Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid và cảm ứng tạo rễ tơ ở cây thổ nhân sâm (TT))

1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Th nh n s m Talinum paniculatum) loại c y th n thảo biết đến với giá trị dược liệu cao Các nghiên cứu thành phần hóa học c y Th nh n s m cho thấy, rễ có nhiều hợp chất có hoạt tính dược học khác như: alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, phytosterol, phytol; phytol chiếm tỷ lệ cao 69,32 %) Từ l u, Th nh n s m sử dụng y học c truyền, đặc biệt điều trị bệnh tiểu đường type 2, viêm da, rối loạn tiêu hóa, yếu sinh lý rối loạn sinh sản Galactogue có tác dụng chống viêm, kích thích tăng tiết sữa phụ nữ cho bú có khả chữa bệnh viêm loét Rễ c y Th nh n s m sử dụng để thúc đẩy khả sinh sản chữa bệnh phụ khoa bất thường chu kỳ kinh nguyệt Steroid saponin rễ c y Th nh n s m có tác dụng phòng chữa bệnh xơ vỡ động mạch, đồng thời nguyên liệu để t ng hợp nên hormone sinh dục Flavonoid hợp chất có vai trò quan trọng người có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư… Tuy nhiên, chưa thấy nghiên cứu thu nhận flavonoid c y Th nh n s m hàm lượng flavonoid lồi thuộc chi Talinum, có c y Th nh n s m thấp Vấn đề đặt làm để n ng cao hàm lượng flavonoid loài thuộc chi Talinum nói chung c y Th nh n s m T paniculatum) nói riêng để sử dụng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Cho đến nay, có số cách tiếp cận chủ yếu áp dụng c y dược liệu để làm tăng hàm lượng flavonoid Đó sử dụng phương pháp chọn lọc từ quần thể lai hữu tính hay đột biến thực nghiệm, từ chọn lọc dòng c y có hàm lượng flavonoid cao Tuy nhiên, c y Th nh n s m chưa thấy công bố ứng dụng phương pháp để n ng cao hàm lượng flavonoid; việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật chuyển gen nuôi cấy mô tế bào thực vật c y dược liệu quan t m mang lại hiệu cao thu nhận dược chất, có flavonoid Ở thực vật, flavonoid t ng hợp qua đường phenylpropanoid, chuyển phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA sau 4-coumaroylCoA vào q trình t ng hợp flavonoid Có nhiều enzyme tham gia vào đường t ng hợp flavonoid phenylalanine ammonialyase, cinnamate 4-hydroxylase, 4-Coumarate CoA ligase, chalcone synthase, chalcone isomerase… Trong đó, chalcone isomerase (CHI) enzyme chìa khóa cho sinh t ng hợp flavonoid việc xúc tác cho ph n tử naringenin chalcone mạch hở đóng vòng để hình thành naringenin Sau đó, hợp chất chuyển hóa thành nhiều loại flavonoid flavanone, flavonol anthocyanin Do vậy, biểu mạnh gen mã hóa enzyme CHI làm tăng hoạt độ enzyme chìa khóa CHI hàm lượng loại flavonoid c y chuyển gen cải thiện Ngoài ra, Th nh n s m lồi c y có rễ củ, nhiều hợp chất thứ cấp tập trung rễ, có flavonoid Do vậy, để tăng thu nhận flavonoid c y Th nh n s m, cách tiếp cận ứng dụng k thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật phương pháp cảm ứng tạo rễ tơ nhằm tăng sinh khối quan t m nghiên cứu Khi mô thực vật lá, đoạn th n, mầm ) bị l y nhiễm Agrobacterium rhizogenes T-DNA cấu trúc Ri-plasmid mang gen rol gen mã hóa sinh t ng hợp auxin loại IAA chuyển vào mô thực vật Sự biểu đồng thời gen rol gen t ng hợp auxin tạo nên kiểu hình rễ tơ mơ tế bào thực vật l y nhiễm A rhizogenes Xuất phát từ sở chọn tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid cảm ứng tạo rễ tơ Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum)” 3 Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng c y chuyển gen GmCHI có hàm lượng flavonoid cao c y đối chứng khơng chuyển gen xác định điều kiện thích hợp cảm ứng tạo rễ tơ in vitro c y Th nh n s m Nội dung nghiên cứu i) Nghiên cứu định danh mẫu Th nh n s m thu số địa phương phương pháp hình thái so sánh, kết hợp với nghiên cứu ứng dụng mã vạch DNA trình tự vùng ITS; đoạn gen matK, rpoB, rpoC1) ii) Nghiên cứu chuyển gen GmCHI tạo dòng Th nh n s m chuyển gen Ph n tích biểu protein tái t hợp CHI c y Th nh n s m chuyển gen hệ T1 iii) Nghiên cứu tạo rễ tơ c y Th nh n s m nhờ Agrobacterium rhizogenes Những đóng góp luận án Luận án cơng trình nghiên cứu có hệ thống, từ định danh mẫu Th nh n s m thu thập số địa phương tạo nguồn vật liệu ban đầu để nuôi cấy in vitro đến chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào c y Th nh n s m ph n tích biểu gen GmCHI có nguồn gốc từ đậu tương c y Th nh n s m chuyển gen Cụ thể là: 1) Định danh mẫu Th nh n s m thu địa phương Việt Nam thuộc loài T paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae) 2) Lần biểu thành cơng gen GmCHI có nguồn gốc từ c y đậu tương c y Th nh n s m tạo dòng Th nh n s m chuyển gen có hàm lượng flavonoid cao đối chứng khơng chuyển gen 3) Tạo dòng rễ tơ từ c y Th nh n s m làm vật liệu phục vụ chọn dòng rễ tơ có hàm lượng dược chất cao Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Kết đạt luận án có giá trị khoa học thực tiễn cách tiếp cận cải thiện hàm lượng flavonoid k thuật chuyển gen mã hóa enzyme chìa khóa q trình t ng hợp flavonoid tạo dòng rễ tơ in vitro c y Th nh n s m Về mặt khoa học, kết nghiên cứu luận án sở ứng dụng k thuật tạo dòng rễ tơ chuyển gen vào việc n ng cao hàm lượng dược chất c y Th nh n s m số loại c y dược liệu khác Về mặt thực tiễn, dòng rễ tơ dòng c y Th nh n s m chuyển gen làm vật liệu cho chọn giống Th nh n s m có hàm lượng flavonoid cao Kết nghiên cứu mở triển vọng ứng dụng k thuật tạo dòng rễ tơ k thuật biểu mạnh gen vào việc n ng cao hàm lượng dược chất c y dược liệu Cấu trúc luận án Luận án có 129 trang kể phụ lục), chia thành chương, phần: Mở đầu trang); Chương 1: T ng quan tài liệu 37 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu 16 trang); Chương 3: Kết thảo luận 41 trang); Kết luận đề nghị trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án trang); Tài liệu tham khảo 14 trang); Phụ lục 12 trang) Luận án có 16 bảng, 33 hình tham khảo 131 tài liệu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo t ng kết 131 tài liệu, có tài liệu tiếng Việt, 125 tài liệu tiếng Anh ba vấn đề bản, là: 1) Nghiên cứu ni cấy in vitro c y Th nh n s m; 2) Flavonoid đường t ng hợp flavonoid thực vật; 3) Enzyme CHI biểu gen mã hóa CHI C y Th nh n s m Talinum paniculatum Gaertn.) chứa flavonoid saponin có khả chống oxy hóa mạnh sử dụng điều trị số bệnh viêm nhiễm, dị ứng, loét dày… Hiện chưa có cơng trình nghiên cứu cơng bố hàm lượng flavonoid c y Th nh n s m, nhiên, loài Talinum triangulare xác định có hàm lượng flavonoid thấp khoảng ,897 mg g tươi) (Afolabi cs, 2014) Flavonoid t ng hợp qua đường phenylpropanoid chalcone isomerase enzyme chìa khóa cho sinh t ng hợp flavonoid việc xúc tác cho ph n tử naringenin chalcone mạch hở đóng vòng để hình thành naringenin Để cải thiện hàm lượng dược chất c y Th nh n s m có flavonoid), nghiên cứu chủ yếu tiếp cận theo hướng tăng sinh khối tế bào, rễ tơ Nghiên cứu Zhao cs 9) vật liệu thích hợp nồng độ chất kích thích tăng trưởng tối ưu đến hình thành mơ sẹo, cụm chồi, tỷ lệ rễ, tỷ lệ sống sót c y vườn ươm; Muhallilin cs 13) nghiên cứu cảm ứng tạo rễ c y Th nh n s m từ mô với điều chỉnh chất kích thích tăng trưởng auxin ni cấy in vitro Trong đó, Yosephine cs 12) nghiên cứu ảnh hưởng việc sục khí mật độ cấy đến sinh khối rễ tơ c y Th nh n s m bình bioreactor cách biến nạp A rhizogenes vào mẫu c y Th nh n s m Ở Việt Nam, chưa tìm thấy cơng bố tạo dòng rễ tơ c y Th nh n s m Ngoài cách tiếp cận cải thiện hàm lượng flavonoid ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào tạo sinh khối để tăng thu nhận flavonoid, kĩ thuật biểu mạnh gen mã hóa enzyme chìa khóa CHI đường t ng hợp flavonoid quan t m nghiên cứu Trên giới có số cơng trình nghiên cứu biểu mạnh gen CHI c y Cà chua (Muir cs, 1), Thuốc (Li cs, 2006), Mẫu đơn Lin cs 2014)… Kết thu hàm lượng flavonoid t ng số, flavonol, anthocyanin tăng nhiều lần so với c y đối chứng khơng chuyển gen Hiện nay, chưa tìm thấy cơng trình nghiên cứu chuyển gen CHI vào c y Th nh n s m Do vậy, hướng ứng dụng cơng nghệ tăng cường biểu gen mã hóa enzyme chìa khóa đường chuyển hóa t ng hợp flavonoid c y Th nh n s m cần quan t m tập trung nghiên cứu Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Hạt mẫu c y Th nh n s m thu từ tháng 15 đến tháng 16 địa phương: huyện T n Yên, tỉnh Bắc Giang BG); thành phố Thái Nguyên TN1); huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên TN2); thị xã Sơn T y, Hà Nội HT); huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh QN) Tiến hành gieo trồng mẫu Th nh n s m phục vụ nhận diện tạo nguyên liệu cho ph n tích hình thái sinh học ph n tử Chủng A rhizogenes ATTC 15834 cung cấp từ Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn l m Khoa học & Công nghệ Việt Nam Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 mang vector chuyển gen pCB301-GmCHI cung cấp Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên 2.2 HĨA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Hóa chất sử dụng nghiên cứu mua từ hãng n i tiếng giới hãng Fermentas, Bio-Neer, Invitrogen, Trizol Reagents, kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis, ; Các thí nghiệm ni cấy in vitro chuyển gen vào c y Th nh n s m thực Phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Các thí nghiệm ph n tích c y chuyển gen tiến hành phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, phòng Cơng nghệ Tế bào thực vật Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn l m Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp định danh mẫu c y Th nh n s m phương pháp hình thái so sánh theo Phạm Hồng Hộ 1999), Đỗ Tất Lợi 4), tra cứu http://www.tropicos.org/Name/26200178 phương pháp ph n loại học ph n tử dựa vào số mã vạch DNA vùng ITS, đoạn gen matK, rpoC1, rpoB 2.3.2 Các phương pháp nuôi cấy in vitro: 1) Phương pháp khử trùng hạt; Phương pháp tái sinh đa chồi c y Th nh n s m; 3) Phương pháp nuôi cấy tạo rễ tơ c y Th nh n s m 2.3.3 Phương pháp chuyển gen GmCHI vào c y Th nh n s m qua nách mầm nhờ A.tumefaciens tiến hành dựa nghiên cứu Olhoft cs 6) 7 2.3.4 Phương pháp ph n tích c y chuyển gen: Kiểm tra có mặt gen chuyển kĩ thuật PCR Xác định hợp gen chuyển GmCHI vào hệ gen c y Th nh n s m thực theo phương pháp Southern blot Southern 1975) Ph n tích biểu protein GmCHI tái t hợp c y Th nh n s m chuyển gen phương pháp điện di theo Laemmli 197 ) Western blot Định lượng protein GmCHI tái t hợp c y chuyển gen ELISA theo phương pháp Sun cs 6) Xác định hàm lượng flavonoid c y chuyển gen kĩ thuật quang ph hấp thụ theo Kalita cs 13) 2.3.5 Các phương pháp ph n tích, xử lý số liệu: Các số liệu nghiên cứu xử lí thống kê phần mềm SPSS để xác định giá trị trung bình, phương sai, độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu Chƣơng 3.1 ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU THỔ NHÂN SÂM 3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu Thổ nhân sâm thu số địa phƣơng Kết so sánh năm mẫu Th nh n s m thu từ địa phương (T n Yên, tỉnh Bắc Giang; thành phố Thái Nguyên; huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên; thị xã Sơn T y, Hà Nội; huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh) cho thấy, mẫu Th nh n s m giống hình thái, gồm rễ, th n, lá, hoa Hình 3.1 A) Rễ Th nh n s m rễ củ, hình trụ mang nhiều rễ Hình 3.1 B) Th n Th nh n s m mọc thẳng, th n màu xanh, chia thành nhiều cành Hình 3.1 A) Lá mọc so le, hình trứng ngược, hình thìa hình muỗng, khơng lơng, khơng có bẹ, phiến dày, thẫm, hai mặt bóng, đầu nhọn tù, phía cuống hẹp lại, cuống ngắn Hình 3.1 C) Đầu cành xuất cụm hoa hình chùm nhiều hoa nhỏ, đường kính mm, cánh hoa màu tím nhạt, nhị dài mm, bầu hoa hình cầu, hoa có đài Hình 3.1 D) Quả nhỏ, chín có màu xám tro, đường kính ước mm Hình 3.1 E) Hạt Th nh n s m nhỏ, màu đen nhánh dẹt, mặt có v n n i Hình 3.1 F) 8 Hình 3.1 C y Th nh n s m A: Thổ nhân sâm; B: rễ, củ; C: cành, lá; D: nụ hoa; E: quả; F: hạt Sau đối chiếu đặc điểm hình thái quan sát mẫu Th nh n s m với đặc điểm c y Th nh n s m theo mơ tả Phạm Hồng Hộ 1999), Đỗ Tất Lợi 4) đồng thời tra cứu http: www.tropicos.org Name 262 178 cho thấy mẫu Th nh n s m BG, TN1, TN2, HT, QN thuộc loài T paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae) Tuy nhiên, sử dụng phương pháp hình thái so sánh khó xác định mẫu Th nh n s m c y giai đoạn phát triển chưa hoa) dễ nhầm lẫn với loài T triangulare Vì vậy, để tránh nhầm lẫn với thảo dược khác, cần kết hợp phương pháp hình thái so sánh với việc sử dụng mã vạch DNA nhận diện mẫu c y Th nh n s m 3.1.2 Đặc điểm trình tự nucleotide vùng ITS đoạn gen matK 3.1.2.1 Đặc điểm trình tự vùng ITS Kết kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose % cho thấy chạy xuất băng với kích thước khoảng bp, tương ứng với kích thước dự kiến vùng ITS Hình 3.2) Kết giải trình tự nucleotide xác định vùng ITS có kích thước 643 bp Bằng BLAST NCBI cho thấy vùng ITS ph n lập từ mẫu nghiên cứu ITS-TN1, ITS-TN2, ITS-BG, ITS-HT, ITS-QN) có tỷ lệ tương đồng 99 % với ba trình tự vùng ITS loài T paniculatum, mang mã số JF508608, L78094, EU410357 GenBank; kết khẳng định trình tự nucleotide ph n lập vùng ITS thuộc loài T paniculatum 9 M 0,75 kb 0,5 kb    0,6 kb Hình 3.2 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nh n vùng ITS M : Marker kb; 1: ITS-TN1, 2: ITS-TN2, 3: ITS-BG, 4: ITS-HT, 5: ITS-QN Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nh n đoạn gen matK M: Marker kb; 1: matK-TN1, 2: matK-TN2, 3: matK-BG, 4: matK-HT, 5: matK-QN 3.1.2.2 Đặc điểm trình tự đoạn gen matK Kết kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose % cho thấy chạy xuất băng với kích thước khoảng bp tương ứng với kích thước dự kiến đoạn gen matK Hình 3.5) Kết giải trình tự nucleotide thu đoạn DNA mẫu Th nh n s m có kích thước 8 nucleotide Bằng BLAST NCBI cho thấy trình tự đoạn DNA ph n lập từ mẫu nghiên cứu matK-TN1, matK-TN2, matKBG, matK-HT, matK-QN) có tỷ lệ tương đồng 99 % với trình tự gen matK loài T paniculatum, mang mã số AY015274, KY952520, GQ434150 GenBank, kết cho thấy trình tự nucleotide ph n lập đoạn gen matK lồi T paniculatum Ngồi trình tự vùng ITS nh n) đoạn gen matK gen lục lạp), chúng tơi giải trình tự hai đoạn gen lục lạp rpoC1 rpoB Hai đoạn gen rpoC1 rpoB ph n lập có kích thước tương ứng 595 bp 518 bp Bằng BLAST NCBI cho thấy trình tự hai đoạn gen rpoB rpoC1 ph n lập từ mẫu nghiên cứu TN1, TN2, BG, HT, QN) đoạn gen rpoB rpoC1 thuộc loài T paniculatum 10 3.1.3 Thảo luận kết định danh mẫu Thổ nhân sâm tự nhiên Bằng phương pháp hình thái so sánh, mẫu Th nh n s m xác định có đặc điểm quan dinh dưỡng, quan sinh sản giống giống với đặc điểm mô tả c y Th nh n s m theo Phạm Hoàng Hộ 1999), Đỗ Tất Lợi 4) Tuy nhiên, số đặc điểm mẫu Th nh n s m có nhiều điểm tương đồng với loài T triangulare chi Talinum, nên chưa thể nhận diện mẫu Th nh n s m thuộc loài hay khác lồi Vì vậy, việc kết hợp phương pháp hình thái so sánh với phương pháp ph n loại học ph n tử sử dụng mã vạch DNA (vùng ITS, đoạn gen matK, rpoC1 rpoB) sử dụng để nhận diện mẫu Th nh n s m Từ hệ gen mẫu Th nh n s m, vùng ITS ph n lập có kích thước 643 bp; ba đoạn gen matK, rpoC1 rpoB có kích thước tương ứng 8 bp, 595 bp 518 bp Bằng BLAST NCBI cho thấy trình tự đoạn gen matK, rpoC1 rpoB năm mẫu nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng 97 %, 99 %, 99 % với trình tự gen lục lạp loài T paniculatum Liu cs 18) giải trình tự, mang mã số MG710385 GenBank Kết làm sở để khẳng định mẫu Th nh n s m thu số địa phương phía Bắc Việt Nam thuộc lồi T paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae) 3.2 TẠO DÒNG THỔ NHÂN SÂM CHUYỂN GEN GmCHI 3.2.1 Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen Thổ nhân sâm 3.2.1.1 Kết khử trùng hạt Kết bảng 3.3 cho thấy, điều kiện khử trùng tối ưu hạt Th nh n s m dung dịch javel % phút tỷ lệ bình không bị nhiễm 92,23 %, tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 91,55 %, chồi mầm phát triển tốt) 11 Bảng 3.3 Ảnh hưởng javel % HgCl2 0,1 % đến tỷ lệ nảy mầm hạt sau ngày nuôi cấy n ) Thời gian khử trùng phút) 10 Tỷ lệ bình Tỷ lệ hạt Kích thước Hình thái mầm khơng bị nảy mầm mầm sau nhiễm (%) ngày cm) (%) Ảnh hưởng javel 60 % đến t l nảy m m hạt 92,23c 91,55c 1,58b Mập, xanh bình thường Ảnh hưởng HgCl2 0,1 % đến t l nảy m m hạt 91,25b 82,26c 1,39c Mập, xanh bình thường Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05 3.2.1.2 ết tạo đa chồi rễ in vitro Thổ nhân sâm 3.2.2.1 nh h ởng c a đến ph t sinh sinh tr ởng ch i t n ch l mầm Kết bảng 3.4 cho thấy, môi trường MS b sung 1,5 mg l BAP có khả tạo chồi kích thích sinh trưởng chồi lớn từ mầm, số chồi/mẫu đạt 1,68 giai đoạn tuần) 1,78 giai đoạn tuần) Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ mầm n ) Số mẫu Số Nồng độ tạo chồi chồi mẫu BAP (mg/l) % so với đối chứng Chiều cao chồi (cm) Số chồi 0,87a 4,74b Chất lượng chồi Sau tuần 1,5 23,56d 1,68a 136,58 Mập, XBT Sau tuần Mập, XBT Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05; XBT: xanh bình thường 1,5 24,12d 1,78a 132,83 2,88c 6,14a nh h ởng kết hợp I đến ph t sinh sinh tr ởng ch i t đoạn thân mang mắt ch i bên Kết ph n tích ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn th n mang mắt chồi bên trình bày bảng 3.5 12 Bảng 3.5 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn th n mang mắt chồi bên n ) Nồng độ Số chồi % so Chiều cao Số Chất lượng BAP mẫu với ĐC chồi cm) chồi chồi (mg/l) Sau tuần 2,0 3,04d 218,7 0,87a 5,22c Mập, XBT Sau tuần 2,0 3,24c 216,00 2,88b 6,52a Mập, XBT Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05; XBT: xanh bình thường Kết bảng 3.5 cho thấy môi trường MS b sung mg/l BAP có khả tạo chồi kích thích sinh trưởng chồi lớn nhất, số chồi/mẫu đạt 3, giai đoạn tuần) 3,24 giai đoạn tuần) So sánh kết bảng 3.4 bảng 3.5 cho thấy phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn th n mang mắt chồi bên hiệu phát sinh sinh trưởng chồi từ nách mầm nồng độ BAP Như vậy, BAP mg l chất kích thích tăng trưởng thích hợp tạo đa chồi từ đoạn th n mang mắt chồi bên c y Th nh n s m Kết ảnh h ởng c a I N đến khả rễ c a Thổ nhân sâm in vitro Kết ph n tích ảnh hưởng IAA đến khả rễ c y Th nh n s m trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hưởng IAA đến khả rễ c y Th nh n s m (n=30) Nồng độ IAA Tỷ lệ chồi rễ Chiều dài rễ Số rễ chồi (mg/l) (%) (cm) Sau tuần 0,5 80,17d 5,13d 0,92b Sau tuần d 0,5 98,12 13,23d 3,79c Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05 Bảng 3.7 cho thấy, môi trường MS b sung ,5 mg l IAA cho tỷ lệ c y rễ cao đạt ,17 % tăng 2,66 lần giai đoạn tuần) 13 98,12 % tăng 1, lần giai đoạn tuần) so với đối chứng Vậy nồng độ IAA tối ưu kích thích rễ in vitro c y Th nh n s m ,5 mg l Kết ph n tích ảnh hưởng NAA đến khả rễ in vitro c y Th nh n s m bảng 3.8 cho thấy, môi trường MS b sung ,5 mg l NAA cho tỷ lệ c y rễ cao đạt 58,33 % tăng 1,93 lần giai đoạn tuần) 94,36 % tăng 1, lần giai đoạn tuần) so với đối chứng Như nồng độ NAA ,5 mg l thích hợp kích thích rễ c y Th nh n s m Bảng 3.8 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ c y Th nh n s m (n=30) Nồng độ NAA (mg/l) 0,5 0,5 Tỷ lệ chồi rễ Số rễ chồi (%) Sau tuần 58,33e 3,21c Sau tuần c 94,36 10,43c Chiều dài rễ cm) 0,31a 2,79c Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05 Khi so sánh tiêu tỷ lệ rễ số rễ thời điểm nồng độ tối ưu ,5 mg l IAA ,5 mg l NAA cho thấy IAA hiệu NAA Vậy chất kích thích rễ tối ưu c y Th nh n s m ,5 mg l IAA 3.2.2 ết chuyển gen GmCHI tạo Thổ nhân chuyển gen 3.2.2.1 Kết khảo s t vật liệu chuyển gen thông qua A tumefaciens Kết tạo đa chồi từ mầm đoạn th n mang mắt chồi bên sau biến nạp A tumefaciens thể qua bảng 3.9 hình 3.9 14 Bảng 3.9 Hiệu tạo đa chồi từ mầm đoạn th n mang mắt chồi bên sau l y nhiễm A tumefaciens (n=150) Vật liệu Lá mầm Đoạn th n Số chồi mẫu Chiều cao chồi cm) b 3,02 1,40a Sau tuần 1,34a 1,13a Số chồi Chất lượng chồi 5,21b 3,43a Mập Gầy Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05 Kết bảng 3.9 hình 3.9 cho thấy, hiệu tạo đa chồi từ mầm sau biến nạp A tumefaciens cao gấp 2,15 lần (ở giai đoạn tuần) so với đoạn th n mang mắt chồi bên Đồng thời chồi tạo từ mầm có chiều cao, số lá, chất lượng chồi tốt so với chồi tạo từ đoạn th n mang mắt chồi bên Như vậy, mầm vật liệu thích hợp tạo đa chồi phục vụ chuyển gen c y Th nh n s m Hình 3.9 Hiệu tạo đa chồi từ mầm đoạn th n mang mắt chồi bên sau l y nhiễm A tumefaciens A, B: Sự phát sinh sinh trưởng chồi từ m m biến nạp A tumefaciens sau tu n tu n C, D: Sự phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên biến nạp A tumefaciens sau tu n tu n 3.2.2.2 Chuyển cấu trúc mang gen GmCHI tạo Thổ nhân sâm đ ợc chuyển gen Kết chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào c y Th nh n s m thông qua A.tumefaciens l y nhiễm qua nách mầm thể bảng 3.1 hình 3.1 Bảng 3.1 cho thấy, 73 mẫu biến nạp qua giai đoạn tái sinh sinh trưởng chồi, chọn lọc kháng sinh tạo 15 18 dòng c y chuyển gen GmCHI gồm 28 c y điều kiện nhà lưới, chiếm 2,46 % Song song với thí nghiệm chuyển gen GmCHI, tiến hành hai lô đối chứng ĐC ĐC1 Ở lô ĐC1 thu 35 c y sống sót vườn ươm Hình 3.10 Hình ảnh biếp nạp tái sinh c y Th nh n s m chuyển gen A: hạt khử trùng nảy m m môi trường GM; B: đồng nuôi cấy tối môi trường CCM; C: cảm ứng tạo chồi; D: tái sinh đa chồi sau tu n; E, F: rễ tạo hồn chỉnh mơi trường RM; G: chuyển gen trồng giá thể; H: trồng vườn ươm điều ki n nhà lưới Bảng 3.10 Kết biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI vào c y Th nh n s m 40 Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài 40 30 730 200 Đối chứng thí nghiệm T ng số mẫu biến nạp ĐC ĐC1 Thí nghi m 3l n Số chồi rễ Số c y sống giá thể Số c y sống sót nhà lưới 0 70 68 40 35 102 63 43 28 Ghi chú: ĐC0: mẫu Thổ nhân sâm không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1: mẫu Thổ nhân sâm không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh 16 3.2.3 ết phân tích Thổ nhân sâm chuyển gen 3.2.3.1 X c định hợp c a gen chuyển GmCHI hệ gen Thổ nhân sâm hệ T0 Kết kiểm tra c c Thổ nhân sâm đ ợc chuyển gen PCR Kết ph n tích PCR với cặp mồi đặc hiệu CHI-NcoI-F/CHI- NotIR hình 3.11 thu đoạn DNA với kích thước khoảng ,66 kb tương ứng với kích thước gen GmCHI chuyển vào c y Th nh n s m c y Th nh n s m (T0-2.1, T0-2.2, T0-4, T0-7, T0-10, T0-12, T0-14 T0-16) Kết kiểm tra c c Thổ nhân sâm đ ợc chuyển gen Southern blot Tám c y Th nh n s m chuyển gen hệ T dương tính với PCR T - 2.1; T0- 2.2; T0- 4; T0- 7; T0- 10; T0- 12; T0- 14; T0- 16 c y đối chứng không chuyển gen sử dụng để ph n tích Southern blot, kết thể hình 3.12 Kết hình 3.12 cho thấy, băng DNA xuất c y chuyển gen T - 2.1; T0- 2.2; T0- 4; T0- 7; T0- 10; T0- 14 Hiệu suất chuyển gen tính đến thời điểm ph n tích lai Southern 73 ,68 % Như vậy, khẳng định gen chuyển GmCHI gắn vào hệ gen c y chuyển gen Các c y Th nh n s m chuyển gen cho kết lai Southern tiếp tục chăm sóc ưu tiên phát triển phục vụ ph n tích khả hoạt động biểu mạnh gen chuyển GmCHI c y chuyển gen KB Kb ← 0.66 kb M (+) M + (-)- 11 3 44 66 77 88 20,0 20.0 10,0 10.0 7,0 7.0 5,0 5.0 4,0 4.0 3,0 3.0 2,0 2.0 ← 0.66 kb 1,5 1.5 Hình 3.11 Hình ảnh điện di kiểm tra Hình 3.12 Kết ph n tích c y Th sản phẩm PCR nh n gen GmCHI từ nh n s m chuyển gen lai c y Th nh n s m chuyển Southern c y chuyển gen gen hệ T cặp mồi CHI- dương tính với PCR với đoạn dò NcoI-F/CHI- NotI-R GmCHI đánh dấu biotin 17 3.2.3.2 hân tích biểu protein CHI t i tổ hợp c c dòng Thổ nhân sâm chuyển gen hệ T1 Thu hạt c y Th nh n s m có kết dương tính với Southern blot hệ T T0- 2.1; T0- 2.2; T0- 4; T0- 7; T0- 10; T0- 14) đem gieo trồng có hạt c y T1- 2.2; T1- 4; T1- 10; T1- 14) nảy mầm tạo dòng c y chuyển gen T1 Kết lai Western ph n tích biểu protein tái t hợp dòng c y Th nh n s m chuyển gen c y đối chứng không chuyển gen hình 3.13 cho thấy, màng lai xuất băng màu vị trí kích thước khoảng 25 kDa dòng c y Th nh n s m chuyển gen T1- 2.2; T1- hệ T1 Dòng T1- 4; T1- 14 c y đối chứng khơng chuyển gen khơng xuất băng protein Điều chứng tỏ gen chuyển GmCHI di truyền từ hệ T sang T1 dòng Th nh n s m chuyển gen T1 (T1- 2.2; T1- ) dịch mã t ng hợp protein GmCHI tái t hợp Như vậy, hiệu suất chuyển gen giai đoạn đạt ,27 % 73 ) (+) (-) M kDa 70 55 40 35 25 15 Hình 3.13 Kết ph n tích Western blot từ dòng Th nh n s m chuyển gen hệ T1 c y đối chứng khơng chuyển gen Hình 3.14 Kết ph n tích ELISA xác định hàm lượng protein tái t hợp CHI hai dòng Th nh n s m chuyển gen (T1- 2.2; T1- ) c y đối chứng không chuyển gen WT) Hàm lượng protein tái t hợp GmCHI c y hai dòng Th nh n s m chuyển gen T1- 2.2, T1- ph n tích phương pháp ELISA, kết thể hình 3.14 Biểu đồ hình 3.14 cho thấy hai dòng Th nh n s m chuyển gen T1- 2.2, T1- ) t ng hợp protein tái t hợp GmCHI có hàm lượng 6,14 µg mg 4,29 µg mg Dòng T1- 2.2 có hàm lượng protein GmCHI cao dòng T1- Kết 18 chứng minh hai dòng Th nh n s m chuyển gen, protein GmCHI tăng cường biểu 3.2.3.3 X c định hàm l ợng flavonoid tổng số c c dòng Thổ nhân sâm hệ T1 Kết xác định hàm lượng flavonoid hai dòng c y Th nh n s m chuyển gen (T1- 2.2; T1- 10) c y đối chứng thể bảng 3.11 Bảng 3.11 Hàm lượng flavonoid t ng số hai dòng Th nh n s m chuyển gen T1- 2.2; T1- c y đối chứng không chuyển gen Các mẫu nghiên cứu Các c y đối chứng khơng chuyển gen Dòng T1- 2.2 Dòng T1- 10 Hàm lượng flavonoid t ng số (mg/g) 0,57a % so với đối chứng không chuyển gen 100 4,24c 2,74b 743,86 480,70 Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05 Bảng 3.11 cho thấy dòng Th nh n s m chuyển gen GmCHI hệ T1 T1-2.2 T1-1 ) có hàm lượng flavonoid 4,24 mg g 2,74 mg g tăng 743,86 % 48 ,7 % so với c y đối chứng không chuyển gen Kết chứng minh biểu mạnh gen GmCHI hai dòng Th nh n s m chuyển gen T1-2.2 T1-1 tác động làm tăng t ng hợp flavonoid c y chuyển gen 3.2.4 Thảo luận kết biến nạp tạo dòng Thổ nhân sâm chuyển gen Ở c y Th nh n s m hướng nghiên cứu chủ yếu tập trung vào nuôi cấy in vitro để tăng sinh khối mà chưa thấy cơng trình nghiên cứu thiết lập phương pháp chuyển gen hiệu để cải thiện hàm lượng dược chất c y Th nh n s m, có flavonoid Nghiên cứu chọn cách tiếp cận ứng dụng nguyên lý biểu mạnh gen nhằm n ng cao hiệu biểu protein tái t hợp mục đích tăng cường hoạt động enzyme chìa khóa tham gia vào đường sinh t ng hợp hợp chất thứ cấp thực vật GmCHI mã 19 hóa enzyme chìa khóa CHI ph n lập từ c y đậu tương lựa chọn chuyển vào c y Th nh n s m Th nh n s m thực vật hai mầm, kĩ thuật chuyển gen thông qua A.tumefaciens sử dụng có hiệu l y nhiễm qua nách mầm Olhoft cs, 6) Trong t ng số 73 mẫu biến nạp, tạo 28 c y Th nh n s m chuyển gen tương ứng với 18 dòng chuyển gen sống sót Kết ph n tích tác động enzyme tái t hợp đến t ng hợp flavonoid hai dòng c y Th nh n s m chuyển gen T1 cho thấy, hàm lượng flavonoid t ng số hai dòng Th nh n s m chuyển gen T1- 2.2; T1- 4,24 mg g 2,74 mg g tăng 7,4 lần 4,8 lần so với c y đối chứng không chuyển gen Kết phù hợp với nghiên cứu số tác giả giới Li cộng (2006) nghiên cứu chuyển gen SmCHI loài S medusa vào c y Thuốc lá, kết làm tăng hàm lượng flavonoid t ng số gấp lần so với c y không chuyển gen Nghiên cứu chuyển gen CHI ph n lập từ c y Dạ yến thảo chuyển vào Cà chua Muir cs 1) tạo c y Cà chua chuyển gen có hàm lượng flavonol tăng đến 78 lần vỏ so với c y không chuyển gen Như thấy, chuyển gen CHI ph n lập từ loài sang loài khác làm tăng hàm lượng flavonoid, flavonol flavone c y chuyển gen cách tiếp cận lựa chọn k thuật biểu mạnh gen GmCHI có nguồn gốc từ đậu tương làm tăng hàm lượng enzyme CHI tham gia t ng hợp flavonoid dẫn đến tăng hàm lượng flavonoid c y Th nh n s m hợp lý Ngoài cách tiếp cận cải thiện hàm lượng flavonoid c y Th nh n s m kĩ thuật biểu mạnh gen mã hóa CHI, cơng nghệ tạo rễ tơ hướng nghiên cứu nhằm tăng sinh khối in vitro để thu nhận flavonoid c y Th nh n s m 3.3 TẠO DÒNG RỄ TƠ TỪ CÂY THỔ NHÂN SÂM 3.3.1 ết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 3.3.1.1 Khảo s t vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Thổ nhân sâm Kết khảo sát loại mơ thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ thể qua bảng 3.12 hình 3.16 20 Bảng 3.12 Kết khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ c y Th nh n s m n 15 , sau tuần) Loại mô Tỷ lệ mẫu tạo Số rễ mẫu Chiều dài rễ rễ tơ %) (cm) Lá 65,9c 3,45c 3,25c Đoạn th n mang 55,6a 1,89a 1,59a mắt chồi bên Lá mầm 58,2b 2,32b 1,82b Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05 Hình 3.16 Khảo sát vật liệu thích hợp để tạo rễ tơ c y Th nh n s m sau tuần biến nạp A: rễ tơ cảm ứng từ m m, B: rễ tơ cảm ứng từ đoạn thân mang mắt chồi bên, C: rễ tơ cảm ứng từ mơ Kết bảng 3.12 hình 3.16 cho thấy, loại mô khảo sát cho cảm ứng tạo rễ tơ mơ cho tỷ lệ tạo rễ tơ cao 65,9 % tuần tu i), thấp đoạn th n mang mắt chồi bên cho tỷ lệ tạo rễ tơ 55,6 % tuần tu i) Đồng thời rễ tơ sinh trưởng phát triển tốt từ mô chuyển gen Như vậy, mô c y in vitro sau - tuần nuôi cấy nguồn vật liệu thích hợp cho tạo rễ tơ c y Th nh n s m 3.3.1.2 nh h ởng c a mật độ A rhizogenes, n ng độ AS, thời gian lây nhiễm khuẩn, thời gian đ ng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ t mô l Thổ nhân sâm Kết ph n tích ảnh hưởng mật độ A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian l y nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ từ mô Th nh n s m cho thấy, mật độ vi khuẩn tương ứng với giá trị OD600 ,6; nồng độ AS μmol/l; thời gian nhiễm khuẩn phút; thời 21 gian đồng nuôi cấy ngày; nồng độ cefotaxime mg l cho tỷ lệ mô cảm ứng tạo rễ tơ cao (65,9 %) Bảng 3.13 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ từ mô Th nh n s m (n 15 , sau tuần) Ảnh hưởng mật độ khuẩn OD600 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Ảnh hưởng nồng độ AS Tỷ lệ mẫu Nồng độ Tỷ lệ tạo rễ tơ AS mẫu tạo (%) μmol l) rễ tơ %) 23,42a 34,56c 65,9e 43,24d 29,43b 50 75 100 125 150 43,23b 47,32c 65,9d 45,14c 40,10a Ảnh hưởng thời Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn gian đồng nuôi cấy Thời gian Thời gian Tỷ lệ Tỷ lệ mẫu nhiễm đồng nuôi mẫu tạo tạo rễ tơ khuẩn cấy rễ tơ %) (%) phút) ngày) d 45,23 36,12d e 10 65,9 65,9e c 15 40,07 23,34c b 20 34,12 14,12b 25 12,51a 4,12a Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05 3.3.1.3 Nghiên cứu x c định ng ỡng diệt khuẩn c a cefotaxime Kết xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime bảng 3.14 cho thấy, nồng độ cefotaxime tối ưu diệt khuẩn mg l cho tỷ lệ đĩa cấy không bị nhiễm 93,76 % tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ 65,9 % Kết phù hợp với nghiên cứu Yosephine cs (2015) Bảng 3.14 Xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime sau tuần Nồng độ cefotaxime Tỷ lệ đĩa cấy không bị Tỷ lệ mẫu tạo (mg/l) nhiễm %) rễ tơ %) 500 93,76d 65,9d Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05 3.3.1.4 hân tích dòng rễ tơ mang gen rolC kĩ thuật PCR Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR hai cặp mồi nh n gen rolC gen VirD2 cho thấy, đoạn gen rolC có kích thước khoảng 0,5 kb đoạn gen VirD2 có kích thước khoảng ,3 kb khuếch đại giếng đối chứng dương pRi plasmid 15834); giếng chạy sản phẩm PCR dòng rễ tơ dòng 2, 3, 6, 7, 8) Hình 3.17 A) có diện băng DNA sáng rõ nét vị trí 52 bp vị trí với đối chứng dương gen rolC) khơng có băng DNA vị trí 338 bp gen VirD2 Hình 3.17 B); ngược lại với giếng đối chứng dương, 22 giếng đối chứng m đối chứng rễ không chuyển gen (rễ bất định) khơng có băng vạch vị trí 338 bp 52 bp A B Hình 3.17 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nh n đoạn gen rolC A) đoạn gen virD2 (B) M: Thang chuẩn 1kb; (-): nước; (+): sản phẩm PCR Ri plasmid; Rễ không chuyển gen; Các giếng từ đến (A): sản phẩm PCR nhân gen rolC dòng rễ tơ Thổ nhân sâm; Các giếng 2, 3, 6, 7, (B): sản phẩm PCR nhân gen virD2 dòng rễ tơ mang gen rolC 3.3.1.5 nh h ởng c a trạng th i môi tr ờng đến tăng tr ởng rễ tơ Thổ nhân sâm Trong ba trạng thái môi trường thử nghiệm gồm đặc, bán lỏng lỏng rễ tơ môi trường lỏng nuôi lắc cho tốc độ tăng trưởng cao (4,11 g rễ tươi), tiếp sau môi trường bán lỏng (3,02 g rễ tươi) cuối môi trường đặc (2,12 g rễ tươi) tăng 7,47; 5,49 3,85 lần so với khối lượng rễ ban đầu sau tuần nuôi cấy (Bảng 3.15) Như vậy, môi trường lỏng nuôi lắc giúp rễ tơ Th nh n s m tăng trưởng tốt Hình ảnh thể kết ni cấy tạo rễ tơ c y Th nh n s m thể hình 3.18 Bảng 3.15 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến tăng trưởng rễ tơ Th nh n s m Trạng thái môi trường Khối lượng Khối lượng rễ Khối Khối lượng rễ rễ ban đầu tươi sau lượng rễ khô g) (g) tuần g) tăng lần) Lỏng nuôi lắc 0,55 4,11c 7,47 0,34b b Bán lỏng 0,55 3,02 5,49 0,23a a Đặc 0,55 2,12 3,85 0,18a Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể hi n khơng có sai khác với p < 0,05 23 B A D C E Hình 3.18 Hình ảnh cảm ứng ni cấy rễ tơ Th nh n s m A- mô Thổ nhân sâm; B- rễ tơ cảm ứng sau tu n; C- nuôi cấy rễ tơ môi trường bán lỏng sau tu n; D- nuôi rễ tơ môi trường lỏng nuôi lắc sau tu n; E- rễ tơ tăng trưởng sau tu n 3.3.2 Thảo luận kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm Nuôi cấy sinh khối rễ tơ nhờ vi khuẩn A rhizogenes để thu nhận hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học giải pháp hiệu quả, khắc phục hạn chế phương pháp nh n giống truyền thống phương pháp nuôi cấy tăng sinh khối tế bào Đối với c y Th nh n s m, nghiên cứu rễ tơ ứng dụng k thuật nh n nuôi tăng sinh khối rễ tơ Yosephine cs 12) cơng bố Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo dòng rễ tơ từ thực vật đặc biệt c y Th nh n s m mẻ Trong nghiên cứu này, mơ vật liệu thích hợp tạo rễ tơ c y Th nh n s m Mật độ vi khuẩn tương ứng với giá trị OD600 ,6; nồng độ AS 100 μmol/l; thời gian nhiễm khuẩn phút; thời gian đồng nuôi cấy ngày; nồng độ cefotaxime 500 mg/l điều kiện thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ từ mơ c y Th nh n s m Kết phù hợp với nghiên cứu Yosephine cs (2015) Môi trường MS trạng thái lỏng không b sung chất điều hòa sinh trưởng, ni điều kiện lắc thích hợp cho tăng trưởng rễ tơ c y Th nh n s m Kết kiểm tra có mặt gen rolC phương pháp PCR vắng mặt gen virD2 khẳng định dòng rễ tơ dòng 2, 3, 6, 7, 8) tạo từ c y Th nh n s m, kết phù hợp với nghiên cứu Thwe cs 16) Tuy nhiên, để sử dụng dòng rễ tơ Th nh n s m sản xuất thu nhận flavonoid nói riêng chất chuyển hóa thứ cấp nói chung cần tiếp tục nghiên cứu, so sánh hàm lượng dược chất dòng rễ tơ với rễ c y Th nh n s m tự nhiên 24 ẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ết luận 1.1 Các mẫu Th nh n s m thu số địa phương xác định thuộc loài T paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam Portulacaceae) phương pháp hình thái so sánh kết hợp với ph n tích mã vạch DNA Các mã vạch DNA sử dụng để định danh mẫu Th nh n s m vùng ITS, đoạn gen matK, ropC1, rpoB 1.2 Lá mầm đoạn th n mang mắt chồi bên vật liệu thích hợp tạo đa chồi in vitro c y Th nh n s m Môi trường MS + ml l nước dừa + 1,5 mg l BAP thích hợp cho phát sinh sinh trưởng chồi từ nách mầm Môi trường MS + 50 ml/l nước dừa + mg l BAP thích hợp cho phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn th n mang mắt chồi bên Khảo sát vật liệu chuyển gen thông qua A tumefaciens xác định mầm vật liệu nhận gen thích hợp Từ 73 mẫu biến nạp tạo 28 c y chuyển gen GmCHI điều kiện nhà lưới Protein tái t hợp GmCHI biểu hai dòng Th nh n s m chuyển gen T1-2.2 T1-1 hệ T1 với hàm lượng 6,14 µg mg 4,29 µg mg Hai dòng Th nh n s m chuyển gen T1-2.2 T1-1 có hàm lượng flavonoid t ng số 4,24 mg g 2,74 mg g, tăng 7,4 lần 4,8 lần so với c y đối chứng không chuyển gen 1.3 Mơ vật liệu thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ c y Th nh n s m L y nhiễm mô A rhizogenes với OD600 ,6; nồng độ AS μmol/l; thời gian nhiễm khuẩn phút; thời gian đồng nuôi cấy ngày; nồng độ cefotaxime 500 mg/l điều kiện thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ c y Th nh n s m dòng rễ tơ tạo Mơi trường MS trạng thái lỏng khơng b sung chất điều hòa sinh trưởng, ni điều kiện lắc thích hợp cho tăng trưởng rễ tơ c y Th nh n s m Đề nghị 2.1 Tiếp tục ph n tích đánh giá dòng Th nh n s m chuyển gen T12.2; T1- 10) hệ T2, T3,… nhằm chọn dòng Th nh n s m chuyển gen có hàm lượng flavonoid cao n định 2.2 Tiếp tục ph n tích so sánh hàm lượng flavonoid dòng rễ tơ rễ không chuyển gen c y Th nh n s m  ... thời gen rol gen t ng hợp auxin tạo nên kiểu hình rễ tơ mơ tế bào thực vật l y nhiễm A rhizogenes Xuất phát từ sở chọn tiến hành đề tài: Nghiên cứu biểu gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid. .. cảm ứng tạo rễ tơ Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum)” 3 Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng c y chuyển gen GmCHI có hàm lượng flavonoid cao c y đối chứng không chuyển gen xác định điều kiện thích hợp. .. hướng nghiên cứu nhằm tăng sinh khối in vitro để thu nhận flavonoid c y Th nh n s m 3.3 TẠO DÒNG RỄ TƠ TỪ CÂY THỔ NHÂN SÂM 3.3.1 ết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 3.3.1.1 Khảo s t vật liệu thích hợp