NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

Lai tại chỗ gắn huỳnh quang: một kiểu lai phân tử thực hiện ngay trong tế bào mà không cần tách chiết nucleic acid ra khỏi tế bào Cung cấp thông tin chính xác về vị trí và phân bố của đoạn DNA quan tâm trên NST nhờ một mẫu dò (probe) chuyên biệt

Nội dung:

1.Các kỹ thuật khảo sát nhiễm sắc thể

2.Các kỹ thuật khảo sát nucleic acid

3.Các kỹ thuật khảo sát protein

2

Mục tiêu:

1.Nhận diện được kỹ thuật tương ứng mức độ phân tử

2.Nêu được cơ chế phân tử và cách phát hiện bất thường 3.Liệt kê ứng dụng của PCR và giải trình tự DNA

Southern blot (DNA) Northern blot (RNA) PCR

DNA sequencing

Hóa mô miễn dịch

Nhiễm sắc thể đồ (karyotype)

 Bản đồ của bộ nhiễm sắc thể của một cá thể

 Nam bình thường: 46,XY

 Nữ bình thường: 46,XX

5

Cấy tế bào

Thu hoạch

Thu hoạch tế bào 0.075 M KCl Cố định

(Acid acetic: methanol)

Cytokines (tủy: 1 – 2 ngày,

Bất thường số lượng:

Hội chứng Down (Trisomy 21)

7

Bất thường cấu trúc:

Bệnh bạch cầu mạn dòng tủy

8

Hạn chế của nhiễm sắc thể đồ

 Chỉ khảo sát được khi nuôi cấy bệnh phẩm

thành công

 Không phát hiện được những bất thường nhỏ

 Tốn nhiều thời gian và nhân lực

9

FISH (fluorescence in situ hybridization)

 Lai tại chỗ gắn huỳnh quang: một kiểu lai phân

tử thực hiện ngay trong tế bào mà không cần tách

chiết nucleic acid ra khỏi tế bào

 Cung cấp thông tin chính xác về vị trí và phân

bố của đoạn DNA quan tâm trên NST nhờ một mẫu

dò (probe) chuyên biệt

10

 Probe: Chuỗi DNA đã được đánh dấu

 Denature: Chuỗi đôi DNA tách rời thành chuỗi đơn

 Hybridize: Các chuỗi đơn DNA đặc hiệu sẽ bắt cặp được với nhau ở điều kiện thích hợp

Phát hiện được các chuỗi đặc hiệu

nhờ các probe

FISH: Nguyên tắc

11

Hình ảnh tăng biểu hiện của gen HER2/neu

trong ung thư vú

Bình thường:

2 tín hiệu màu đỏ

Ung thư vú: nhiều tín hiệu đỏ

Herceptin

NST 17

HER2/neu

12

Hình ảnh chuyển vị NST(Philadelphia) trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy

nl(9) nl(9)

nl(22)

nl(22)

nl(9) der(9)

Southern blot: Nguyên tắc

15

Southern blot: Quy trình kỹ thuật

16

Southern blot: Ứng dụng

• Phát hiện những thay đổi về cấu trúc của DNA

(mất đoạn, thêm đoạn)

• Có thể phát hiện đột biến điểm nếu đột biến làm

thay đổi điểm cắt của restriction enzyme

17

Mất đoạn gen CYP 21 và C4B trong bệnh

thiếu 21-hydroxylase

(Collier S, EMBO 1989:1393- 1402)

18

Đột biến tế bào hình liềm

19

Southern blot: Hạn chế của kỹ thuật

• Cần lượng DNA lớn (microgram)

• Kỹ thuật phức tạp, tốn nhiều thời gian

20

PCR (Polymerase Chain Reaction)

và DNA sequencing: Nguyên tắc kỹ thuật

22

PCR và DNA sequencing: Nguyên tắc kỹ

thuật

23

2.5 2.5 27.5 0.5

Tính chất Tối ưu

Thành phần G+C= 40 - 60%, phân bố đều của 4 loại base

Chiều dài 18 – 25 bp (2 primer trong 1 cặp chênh nhau

không quá 3 bp)Tính lập lại và tự bổ sung Không quá 3 bp (tránh hairpin)

Tính bổ sung của 1 cặp

primer Đầu tận cùng 3’ không được bổ sung với bất kỳ vị trí nào của primer còn lại trong cặpNhiệt độ nóng chảy (Tm:

melting temperature) Tm của 2 primer trong cặp không chênh nhau quá 50C

Đầu tận cùng 3’ Nên là G hoặc C (nhưng không nên NNGC

Thermostable DNA polymerase

PCR thường quy: Taq polymerase (0.5 – 2.5 unit/25 -50 µL)

Fidelity: đặc biệt quan trọng cho chẩn đoán các đột biến điểm

Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs)

200 -250 µM (cho từng dNTP): Nồng độ cao ức chế PCR

Divalent cations (đã có trong buffer)

Thường dùng Mg2+ (1.5 mM): Cần cho hoạt động của DNA

polymerase

Nồng độ (mol) của Mg2+ phải cao hơn tổng nồng độ của

Template (khuôn)

RT-PCR:

• Chỉ khảo sát các exon, không khảo sát intron

• Đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu các fusion gene (gen tổ hợp)

mRNA cDNA RT-PCR

reverse transcriptase

Genomic DNA

Genomic PCR

27

Genomic PCR và RT-PCR

28

Lys Val Val

GAG GAG ATA AAT GGA AAC AAT TAT GTT TAC ATA GAC CCA ACA CAA CTT

561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 Glu Glu Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Val Tyr Ile Asp Pro Thr Gln Leu

CCT TAT GAT

AAG GTT GTT CCT TAT GAT CAC AAA TGG GAG TTT CCC AGA AAC AGG CTG AGT TTT G

Lys Val Val Pro Typ Asp His Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asn Arg Leu Ser Phe

Lys Val Val

GAG GAG ATA AAT GGA AAC AAT TAT GTT TAC ATA GAC CCA ACA CAA CTT

561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 Glu Glu Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Val Tyr Ile Asp Pro Thr Gln Leu

CCT TAT GAT

AAG GTT GTT CCT TAT GAT CAC AAA TGG GAG TTT CCC AGA AAC AGG CTG AGT TTT G

Lys Val Val Pro Typ Asp His Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asn Arg Leu Ser Phe

Phân tích sản phẩm PCR

29

Giải trình tự chuỗi DNA (DNA sequencing)

30

Máy giải trình tự chuỗi

31

PCR và DNA sequencing: Ứng dụng

1 Chẩn đoán sự hiện diện gen (gây bệnh)

• BCR/ABL: Bạch cầu mạn dòng tủy (Imatinib)

• PML/RARA: Bạch cầu cấp dòng tủy (Retinoic acid)

• FIP1L1/PDGFRA: Hội chứng tăng eosinophil (Imatinib)

• TMPRSS2/ERG: Ung thư tiền liệt tuyến

• EML4/ALK: Ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư phổi

2 Chẩn đoán các đột biến gen

• Nguy cơ bệnh

• Chẩn đoán bệnh

• Tiên lượng bệnh

Gen đột biến Bệnh lý Ý nghĩa

P53 Ung thư vòm họng, vú, đại

KRAS Ung thư đại trực tràng,

phổi, tụy Đánh giá đáp ứng kháng thể đơn dòng

BRAF Melanomas, ung thư giáp Đích điều trị của sorafenib?

PIK3CA Ung thư gan, ung thư vú Đích điềutrị mới của everolimus?

JAK2 Rối loạn tăng sinh tủy Tiêu chuẩn chẩn đoán

FLT3, NPM1 Bạch cầu cấp Tiên lượng, đích điều trị

BRCA1/2 Ung thư vú, buồng trứng Nguy cơ

KIT, PDGFRA U mô đệm đường tiêu hóa Imatinib, sunitinib

BCR/ABL Bạch cầu mạn dòng tủy Imatinib, nilotinib, dasatinib

MYH7, MYBPC3 Phì đại tim cô căn Chẩn đoán

33

Ung thư tiền liệt tuyến:

Quy trình phát hiện gen tổ hợp TMPRSS2/ERG

Bệnh phẩm: Mô tươi, mô đông lạnh

(không dùng chất cố định) Tách chiết RNA (RNase!)

Chuyển mRNA thành cDNA bằng

reverse transcriptase

Điện di trên thạch: Quan sát kết quả

PCR-2: Tìm sự hiện diện gen tổ hợp

(Primer xuôi trên gen TMPRSS2, primer ngược trên gen ERG)

PCR-1: Kiểm chất lượng cDNA

(primer xuôi và ngược trên cùng

Bệnh phẩm

Tách chiết nucleic acid (DNA hoặc RNA)

PCR

Giải trình tự chuỗi DNA

Quy trình chẩn đoán đột biến gen

36

1 Mất đoạn (deletion): Alpha-thalassemia

2 Thêm đoạn (duplication, insertion): FLT3 trong bệnh

bạch cầu cấp dòng tủy

3 Đột biến điểm (point mutation):

+ Đột biến sai nghĩa (missense mutation): Thay bằng

amino acid khác (BRAF trong ung thư giáp).

+ Đột biến vô nghĩa (nonsense mutation): Stop codon.

Các kiểu đột biến gen thường gặp

37

Bạch cầu mạn dòng tủy: Đột biến kháng thuốc

GAG

255Glu

GTG256Val

TAC257Tyr

GGG254Gly

TAC253Tyr

CAG252Gln

AAG

Lys

Chuỗi bình thường

Bạch cầu cấp dòng tủy: Đích điều trị mới

39

(D: Aspartic acid, G:Glycine, Y: Tyrosine) 40

FLT3: INTERNAL TANDEM DUPLICATION

(ITD)

41

ASO-PCR (Allele Specific

Oligonucleotide-PCR):

Chẩn đoán đột biến điểm

44

Rối loạn tăng sinh tủy: Đột biến điểm JAK2 V617F

1 100-bp ladder

2 Mẫu bệnh nhân

3 Chứng âm

 Protein EGFR tăng biểu hiện trong 40-80% NSCLC

(Non-small Cell Lung Cancer)

 Gefitinib ức chế đặc hiệu EGFR

 Chỉ 10% bệnh nhân NSCLC có đáp ứng với

gefitinib

(Lynch TJ, N Engl J Med 2004)

46

ĐỘT BIẾN EGFR TRONG UNG THƯ PHỔI

47

(Fukui T, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008)

• Carcinôm tuyến > carcinôm

(Fukui T, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008)

ĐÁP ỨNG VỚI THUỐC ỨC CHẾ EGFR

PHỤ THUỘC KIỂU ĐỘT BIẾN

49

Exon 18 Exon 19 Exon 20 Exon 21

Giải trình tự chuỗi DNA

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN EGFR

50

Hóa mô miễn dịch Western blot

51

Ứng dụng các kỹ thuật cơ bản

Colorectal: KRAS , p53

3 Tim mạch:

Brugada syndrome (SCN5A)

Idiopathic cardiac hypertrophy (sarcomere-gene mutations)

Wafarin (CYP2C9, VKORC1)

4 Sản phụ khoa Metformin/polycystic ovary syndrome

(STK11)

5 Nội tiết

Tiểu đường type 2 (TCF7L2

polymorphisms)

SHPT

Ung thưBệnh truyền nhiễm

Sản phụ khoa

Nội tiết

DượcHuyết học