin: gà chết đồng loạt vào ngày thứ thứ với lô vacxin Re-1 ngày thứ 3, thứ lô vacxin Re-5 Như vậy, rõ ràng vacxin Re-1 vacxin Re-5 giúp kích thích tạo kháng thể nhanh mạnh để trung hòa virus trình gây nhiễm Việc tiêm vacxin Re-1 Re-5 làm tăng khả đáp ứng miễn dịch thể với virus công cường độc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết theo dõi, kiểm tra trước sau công cường độc vacxin Re-1 Re-5, rút kết luận sau: Virus H5N1 clade 2.3.2.1A phân lập từ ổ dịch tại huyện Kim Bảng- Hà Nam tháng năm 2012 có độc lực cao, gây chết 100% gà không tiêm vacxin Vacxin Re-1 Re-5 Trung Quốc sản xuất có khả tạo đáp ứng miễn dịch gà tiêm Vacxin Re-1 có tỷ lệ bảo hộ đạt 80% , vacxin Re-5 có tỷ lệ bảo hộ đạt 100% với gà tiêm mũi Có thể tiếp tục sử dụng vacxin để phòng chống dịch bệnh virus cúm gia cầm chủng độc lực cao H5N1 clade 2.3.2.1A gây với gà Cả loại vacxin H5N1 chủng Re-1 Re-5 Trung Quốc sản xuất dùng thí nghiệm không ngăn cản hoàn toàn virus H5N1clade 2.3.2.1A xâm nhập nhân lên thể gà tiêm phòng Tuy nhiên, vacxin có tác dụng giảm thiểu mức độ thời gian thải virus môi trường, sử dụng liệu trình có tiêm nhắc lại Có thể sử dụng loại vacxin Re-1 Re-5 cho gà để phòng bệnh cúm gia cầm virus H5N1 clade 2.3.2.1A gây Tuy nhiên, mức độ tương đồng Re-5 với virus cao nên cho hiệu tốt Liệu trình mũi vacxin khuyến cáo nên sử dụng tiêm mũi Đề nghị Từ kết luận rút bên có số kiến nghị sau: Cần có nhiều chương trình, đề tài nghiên cứu chuyên sâu cúm gia cầm chủng độc lực cao, nhằm phát kịp thời clade để việc sử dụng vacxin có hiệu Cần thường xuyên thực thí nghiệm đánh giá khả bảo hộ loại vacxin cúm gia cầm sử dụng có virus cúm H5N1 tiếp tục biến đổi có virus xuất để đưa định thích hợp phòng chống bệnh cúm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, 2004 “Bệnh cúm gia cầm biện pháp phòng chống” NXB Nông nghiệp, Hà Nội Trương Văn Dung, 2008 Những kết nghiên cứu đạt bệnh cúm gia cầm Việt Nam Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XV-Số 4, tr -tr Nguyễn Tiến Dũng, Malik Peiris, Robert Webster, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Nguyễn Thế Vinh, Kent Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Viết Không Ngô Thanh Long, 2004 Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1tại Việt Nam năm 2003-2004 Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XI- Số 3, tr.6- tr14 Nguyễn Tiến Dũng, 2008 Vài nét virus cúm gia cầm H5N1 Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y Tập XV-Số 4, tr 80 Vũ Thị Mỹ Hạnh, Tô Long Thành, Tạ Hoàng Long, Trần Thị Hoan, Đào Yến Khanh, Lê Huy Hoàng, Nguyễn Thị Thúy Hà, Nguyễn Trung Tiến, Nguyễn Thị Việt Nga, 2008 Kiểm nghiệm vacxin cúm H5N1 Trung Quốc sử dụng giai đoạn 2006-2007 Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XVSố 4, tr.25 Văn Đăng Kỳ, 2012 Dịch cúm gia cầm từ đầu năm 2012 đến biện pháp phòng chống Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Thú y Tập XIX - Số 5, tr83- tr87 Phạm Sỹ Lăng, Tô Long Thành, Cù Hữu Phú, Nguyễn Hoài Nam, 2004 gia cầm kỹ thuật phòng trị NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Văn Năm, 2007 Đại dịch cúm gia cầm nguyên tắc phòng chống Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XIV-Số 2, tr.91 Nguyễn Hoài Tạo, Nguyễn Tuấn Anh, 2004 Một số thông tin dịch cúm gia cầm Chăn nuôi Số 3, tr.23 10 Nguyễn Như Thanh, Lê Thanh Hòa, 1997 Miễn dịch học Thú y NXB Nông nghiệp Hà Nội 11 Tô Long Thành 2007 Các loại vacxin cúm gia cầm đánh giá hiệu 12 Tô Long Thành, Nguyễn Hoàng Đăng, Hoàng Đăng Huyến, 2008 Đáp ứng miễn dịch gà vịt tiêm vacxin phòng cúm gia cầm tỉnh Bắc Giang Tạp chí khoa học kĩ thuật Thú y Tập XV-Số 6, tr5 Tiêm phòng Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XVI-Số 2, tr.84 13 Phạm Hùng Vân 2008 PCR Real-time PCR vấn đề băn ứng dụng thường gặp NXB Y học 14 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 2005 Kế hoạch dự phòng chống dịch Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Bệnh Page 62 cúm gia cầm chủng độc lực cao Việt Nam 15 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 2005 Tiêu chuẩn ngành-Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm 16 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 2005 Tiêu chuẩn ngành- Quy trình mổ khám gia cầm Nguồn tài liệu từ Internet 17 Báo cáo tình hình dịch cúm gia cầm, hướng dẫn sử dụng vacxin cúm gia cầm giám sát sau tiêm phòng http://www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=&Itemi 18 Chỉ thị việc tăng cường biện pháp cấp bách phòng, chống dịch cúm gia cầm http://www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=&Itemi 19 http://d3.violet.vn/uploads/previews/504/1503872/preview.swf 20 http://www.khoahoc.com.vn/doisong/yhoc/dich-cum/38134_Thang-3-2012-Ramat-vac-xin-H5N1-cho-gia-cam.aspx 21 Nhánh virus cúm gia cầm lan rộng phía Bắc http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/1/1/100165/Nhanh-virus-cum-gia- cammoi-lan-rong-tai-phia-Bac.aspx Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp phát kháng nguyên HA (hemagglutination assay) Ứng dụng: Phát hiện, định lượng kháng nguyên chuẩn kháng nguyên (virus) phân lập từ bệnh phẩm Chuẩn độ kháng nguyên đơn vị HA dùng cho phản ứng HI Các bước tiến hành: - Cho 25µl PBS (isotonic phosphate buffered saline) vào 96 giếng đáy chữ V - Cho 25µl kháng nguyên vào giếng cột - Pha loãng kháng nguyên cách chuyển 25µl từ giếng sang giếng đến giếng 11 bỏ 25µl Giếng 12 có PBS để làm đối chứng hồng cầu - Nhỏ thêm 25µl PBS vào tất giếng - Nhỏ 25µl hồng cầu gà 1% vào tất giếng - Lắc đĩa máy - Ủ đĩa phản ứng nhiệt độ phòng khoảng 40 phút - Phản ứng dương tính: phản ứng ngưng kết xảy ra, hồng cầu ngưng kết thành hạt lấm màu đỏ thành quầng đáy giếng Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên đánh giá độ pha loãng cao có phản ứng ngưng kết xảy Phản ứng âm tính: Không có phản ứng ngưng kết xảy hồng cầu gà lắng xuống đáy thành cục màu đỏ, nước bên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 Phụ luc 2: Phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI a Nguyên liệu dụng cụ - Nguyên liệu: - Dung dịch PBS - Kháng huyết cần kiểm tra chắt từ hồng cầu gà trước sau công - Kháng nguyên chuẩn - Hồng cầu gà 1% - Dụng cụ: đĩa phản ứng 96 giếng đáy chữ V dụng cụ cần thiết phòng thí nghiệm b Chuẩn bị kháng nguyên - phản ứng ngưng kết hồng cầu HA xác định hiệu giá kháng nguyên Pha kháng nguyên HA/25µl Tính lượng kháng nguyên cần dùng cho số mẫu huyết để đảm bảo lượng kháng nguyên dùng cho phản ứng Chuẩn độ kháng nguyên 4HA: sau pha, kháng nguyên 4HA phải chuẩn độ lại Tiến hành: - Nhỏ 25µl PBS 0,01M vào đĩa 96 giếng đáy chữ V từ giếng đến giếng hàng - Cho 25µl kháng nguyên 4HA vào giếng thứ - Pha loãng kháng nguyên cách chuyển 25µl kháng nguyên 4HA từ giếng thứ sang giếng thứ đến giếng bỏ 25µl - Nhỏ thêm 25µl PBS vào giếng - Nhỏ 25µl hồng cầu gà 1% vào tất giếng - Lắc đĩa máy - Ủ đĩa phản ứng nhiệt độ phòng khoảng 40 phút Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 Pha chuẩn: kết ngưng kết xảy giếng đầu Pha không chuẩn: - Kháng nguyên đặc: ngưng kết đến giếng thứ tức thừa kháng nguyên Như kháng nguyên 8HA phải pha loãng để có ngưng kết đến giếng thứ - Kháng nguyên loãng: ngưng kết đến giếng thứ tức thiếu kháng nguyên, thêm lượng kháng nguyên (bằng với lượng kháng nguyên pha ban đầu) để có ngưng kết đến giếng thứ c Tiến hành phản ứng HI - Nhỏ 25µl PBS vào giếng đĩa 96 giếng - Nhỏ tiếp 25µl kháng huyết vào giếng - Pha loãng kháng huyết theo số 2, cách chuyển 25µl kháng huyết từ giếng sang giếng đến giếng 11 bỏ 25µl giếng cuối - Nhỏ 25µl kháng nguyên 4HA chuẩn bị vào giếng từ giếng 1`12 - Lắc đĩa ủ nhiệt độ phòng 30 phút - Nhỏ 25 µl huyễn dịch hồng cầu vào tất giếng đĩa, lắc Đọc kết quả: - Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy Hiệu giá HI mẫu tính độ pha loãng huyết cao có tượng ức chế ngưng kết hồng cầu Huyết coi dương tính có hiệu giá huyết ≥1/16 Huyết đối chứng âm tính phải có hiệu giá ≤1/4 - Phản ứng âm tính: hồng cầu bị ngưng kết Chú ý: kiểm tra huyết loài khác gà nên có giếng có huyết hồng cầu để kiểm tra tượng ngưng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 kết hồng cầu không đặc hiệu Nếu phát thấy có ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu xảy với mẫu huyết cần xử lý lại mẫu huyết kiểm tra lại phản ứng HI Phụ lục 3: Thành phần cách pha nguyên liệu dùng chẩn đoán cúm Dung dịch PBS 0,01M pH 7,2 Na2HPO4 1,096 g NaH2PO4.H2O 0,316 g Na Cl 8,5 g Nước cất lít Chỉnh pH = 7.2 NaOH 1N HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 40C không tuần Huyễn dịch hồng cầu gà 1% - Gà trống khoẻ mạnh, trưởng thành, kháng thể cúm newcastle - Dùng bơm tiêm 5-10ml hút sẵn 1ml (10% thể tích) dung dịch chống đông (Natri citrat 4%) lấy máu tĩnh mạch cánh, cho máu vào ống nghiệm - Ly tâm 1000-1500 vòng/phút, 15 phút, đổ bỏ huyết tương, cho thêm PBS 0,01M pH 7,2 vào hồng cầu, lắc Ly tâm 3-4 lần để rửa hồng cầu Sau lần ly tâm cuối hút bỏ nước - Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% cách pha 1ml hồng cầu với 99ml nước muối sinh lý - Bảo quản huyễn dịch hồng cầu nhiệt độ 4-80C Hồng cầu sau pha dùng 4-5 ngày (nếu hồng cầu bị dung huyết loại bỏ không dùng) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 Phụ lục 4: Bảng chu kỳ nhiệt bướ c phiêm mã ngược (RT) dùng cho Quiagen one step RT-PCR kit Bước phiên mã ngược chu kỳ 30 phút 500C 15 phút 950C Phụ lục 5: Bảng chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen cặp mồi Cặp mồi AIV 45 Chu kỳ matrix H7 40 Chu kỳ 40 Chu kỳ H5 Bước Thời gian Nhiệt độ Biến tính giây 940C Bám cặp mồi 20 giây 600C Biến tính giây 940C Bám cặp mồi 20 giây 580C Biến tính giây 940C Bám cặp mồi 20 giây 570C Kéo dài chuỗi tổng hợp giây 720C Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 Phụ lục 6: Trình tự Primers Probe cho phát cúm type A subtype H5N1 Target PPP Virus Name (Gene) (Source) Influenz a A virus Forwar d (Matrix) Sequence (5'-3') Probe Probe M-4 Modification Primer/ Reverse TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA 5' FA BHQ M Non e Probe a A virus subtype H5-3S Probe Forwar H5 d (HA2) Reverse Influenz Probe a A virus subtype N1 (HA2) N1-2 Forwar d Reverse GCA TCAACAGTTGCGAGTTCTCTAGCA e HEX BHQ HEX Non TCA e TGGTCTTGGCCAGACGGTGC TGGACTAGTGGGAGCAGCAT TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp None BHQ ACG TAT GAC TAC CCG CAG TAT AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC None Non TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA Influenz 3' None Non e None FA BHQ M Non e None Non e None Page 69 Phụ lục 7: Phương pháp xử lý huyết dùng phản ứng HI Xử lý với RDE (Receptor Destroying Enzyme): - Trộn phần RDE với phần huyết - Ử nhiệt độ 370C nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 560C/30 phút để vô hoạt RDE dư - Huyết xử lý để nguội, cho thêm phần nước muốn sinh lý, độ pha loãng cuối kháng huyết 1/10 Xử lý với hồng cầu gà: Hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu giả xử lý cách hấp phụ huyết kiểm tra với hồng cầu gà Thêm 25µl hồng cầu đặc vào 500µl huyết thanh, lắc nhẹ để nhiệt độ phòng 30 phút, sau ly tâm tốc độ 8000 vòng/2-5 phút Thu lấy huyết xử lý Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70 Phụ lục 8: Một số hình ảnh thời gian thực tập Triệu chứng lâm sàng: Gà ốm, bỏ ăn, nằm chỗ chết Xuất huyết da chân gà Mổ khám gà chết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71 Phổi viêm xuất huyết Ruột non xuất huyết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 [...]... cứu đề tài: “ Đánh giá hiệu lực của vacxin cúm gia cầm chủng Re- 1 và Re- 5 do Trung quốc sản xuất đối với virus H5N1 phân nhóm 2. 3 .2. 1A trên gà nuôi thí nghiệm 2 Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá được hiệu lực của vacxin cúm gia cầm chủng Re- 1 và Re- 5 do Trung Quốc sản xuất đối với virus H5N1 phân nhóm 2. 3 .2. 1A trên gà Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 CHƯƠNG I TỔNG... một nhánh virus mới là 2. 3 .2. 1C Nhánh virus H5N1 mới này, tuy vẫn thuộc nhánh 2. 3 .2 .1, nhưng đã có sự khác biệt với những virus 2. 3 .2 .1 thuộc nhóm A và B gây bệnh năm 2 011 và đầu năm 2 0 12 Về độc lực, nhóm virus mới được đánh giá là có độc lực cao Theo báo cáo của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương, nhánh virus 2. 3 .2. 1C nhiều khả năng đã xuất hiện từ khoảng tháng 7, tháng 8 năm 2 0 12 Qua giám sát dịch... chia nhiều đợt: + Từ 12 /20 06 đến 3 /20 07 dịch xảy ra trên 83 xã, phường của 33 quận, huyện thuộc 11 tỉnh Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 10 3. 0 92 con, trong đó có 13 . 622 gà; 89.4 72 ngan, vịt + Từ 5/ 20 07 đến 8 /20 07, dịch xảy ra ở 16 7 xã, phường của 10 huyện, thị thuộc 23 tỉnh, thành Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 29 4.894 con ( 21 . 52 5 gà, 26 4 .54 9 vịt và 8.7 75 ngan) Sau khi bị... 10 3 con gà) Toàn bộ đàn gia cầm mắc bệnh tại 02 hộ chăn nuôi trên và gia cầm của 14 hộ xung quanh (670 con) đã được tiêu hủy Ngày 02/ 4 /2 0 15 đã phát hiện 01 ổ dịch cúm gia cầm tại 01 hộ thuộc thôn Dinh, xã Nghĩa Xuân, huyện Quỳ Hợp Nghệ An Từ 02- 04/4 toàn bộ đàn gia cầm mắc bệnh và một số đàn gia cầm có liên quan (tổng cộng 31 8 con) đã bị tiêu hủy Ngày 05/ 4 /2 0 15 đã phát hiện 01 ổ dịch cúm gia cầm H5N1. .. gần 56 .000 gà; 8 . 13 2 vịt; và 19 . 950 con chim cút Và đã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A /H5N1, trong đó có 9 ca tử vong (http://www.cucthuy.gov.vn) * Đợt 3: Từ tháng 12 /20 04 cho đến tháng 15 / 12 /20 05, dịch cúm gà đã xuất hiện ở 670 xã tại 18 2 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là 1, 846 triệu con (gồm 470.000 gà, 8 25 . 000 thủy cầm và 5 51 . 000 chim cút) Vào... nuôi gia cầm tại Ấp 3 của xã Khánh Hội thuộc huyện U Minh có gia cầm mắc bệnh cúm H5N1 Số gia cầm chết là 26 0 con trong tổng đàn 824 con gồm 6 75 con gà và 14 9 con vịt Chi cục Thú y tỉnh Sóc Trăng đã phát hiện và phối hợp với chính quyền địa phương tiêu hủy đàn gà trên 2 tháng tuổi, 11 00 con, bị mắc bệnh cúm gia cầm H5N1 tại Ấp 1, xã Đại Hải, huyện Kế Sách Ngày 23 / 02/ 2 0 15 địa phương đã tiêu hủy đàn gà. .. phòng chống cúm gia cầm Hiện nay Việt Nam sử dụng nhiều loại vacxin của nhiều nhà cung cấp nhưng chủ yếu dựa vào nguồn vacxin nhập khẩu từ Trung Quốc Giai đoạn 20 07 -2 010 , Việt Nam sử dụng vacxin cúm gia cầm chủng RE- 1 do Trung Quốc sản xuất khá hiệu quả trong việc không chế và làm giảm thiệt hại của dịch cúm Tuy nhiên từ năm 2 010 Trung Quốc lại chuyển sang sản xuất vacxin cúm gia cầm RE- 5 và Việt Nam... tháng cuối năm 20 05, dịch cúm gà xảy ra trong tháng 10 /20 05 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12 /20 05 (http://www.cucthuy.gov.vn) * Đợt 4: từ tháng 10 /20 05 đến 01/ 20 06: dịch xảy ở cả 3 miền với 24 tỉnh, thành tái phát Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 3. 9 72. 7 63 con, trong đó, gà: 1. 33 8 . 52 3; thuỷ cầm và loài khác: 2 . 13 5. 0 81 + Sau một năm (20 06), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng... cáo của Chi cục Thú y tỉnh Vĩnh Long, địa phương đã phát hiện ổ dịch cúm gia cầm trên đàn vịt 2 tháng tuổi, chưa tiêm phòng vắc xin, gồm 16 00 con của 01 hộ chăn nuôi ở ấp Phước Trinh A, xã Bình Phước, huyện Mang Thít Ngày 13 /3 /2 0 15 địa phương đã tiêu hủy đàn vịt Ngày 12 /3 /2 0 15 , dịch Cúm gia cầm đã xảy ra tại 02 hộ chăn nuôi thuộc thôn 2, xã Hải Lĩnh, huyện Tĩnh Gia làm 35 3 con gia cầm mắc bệnh ( 25 0 ... huyện/thị xã với 12 .22 0 con gia cầm mắc bệnh (chiếm 4, 21 % ), số gia cầm buộc phải tiêu hủy là 10 5. 51 5 con (chiếm 17 ,50 %), sau đó là các tỉnh Hà Tĩnh, Nghệ An + năm 2 0 13 , tháng 1/ 2 0 13 tại tỉnh Tây Ninh dịch cúm gia cầm xuất hiện tại hai hộ gia đình thôn Bàu Tép, xã Tiên Thuận, huyện Bên Cầu và ấp Cỏ Đỏ, xã Bình Minh, tỉnh Tây Ninh Tổng số gia cầm chết và tiêu hủy tại Tây Ninh là 3. 438 con Tháng 2/ 2 0 13 , tại