Lao kháng thuốc và sinh học phân tử

Một chuyên đề hay về lao kháng thuốc giải thích cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao dưới góc độ sinh học phân tử. Chuyên đề gồm cách phần: 1. Định nghĩa lao kháng thuốc 1 2. Dịch tễ học 2 3. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao và sinh học phân tử trong lao kháng thuốc 3 3.1. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao 3 3.2. Cơ chế kháng isoniazid (H) 5 3.3. Cơ chế kháng rifampicin 8 3.4. Cơ chế kháng Pyrazinamid 10 3.5. Cơ chế kháng Ethambutol 11 3.6. Cơ chế kháng Steptomycin 12 3.7. Cơ chế kháng các thuốc kháng lao hàng hai 12 4. Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán lao kháng thuốc 15 4.1. Kỹ thuật PCRRFLP 16 4.2. Giải trình tự ADN 17 4.3. Kỹ thuật lai đầu dò 21 4.4. Xét nghiệm Realtime PCR (RTPCR) 24 5. Điều trị lao kháng thuốc 28 5.1. Phác đồ điều trị lao đơn kháng thuốc và lao kháng nhiều thuốc 28 5.2. Phác đồ điều trị lao đa kháng thuốc 29 5.3. Điều trị lao siêu kháng thuốc 30 5.4. Phác đồ điều trị lao kháng thuốc theo Dự án phòng chống lao tại Việt Nam 30

MỤC LỤC Trang Danh mục chữ viết tắt Định nghĩa lao kháng thuốc Dịch tễ học Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao sinh học phân tử lao kháng thuốc 3.1 Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao 3.2 Cơ chế kháng isoniazid (H) 3.3 Cơ chế kháng rifampicin 3.4 Cơ chế kháng Pyrazinamid 10 3.5 Cơ chế kháng Ethambutol 11 3.6 Cơ chế kháng Steptomycin 12 3.7 Cơ chế kháng thuốc kháng lao hàng hai .12 Ứng dụng sinh học phân tử chẩn đoán lao kháng thuốc 15 4.1 Kỹ thuật PCR-RFLP 16 4.2 Giải trình tự ADN 17 4.3 Kỹ thuật lai đầu dò .21 4.4 Xét nghiệm Real-time PCR (RT-PCR) .24 Điều trị lao kháng thuốc .28 5.1 Phác đồ điều trị lao đơn kháng thuốc lao kháng nhiều thuốc 28 5.2 Phác đồ điều trị lao đa kháng thuốc 29 5.3 Điều trị lao siêu kháng thuốc 30 5.4 Phác đồ điều trị lao kháng thuốc theo Dự án phòng chống lao Việt Nam 30 Tài liệu tham khảo DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt LĐKT : Lao đa kháng thuốc LSKT : Lao siêu kháng thuốc Tiếng Anh ahpC : Alkyl-hydroperoxide reducatse Alr : Alanine racemase AMK : Amikacin ARNP : Polymerase ARN CPM : Capreomycin Cs : Cycloserin DCS : D-cycloserine Ddl : D-alanine ligase E : Ethambutol embB : embB gene ERDR : Ethambutol resistance determining region ETH : Ethionamide FQ : Fluoroquinolones H : Isoniazid inhA : Enoyl-acyl carrier protein reductase kasA : β-ketoacyl-ACP gene katG : Catalase-peroxidase gene KM : Kanamycin LVF : Levofloxacin MfpA : Mycobacterium tuberculosis MfpA protein Mfx : Moxifloxacine MIC : Minimum inhibitory concentration NAD : Nicotinamide adenine dinucleotide NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen ndh : NADH dehydrogenase gene OFL : Ofloxacin Ofx : Ofloxacin POA : Pyrazinoic acid Pto : Prothionamide PZA : Pyrazinamidase QRDR : Quinolone Resistance-Determining Region R : Rifampicin RFLP : Restriction fragment length polymorphism rpoB : RNA Polymerase Beta Subunit gen rpsL : rpsL gene RRDR : Rifampicin Resistance-Determining Region Rrs : 16S rRNA gene S : Streptomycin VM : Viomycin WHO : World Health Organization Z : Pyrazinamid 1 Định nghĩa lao kháng thuốc Bệnh lao kháng thuốc, đặc biệt lao đa kháng thuốc (LĐKT) lao siêu kháng thuốc (LSKT), ngày diễn biến phức tạp có chiều hướng gia tăng, có phối hợp với nhiễm HIV/AIDS, gây nhiều khó khăn cho cơng tác quản lý kiểm sốt bệnh lao, đặc biệt vùng có tỉ lệ nhiễm lao cao hoạt động chương trình chống lao khơng hiệu Do đó, tiến việc hiểu biết chế hoạt động kháng thuốc lao vi khuẩn lao, đặc biệt khía cạnh di truyền học, góp phần giúp hiểu biết sâu sắc sinh bệnh học chủng vi khuẩn lao kháng thuốc sở khoa học giúp giải vấn đề quan trọng chẩn đoán bệnh lao, phát minh thuốc kháng lao chiến lược điều trị lao thích hợp Về phương diện sinh học, dòng vi khuẩn gọi kháng thuốc lao số lượng vi khuẩn kháng thuốc lao đạt tỷ lệ > 1% Lao kháng thuốc định nghĩa vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng với loại thuốc kháng lao hàng thứ (thực ống nghiệm) Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) [9] có loại lao kháng thuốc: Lao đơn kháng thuốc: vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng với loại thuốc kháng lao hàng thứ Lao kháng nhiều thuốc: vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng với hai loại thuốc kháng lao hàng thứ không bao gồm hai loại thuốc Rifampicin Isoniazid Lao đa kháng thuốc (LĐKT): vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng với hai loại thuốc Rifampicin Isoniazid Lao siêu kháng thuốc (LSKT): LĐKT kết hợp với kháng thứ thuốc fluoroquinolones kháng tối thiểu với ba thuốc kháng lao loại chích hàng thứ hai (Capreomycin, Amikacin, Kanamycin…) [8, 21] Ngày nay, để thuận lợi cho việc quản lý bệnh lao kháng thuốc theo chương trình chống lao, lao kháng thuốc khơng gọi lao kháng thuốc tiên phát lao kháng thuốc mắc phải mà chia thành nhóm [11]:  Lao kháng thuốc mới: bệnh nhân chưa điều trị lao trước điều trị lao tháng có tiếp xúc với chủng vi khuẩn lao kháng thuốc  Lao kháng thuốc xảy bệnh nhân có điều trị lao trước lao tái phát, lao bỏ trị, lao thất hại với phác đồ I II (thường điều trị lao không nguyên tắc bệnh nhân tự ý bỏ trị, dùng thuốc lao không đủ liều, không đủ thời gian, địa bệnh nhân mắc bệnh nặng trầm trọng gây suy giảm miễn dịch tình trạng nhiễm HIV/AIDS, đái tháo đường, sử dụng corticoid kéo dài, bệnh lý ác tính…) Dịch tễ học  Năm 1947, Pyle mô tả xuất kháng thuốc dùng Streptomycin để điều trị  lao Vào thập kỷ 50, chứng minh diện vi khuẩn kháng thuốc dòng  hoang dại M tuberculosis chưa dùng thuốc kháng lao Năm 1970, David chứng minh kháng thuốc lao xuất phát từ xuất đột biến tự nhiên ngẫu nhiên nhiễm sắc thể vi khuẩn David tính tỷ lệ đột biến kháng với loại thuốc kháng lao Streptomycin (S), Isoniazid (H), Rifampicin (R), Ethambutol (E) Tỷ lệ dòng đột biến kháng loại thuốc 106 vi khuẩn sau: 40 vi khuẩn kháng với S; vi khuẩn kháng với H: 0,1 vi khuẩn kháng với R, 10 vi khuẩn kháng với E Và khả đột biến ngẫu nhiên kháng lúc với thuốc  R H 0,1/106 x 5/106 Năm 1997, khảo sát WHO tình trạng lao kháng thuốc toàn tầu cho thấy tỷ lệ LĐKT mắc phải Nepal, Ấn Độ, NewYork, Bolivia, Hàn Quốc  48%, 34%, 30%; 15%, 15% [21] Một khảo sát khác WHO giai đoạn 1999-2002 55.779 trường hợp cho thấy tỷ lệ đề kháng với loại thuốc lao sau: 6,3% kháng S, 5,9% kháng H; 1,4%  kháng R, 0,8% kháng E Tỷ lệ đa kháng thuốc lao trung bình 1,1% (0- 14,2%) Năm 2004, báo cáo WHO cho thấy tỷ lệ LĐKT số nước toàn cầu sau: cao Parkistan (9,6%); Afghanistan (7,3%); Nga (6,0%); Trung quốc (5,3%); Cambodia (4,2%); Ấn Độ (3,4%); Philippines (3,25%); Việt nam (2,3%); Tanzania (2,1%); Zimbabwe (1,9%); Nam Phi 11,5%); Myanmar (1,5%); Indonesia  (0,7%); Thái lan (0,5%); Kenya (0%) [19] Thống kê WHO năm 2005 ước tính tối thiểu có 104 nước có trường hợp LĐKT đa số nước có từ 50 trường hợp LĐKT trở lên  Năm 2006 chương trình chống lao giới chưa giai tình irạng LĐKT nhân loại phải đối mặt với tình trạng kháng thuốc lao mới,  LSKT Năm 2007, tồn giới ước tính có khoảng 0,5 triệu trường hợp LĐKT, có 27 nước có tần suất mắc LĐKT cao nhất, đứng hàng đầu Ấn Độ (131.000 trường hợp), Trung Quốc (112.000), Liên Bang Nga (43.000), Nam Phi (16.000) Bangladesh (15.000) Đồng thời, có 35 nước có tối thiểu trường hợp LSKT, có  Việt Nam [20] Đến tháng 11/2009, tồn giới có 57 nước vùng lãnh thổ có trường  hợp LSKT [22] Tại Việt nam, tỷ lệ LĐKT gia tăng từ 2,3% (vào năm 1997) đến 2,7% (vào năm 2007) tỷ lệ LĐKT bệnh nhân điều trị lao trước gia tăng từ 14% (vào năm 2004) đến 19% (vào năm 2007) [7] Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao sinh học phân tử lao kháng thuốc 3.1 Cơ chế kháng thuốc vi khuẩn lao Hầu hết loại vi khuẩn thường dùng số chế để đề kháng với loại thuốc kháng sinh Những chế chia thành ba nhóm: Cơ chế làm vững thành tế bào (giảm tính thấm thuốc bơm đẩy) Tiết men làm giảm hay bất hoạt tác dụng thuốc, chẳng hạn men β-lactamases Làm thay đổi mục tiêu tác dụng thuốc đột biến điểm vùng gen khóa Hình Cơ chế tác dụng thuốc kháng sinh chế kháng thuốc vi khuẩn Vi khuẩn lao không khác biệt so với vi khuẩn khác việc sử dụng chế kháng thuốc kháng lao [10] Cơ chế thường phát đề kháng tự nhiên vi khuẩn lao loại thuốc kháng lao sử dụng thường xuyên Tuy nhiên chế 3, chế đột biến gen, chế dẫn đến LĐKT LSKT Về mặt lâm sàng lao kháng thuốc chủ yếu xảy trình điều trị thuốc kháng lao (gọi kháng thuốc mắc phải) Việc điều trị thuốc khang lao dẫn đến áp lực lựa chọn dòng M tuberculosis đột biến gen chống chịu với thuốc kháng lao Một số yếu tố khác góp phần dẫn đến áp lực lựa chọn việc sử dụng đơn trị liệu thuốc kháng lao, bác sĩ kê toa không phù hợp quan trọng bệnh nhân không tuân thủ phác đồ điều trị [8] Mặc dù tỷ lệ xảy đột biến vi khuẩn lao tương đối thấp (10 -6-10-8 lần nhân lên vi khuẩn), đột biến xảy điểm (đột biến điểm) tạo dòng vi khuẩn lao đơn kháng thuốc đột biến xảy nhiều điểm nhiều gen khác tạo dòng vi khuẩn LĐKT [15] Các dòng kháng thuốc kháng lao theo thời gian dần chiếm ưu so với dòng khác phát tán vào cộng đồng Những người nhiễm dòng lao kháng thuốc mắc phải thể lao kháng thuốc trước điều trị (kháng thuốc nguyên phát) Một số trực khuẩn lao có sức đề kháng tự nhiên với thuốc kháng lao Chọn lọc Đề kháng mắc phải Sinh sản dòng kháng thuốc vật chủ Đề kháng nguyên phát Lây truyền dòng kháng thuốc sang vật chủ khác Hình Cơ chế sinh học phân tử lao kháng thuốc 3.2 Cơ chế kháng isoniazid (H) H nói thuốc kháng lao hàng thứ hiệu phác đồ điều trị lao Trực khuẩn lao nhạy cảm cao với H (nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) H từ 0,02-0,2 μg/ml) H có hiệu cao việc tiêu diệt trực khuẩn lao phân chia H có khả chống lại dòng vi khuẩn lao kháng với loại thuốc kháng lao khác, nhiên lại thuốc dễ bị kháng lại phác đồ ngắn ngày tháng 3.2.1 Cơ chế kháng vi khuẩn lao isoniazid H xâm nhập vào tế bào vi khuẩn lao dạng tiền thuốc kích hoạt men catalase-peroxidase (men katG) Hoạt động peroxidase (oxi hóa) men katG kích hoạt H trở thành dạng chất gây độc (isonicotinc acid ) màng tế bào vi khuẩn lao Dạng chất gây độc H tác động đến hai chất men inhA men kasA đóng vai trò quan trọng q trình tổng hợp mycolic acid, thành phần cấu tạo nên màng tế bào Nếu vi khuẩn thiếu mycolic acid trì tính bền vững tế bào bị chết [4] 3.2.2 Cơ chế kháng isoniazid vi khuẩn lao Cho đến chế kháng H trực khuẩn lao chưa hiểu rõ hoàn toàn Tuy nhiên hầu hết trường hợp lao kháng H phát đột biến số gen hệ gen trực khuẩn lao Các gen thường bị đột biến gen katG, inhA, ahpC, kasA, ndh Ngồi có 16 gen khác đột biến gây kháng H [4] Đột biến gen katG Gen katG gen mã hóa tổng hợp nên men katG Các nghiên cứu thử nghiệm ống nghiệm cho thấy gen katG vi khuẩn bị vi khuẩn có tính kháng H, ngược lại gen katG phục hồi vi khuẩn lại nhạy cảm với H Tuy nhiên lâm sàng, mẫu phân lập vi khuẩn lao kháng H cho thấy gen katG hầu hết bị đột biến không Đột biến gen katG dẫn đến giảm hoạt tính men katG, từ gây kháng H Có đến 40-95% trường hợp kháng H biến đổi gen katG Các nghiên cứu cho thấy đột biến gen katG thường xảy đoạn gen từ codon 138-328 đột biến codon 315 phổ biến (75-90%) Có đến 53-96% trường hợp đột biến codon 315 dạng đột biến thay nucleotide (gọi đột biến S315T) Việc đột biến lại thường xảy đoạn codon 138-328 nhà khoa học lý giải đột biến đoạn vừa làm suy giảm hiệu dược lực H vừa không làm hoạt tính men katG Mặc dù đột biến S315T đột biến phổ biến dạng đột biến codon khác V33Stop, D65E, D94A, G99E, H108E, N138S/H, S140A/N, D142A, L150A, S160L, A172T, T180C, V200Stop, F252L, T262R, P275T, Q294Stop, W299G, W328G, I335T, A350S gen katG ảnh hưởng đến việc tổng hợp chức men katG đóng vai trò khơng nhỏ việc kháng H vi khuẩn lao Đột biến gen ahpC Các nghiên cứu cho thấy có đột biến gen katG làm giảm hoạt tính men katG đồng thời xảy trình tăng tổng hợp men alkyl hydroperoxide reductase (men ahpC) có tác dụng khử độc gốc peroxide bị tổn hại tác dụng oxi hóa H Lý giải 18  Phân tích kết giải trình tự, xác định đột biến liên quan kháng R chủng vi khuẩn lao kháng thuốc Hình Các bước tiến hành giải trình tự ADN Giá trị xét nghiệm Phương pháp giải trình tự ADN phương pháp có độ xác cao (độ nhạy 97% độ đặc hiệu 100%) cho kết nhanh hẳn so với cấy kháng sinh đồ Xét nghiệm giải trình tự ADN phát đột biến codon 315 và/hoặc codon 463 gen katG gây kháng H Xét nghiệm phát đột biến codon 507/511/ 513/ 514/ 516/ 518/ 522/ 526/ 531/ 533 gen rpoB gây kháng R Phương pháp giải trình tự ADN đọc số lượng lớn mẫu ADN Nó phương pháp tảng dựa nhiều xét nghiệm phân tử nhanh (ví dụ xét nghiệm lai đầu dò, RT-PCR, giải trình tự nhiệt) phát triển Lợi điểm khác giải trình tự ADN vừa phát đột biến đột biến biết 19 4.2.2 Giải trình tự nhiệt (Pyrosequencing) Giải trình tự nhiệt phương pháp giải trình tự ADN nhanh, tự động sử dụng gần để phát đột biến lao kháng thuốc Pyrosequencing phương pháp tạo nhiều đoạn ADN có tương đồng cao với bước sau:  Đầu tiên ADN cắt thành đoạn đầu (blunt end), gắn oligonucleotide adaptor vào hai đầu  Từng đoạn sau gắn với hạt thủy tinh, khuếch đại PCR giọt nhũ dầu-nước, tạo nhiều đoạn DNA hạt thủy tinh  Sau hạt thủy tinh giữ giếng picotiter chất dạng sợi, giải trình tự Quá trình giải trình tự diễn qua bước: 1) Đầu tiên, sợi khuôn, sản phẩm PCR sợi đơn, lai với mồi giải trình tự sau ủ với enzyme DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase apyrase chất adenosine 5’ phosphosulfate (APS) luciferin 2) Khi dNTP bắt cặp bổ sung, gắn với sợi DNA khn nhờ DNA polymerase kèm theo giải phóng PPi 3) PPi biến đổi thành ATP nhờ enzyme ATP sulfyrelase với tham gia APS, sau phản ứng xúc tác luciferase biến đổi luciferin thành oxyluciferin-tạo ánh sánh nhìn thấy, có độ sáng tương ứng với lượng ATP tạo thành Ánh sáng nhận biết camera phân tích chương trình phần mềm 4) Apyrase làm suy biến nucleotide khơng bắt cặp ATP Sau q trình làm suy biến, phản ứng bắt đầu lại với nucleotide khác gắn vào Sau trình liên tục, sợi DNA bổ sung tổng hợp xong việc giải trình tự nucleotide xác định từ đỉnh tín hiệu dựa "dấu vết pyrogram (pyrogram trace)" 20 Hình Cách thức tiến hành giải trình tự nhiệt Tương tự phương pháp giải trình tự cổ điển, giải trình tự nhiệt cung cấp xác trình tự ADN, phát đột biến đột biến cũ trước Điểm mạnh phương pháp so với phương pháp giải trình tự cổ điển chi phí thấp hơn, tốc độ q trình xử lý đơn giản, dễ đọc kết đọc nhiều mẫu xét nghiệm lúc Một điểm hạn chế phương pháp thiếu xác việc đọc trình tự dài liên tục (> 50 nucleotide) Nó sử dụng nhiều việc phát đột biến kháng R (độ nhạy 92–100%, độ đặc hiệu 92–100% mẫu bệnh phẩm mẫu thử nghiệm) Nó sử dụng chẩn đốn kháng H (độ nhạy 64%–81%, độ đặc hiệu 100% mẫu bệnh phẩm mẫu thử nghiệm) có nhiều đột biến kháng H chưa biết nằm vùng phát gen katG gen inhA 4.3 Kỹ thuật lai đầu dò 4.3.1 Kỹ thuật lai đầu dò pha rắn Xét nghiệm lai đầu dò WHO cơng bố chấp nhận vào năm 2008 dùng để phát lao kháng thuốc mẫu bệnh phẩm soi dương tính nghi ngờ mắc LĐKT Hiện có xét nghiệm lai đầu dò lưu hành thị trường INNO-LipA®Rif.TB 21 (Innogenetics, Belgium), Genotype® MTBDR hệ thứ hai Genotype® MTBDRplus (Hain LifeScience GmbH, Germany) Nguyên tắc hoạt động Xét nghiệm lai đầu dò phá rắn tiến hành với bước sau:    Tách chiết ADN M.Tuberculosis từ mẫu phân lập từ mẫu lâm sàng Khuếch đại PCR vùng RRDR gen rpoB với mồi biotynylate Sản phẩm PCR sau lai với đầu dò oligonucleotide đặc hiệu (bao gồm đầu dò nhận biến chủng M tuberculosis, đầu dò nhạy cảm đầu dò đột biến) cố định  dải nitrocellulose Phản ứng sau lai đầu dò sản phẩm PCR tạo dải màu khác vị   trí lai nhìn thấy mắt thường Đột biến vùng RRDR phát nếu: Không thể lai sản phẩm PCR với đầu dò nhạy cảm (S1,S2,S3,S4,S5) Sản phẩm PCR gắn với đầu dò đột biến (R2,R4a,R4b,R5) Hình Các bước thực xét nghiệm lai đầu dò Bộ kit INNO-LipA®Rif.TB Bộ kit có khả phát M tuberculosis kháng R qua việc phát đột biến gen rpoB Dải nitrocellulose chứa 10 đầu dò đầu dò oligonucleotide dùng để nhận diện kiểu gen nhóm M tuberculosis, đầu dò oligonucleotide dùng để phát kiểu gen nhạy cảm (S1-S5) đầu dò oligonucleotide dùng để phát kiểu gen kháng R (R1,R2,R3,R4) Kháng R thể thông qua việc khơng thể lai nhiều đầu dò nhạy cảm kèm với việc lai nhiều đầu dò kháng R 22 Hình 10 Dải nitrocellulose với đầu dò cố định kit INNO-LipA®Rif.TB - Marker line: vạch đánh dấu với mục đích định hướng - Conjugate control line : vạch dùng cho chứng nội hệ thống phát màu - MTB complex: đầu dò dùng để xác định chủng M tuberculosis - Các đầu dò nhạy cảm (S1,S2,S3,S4,S5) - Các đầu dò đột biến (R1,R2,R3,R4 ) Bộ kit Genotype® MTBDR Bộ kit phát đột biến gen rpoB gây kháng R đột biến phổ biến codon 315 gen katG gây kháng H mẫu phân lập mẫu bệnh phẩm Độ nhạy độ đặc hiệu việc xác định kháng R kit gần 100% Tuy nhiên độ nhạy chẩn đoán lao kháng H không cao vào khoảng 70-90% tùy vào tỷ lệ phổ biến đột biến gen katG Bộ kit Genotype® MTBDRplus Bộ kit hệ thứ hai kit Genotype® MTBDR với việc bổ sung thêm đầu dò phát đột biến vùng khởi động gen inhA (nucleotides -8, -15, -16) GenoType MTBDRplus sử dụng đầu dò để nhận biết kiểu gen nhạy cảm đầu dò tương ứng đột biến phổ biến (S531L, H526Y, H526D, D516V gen rpoB) Như kit giúp tăng từ 10-20% khả phát kháng H so với hệ cũ Điểm 23 mạnh kit trả kết từ 4-5 giờ, kết hợp với phương pháp khuếch đại ADN cho độ nhạy độ đặc hiệu cao Bộ kit Genotype® MTBDRsl Bộ kit công ty Hain Lifesciences phát triển vào năm 2009 với mục đích phát đột biến gen gyrA, rrs embB Mặc dù chưa chấp nhận lưu hành thị trường chưa kiểm chứng nhiều nghiên cứu kit hứa hẹn cơng cụ chẩn đốn lao kháng fluoroquinolone amikacin/capreomycin kháng ethambutol từ giúp chẩn đốn xác thể LSKT Kết xét nghiệm trả thời gian từ 4-5 độ nhạy lên đến 88,9% độ đặc hiệu 100% Điểm mạnh xét nghiệm lai đầu dò Các nghiên cứu gần đánh giá độ xác xét nghiệm lai đầu dò chứng minh độ nhạy phát đột biến kháng R 94-100% độ đặc hiệu 99-100% mẫu đàm từ bệnh nhân nghi ngờ lao kháng thuốc Xét nghiệm lai đầu dò chứng thực có độ nhạy độ đặc hiệu tương tự mẫu cấy phân lập M tuberculosis Chính vậy, xét nghiệm coi cơng cụ chẩn đốn nhanh xác kháng R đột biến gen rpoB vùng RRDR Điểm hạn chế xét nghiệm lai đầu dò Các xét nghiệm sử dụng để phát kháng H đột biến gây kháng H phát xét nghiệm thấp Các điểm hạn chế khác xét nghiệm lai đầu dò bao gồm khơng có khả phân biệt đột biến gây kháng không gây kháng, không nhạy việc phát đột biến chúng khơng phụ thuộc vào kỹ thuật giải trình tự ADN Độ nhạy đơi thay đổi tùy thuộc vào khác biệt đột biến gen kháng H R vùng địa lý khác 4.3.2 Xét nghiệm vi giá thể (chip sinh học) Mặc dù mặt kỹ thuật, xét nghiệm vi giá thể hay gọi kỹ thuật chip sinh học dựa tảng lai đầu dò, xét nghiệm vi giá thể coi phương pháp dùng để chẩn đoán lao kháng thuốc Nguyên tắc xét nghiệm vi giá thể dựa việc lai mẫu ADN mẫu bệnh phẩm với đầu dò giá thể rắn, chẳng hạn mặt kiếng có kích thước siêu nhỏ Giá thể rắn chứa đến hàng ngàn giếng chứa đầu 24 dò (vì gọi vi giá thể) Các mẫu dò ADN, ADNc oligonucleotides Các trình tự gen đích đánh dấu lai với đầu dò sau thiết bị tự động sử dụng để xác định gen đột biến Kỹ thuật vi giá thể sử dụng chủ yếu để phát lao kháng R kháng H Một nghiên cứu cho thấy xét nghiệm phát > 95% trường hợp kháng R gần 80% trường hợp kháng H vòng 12 mẫu bệnh phẩm mẫu cấy phân lập vi khuẩn lao kháng thuốc Xét nghiệm vi giá thể phát tốt đột biến S315T S315N gen katG, đột biến nucleotid -8, -15, -17 vùng tiếp giáp gen mabA-inhA 29 đột biến thay codon đột biến codon phân phối 10 codon (507, 511, 512, 513, 515, 516, 522, 526, 532, 533) vùng RRDR gen ropB Xét nghiệm vi giá thể có lợi điểm quy trình thực tương tự xét nghiệm lai đầu dò khác nên dễ thực Ngồi xét nghiệm giúp đọc nhiều mẫu lúc (8 mẫu hàng) Tuy nhiên, xét nghiệm vi giá thể chưa phổ biến rộng rãi giá thành cao, cần nhiều trang thiết bị hỗ trợ, chưa nghiên cứu nhiều nên chưa thể áp dụng thành xét nghiệm thường quy chẩn đoán lao kháng thuốc 4.4 Xét nghiệm Real-time PCR (RT-PCR) Một xét nghiệm có thị trường WHO khuyến cáo sử dụng để phát LĐKT GeneXpert® MTB/Rif TB (Cepheid, CA) Xét nghiệm RT-PCR sử dụng đèn phân tử, đầu dò (nhiều loại phổ biến đầu dò TaqMan, FRET, beacons đầu dò sinh học) dùng để lai với mảnh đích khác vùng gen khảo sát Khi có nucleotide xác khớp đầu dò trình tự đích, đèn báo phát tín hiệu huỳnh quang Nếu khơng có tín hiệu gợi ý đột biến mảnh khảo sát tương ứng vùng khảo sát 25 Hình 11 Nguyên tắc kỹ thuật xét nghiệm Real-time PCR Hình 12 Quy trình chuẩn bị mẫu cho xét nghiệm Real-time PCR Hình 13 Quy trình thực xét nghiệm Real-time PCR Phương pháp test thử nhiều quốc gia có số mắc LĐKT thấp cao Tính đến tháng năm 2011 có 40 quốc gia giới thuộc châu Mỹ La tinh, châu Phi, 26 châu Âu, châu Á (trong có Việt Nam [6]) bắt đầu triển khai kỹ thuật Tính đến tháng 11 năm 2012 có 112 máy triển khai giới Máy Xpert MTB/RIF cho phép xác định vi khuẩn lao với độ nhạy cao (99% người bệnh xét nghiệm đờm trực tiếp dương tính, 80 % người bệnh xét nghiệm đờm trực tiếp âm tính, 91% với trường hợp ni cấy dương tính 72.5% với người bệnh ni cấy âm) Kỹ thuật cho kết nhanh vòng đơn giản cho người dùng Điều đặc biệt máy cho kết kép, tức lần trả lời cho phép biết bệnh phẩm có vi khuẩn lao hay khơng, có nhiều hay vi khuẩn có kháng với thuốc R hay khơng Nhiễm Soi AFB chéo loại bỏ hoàn toàn việc khuếch đại, lai mẫu phân tích xảy với quy trình khép kín Ngồi xét nghiệm không hạn chế việc phát Âm tínhcác đột biến cũ đồng thời có khả phát đột biến chưa nhận biết trước vùng Dương tính xác định Hạn chế xét nghiệm chi phí, trang thiết bị đắt so với điều CẤY kiện kinh tế số nước phát triển Độ nhạy (lỏng giảm córắn) diện đột biến gây kháng thuốc vùng khảo sát, chất lượng mẫu đàm kém, nhiễm chéo chủngPCR mycobacteria khácXét nghiệm chủng mycobactriea không gây lao Nitrate reductase Bảng 14 Các đột biến kháng thuốc phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử Dương tính Âm tính Kháng thuốc Phương pháp sản phẩm Độ nhạy % Độ đặc hiệu % Phát kháng R xác định RT-PCR (KTC 95%) (KTC 95%) GenXpert 98hàng (97-99) KhángMTB/RIF sinh đồ thuốc thứ nhất99 (98-99) (lỏng Xét nghiệm lai INNO-LiPa Rif.TB 93rắn) (89-96) 99 (99-100) Phát kháng H đầu dò MTBDRplus Xét nghiệm lai MTBDRplus đầu dò Khơng phải đa kháng thuốc, Đa kháng thuốc Phát kháng thuốc Xét nghiệm kháng lai MTBDRsl thuốc khác kháng lao hàng hai đầu dò 97 (92-99) 77 (69-83) 98 (95-99) 99 (97-100) Còn nhạy 100 với thuốc kháng 85 (78-91) (97-100) lao hàng thứ Kháng sinh đồ thuốc hàng hai (lỏng rắn) Siêu kháng thuốc Không phải siêu kháng thuốc, kháng thuốc khác Còn nhạy với thuốc kháng lao hàng hai 27 Hình 15 Sơ đồ chẩn đốn lao đa kháng thuốc dựa xét nghiệm truyền thống sinh học phân tử Điều trị lao kháng thuốc 28 5.1 Phác đồ điều trị lao đơn kháng thuốc lao kháng nhiều thuốc Bảng 16 Phác đồ điều trị lao đơn kháng thuốc lao kháng nhiều thuốc Kiểu đề kháng Phác đồ điều trị gợi ý thuốc lao H (± S) H Z H, Z S H E H E (±S) R R E (± S) R Z (± S) Thời gian điều trị tối thiếu R + Z+ E R + E + Fluoroquinolones R + E + tối thiểu 2-3 tháng thuốc chích hàng thứ 6- tháng 9-12 tháng R + Z + Fluoroquinolones hai R + z + Fluoroquinolones + tối thiểu 2-3 tháng 9-12 tháng thuốc chích hàng thứ hai H + E + Fluoroquinolones + tối thiểu tháng Z (± tối thiểu 2-3 tháng thuốc chích hàng thứ hai) H + Z + Fluoroquinolones + tối thiểu 2-3 tháng thuốc chích hàng thứ hai H + E + Fluoroquinolones + tối thiểu 2-3 tháng thuốc chích hàng thứ hai tháng 9-12 tháng 12-18 tháng 18 tháng 18 tháng R + Fluoroquinolones + thứ thuốc uống hàng H, E Z (±S) thứ hai + tối thiểu 2-3 tháng thuốc chích hàng thứ hai 18 tháng 29 5.2 Phác đồ điều trị lao đa kháng thuốc Bảng 17 Phác đồ điều trị lao đa kháng thuốc Kiểu đề kháng thuốc lao Phác đồ điều trị gợi ý Thời gian điều trị tối thiếu PZA + EMB + Fluoroquinolones + H R (± S) thuốc chích hàng thứ hai + thuốc 18 tháng thuốc uống hàng thứ hai (nhóm 4) PZA + Fluoroquinolones + thuốc H, R E (± S) chích hàng thứ hai thuốc 24 tháng thuốc uống hàng thứ hai (nhóm 4) EMB + Fluoroquinolones + thuốc H, R, P (± S) chích hàng thứ hai + thuốc Irong 24 tháng thuốc uống hàng thứ hai (nhóm 4) Fluoroquinolones + thuốc chích hàng H, R, P E (± S) thứ hai + thuốc thuốc 24 tháng uống hàng thứ hai Bảng 18 Thứ tự thuốc kháng lao có hoạt tính vi khuẩn lao giảm dần Tên thuốc Liều dùng - cách dùug Isoniazid (H) Rifampin (R) Pyrazinamide (P) Ethambutol (E) Streptomycin (Amikacin, Kanamycin) Capreomycin Fluoroquinolones + Levofloxacin + Ofloxacin Ethionamide 300 mg/ngày, uống 600 mg/ngày, uống 25 mg/kg/ngày, uống 25 mg/kg/ngày, uống 15 mg/kg/ngày, tiêm bắp/tiêm tĩnh mạch 15 mg/kg/ngày, tiêm bắp/tiêm tĩnh mạch Cycloserine Para-aminosalicylic acid 0,5-1 g/ngày, chia - lần/ ngày, uống g chia 2-3 lần/ngày, uống 1000 mg/ngày, uống 800 mg/ngày, uống 0,5-1 g/ngày, chia 2-4 lần/ ngày, uống 30 5.3 Điều trị lao siêu kháng thuốc Sử dụng thuốc nhóm nhạy cảm Sử dụng thuốc tiêm hàng thứ hai (nhóm 2) nhạy cảm với thời gian tối thiểu 12 tháng toàn thời gian điều trị lao Sử dụng thứ thuốc fluoroquinolones thê hệ moxifloxacin Sử dụng tất thuốc kìm khuẩn uống hàng thứ hai (nhóm 4) nhạy cảm Sử dụng tối thiểu thuốc số thuốc nhóm Xem xét dùng H liều cao Xem xét định phẫu thuật hổ trợ tổn thương khu trú thùy phổi phổi Bảo đảm kiểm soát tốt tình trạng bội nhiễm phổi Điều trị nhiễm HIV (ARV) 10 Theo dõi sát điều trị bổ sung đầy đủ 5.4 Phác đồ điều trị lao kháng thuốc theo Dự án phòng chống lao Việt Nam Phác đồ IVa: cho bệnh nhân lao thất bại phác đồ I II kháng thuốc (có kháng sinh đồ) [1] Z.E.Km.Ofx.Pto.Cs /12 Z.E.Ofx.Pto.Cs Phác đồ IVb: cho bệnh nhân lao mạn tính kháng thuốc (có kháng sinh đồ).[1] Z.E.Cm (Km).Mfx (Ofx).Pto.Cs / 12 Z.E.Mfx(Ofx).Pto.Cs TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2009) "Hướng dẫn quản lý bệnh lao" Nhà xuất Y học, Hà Nội Hoàng Minh (2001) "Một số kỹ thuật sinh học phân tử hoá sinh vi sinh chẩn đốn bệnh lao" Tạp chí Thơng tin y dược, 12, (12 ), 23-34 Lê Văn Phủng (2001) "Một số ứng dụng PCR vi sinh vật" Tạp chí Y học thực hành, 2, (5), 55-67 Trịnh Quốc Phương (2011) Nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc Isoniazid phương pháp xác định đột biến gen KatG gen inhA từ chủng vi khuẩn lao phân lập Miền Trung-Việt Nam Đại học Y Thái Nguyên Thái Nguyên Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Ngọc Hiển, Lê Thu Hồng, Nguyễn Văn Hưng (2005) "Phát gen rpoB Ở chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin " Bộ khoa học công nghệ môi trường, p 1228-1230 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ (2007) "Hồn thiện quy trình PCR hai gen IS 1081 23S rDNA nâng cao hiệu chẩn đốn lao" Tạp chí y dược học quân sự, 32, (2), 31-37 Đinh Ngọc Sỹ (2005) "Những thuận lợi, khó khăn giải pháp công tác chống lao Việt Nam" Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học Hội nghị bệnh phổi phẫu thuật lồng ngực nước nói tiếng Pháp vùng Đông Nam Á -4 Nguyễn Thị Thu Thái (2009) "Lao kháng đa thuốc kháng đa thuốc mở rộng: thách thức, mối đe dọa biện pháp kiểm sốt" Tạp chí y học thực hành, (670), 24-35 Nguyễn Thị Thu Thái (2012) Nghiên cứu tình hình kháng thuốc đặc điểm phân tử gen rpoB chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc Đại học Y-Dược Thái Nguyên 10 Phạm Long Trung (1999) Bệnh học lao phổi, Nhà xuất Đà Nẵng, Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, 11 Phạm Long Trung, Ngơ Thanh Bình (2009) "Bệnh lao kháng thuốc" Bài giảng lao bệnh phổi 12 Phạm Hùng Vân (1996) "Phản ứng chuỗi polymerase (PCR), đại cách mạng sinh học phân tử" Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh., Số đặc biệt năm 1996, tr 27 - 35 Tiếng Anh 13 Hegde SS, et al (2005) "A Fluoroquinolone Resistance Protein from Mycobacterium tuberculosis That Mimics DNA" Science, 308, (5727), 1480-1483 14 Spindola de Miranda S, et al (2001) "Mutations in the rpoB Gene of RifampicinResistant Mycobacterium tuberculosis Strains Isolated in Brazil and France" Memórias Instituto Oswaldo Cruz, 96, (2), 247-250 15 Ozturk C E., et al (2005) "Molecular Analysis of Isoniazid, Rifampin and Streptomycin Resistance in Mycobacterium tuberculosisIsolates from Patients with Tuberculosis in Duzce, Turkey" Japanese Journal of Infectious Diseases, 58, (5), 309-312 16 Taniguchi H, et al (1996) "Rifampicin Resistance and Mutation of the rpoBGene in Mycobacterium tuberculosis," FEMS Microbiology Letters, 144, (1), 103-108 17 Telenti A, et al (1997) "Genotypic Assessment of Isoniazid and Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis: A Blind Study at Reference Laboratory Level" Journal of Clinical Microbiology, 35, (3), 719-723 18 Telenti A, et al (1999) "Detection of Rifampicin-Resistance Mutations in Mycobacterium tuberculosis" The Lancet, 341, (8846), 647-650 19 WHO (2006) "Emergence of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance to second-line drugs worldwide, 2000-2004" Morbidity and Mortality Weekly Report 55, (11), 301-305 20 WHO (2007) "Global tuberculosis control: Serveilance, planning, finacing" WHO Report 2007, WHO/HTM/TB/2007.376 21 WHO (2008) Anti-Tuberculosis Drug Resistance in the World, Fourth Global Report Word Health Organization Geneva 22 WHO (2009) "Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing" WHO Report 2009, WHO/HTM/TB/2009.411 ... loại lao kháng thuốc: Lao đơn kháng thuốc: vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng với loại thuốc kháng lao hàng thứ Lao kháng nhiều thuốc: vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng. .. việc quản lý bệnh lao kháng thuốc theo chương trình chống lao, lao kháng thuốc khơng gọi lao kháng thuốc tiên phát lao kháng thuốc mắc phải mà chia thành nhóm [11]:  Lao kháng thuốc mới: bệnh... nhạy 100 với thuốc kháng 85 (78-91) (97-100) lao hàng thứ Kháng sinh đồ thuốc hàng hai (lỏng rắn) Siêu kháng thuốc Không phải siêu kháng thuốc, kháng thuốc khác Còn nhạy với thuốc kháng lao hàng