Nghiên cứu biểu hiện gen Matrix metalloproteinase9 (MMP9) của người ở E. coli

VIN HN LM KHOA HC V CễNG NGH VIT NAM VIN SINH THI V TI NGUYấN SINH VT - NGUYN TH DUNG NGHIấN CU BIU HIN GEN MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) CA NGI E COLI Chuyờn ngnh: Sinh hc thc nghim H Ni - 2014 S húa bi Trung tõm Hc liu - HTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LI CM N Li u tiờn, tụi xin by t lũng bit n sõu sc v chõn thnh ti TS Lờ Th Bớch Tho, trng phũng Húa sinh Protein, Vin Cụng ngh Sinh hc, ngi thy ó luụn hng dn, nh hng v giỳp tụi thc hin thnh cụng lun ny Tụi xin gi li cm n ti cỏc thy cụ giỏo trng i hc Thỏi Nguyờn cng nh cỏc thy cụ thuc Vin Sinh thỏi v Ti nguyờn Sinh vt, cỏc thy cụ Vin Cụng ngh Sinh hc, Vin Hn lõm Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó tn tỡnh ging dy v truyn th cho tụi kin thc chuyờn mụn thc hin lun ny Tụi cng xin chõn thnh cm n cỏc cụ chỳ, cỏc anh ch phũng Húa sinh Protein ó hng dn tn tỡnh, dy tụi nhng kin thc thc hnh phũng thớ nghim c bit l Th.S Bựi Th Huyn ngi ó tn tỡnh hng dn, ch bo tụi tng bc t mi bt u thc tp, cng nh to mi iu kin thun li, giỳp , v cho tụi nhng li khuyờn quý bỏu tụi hon thnh lun ny Xin gi li cm n ti gia ỡnh, b m nhng ngi sinh thnh, nuụi dng tụi l ch da tinh thn vng chc cho tụi sut thi gian qua Cui cựng tụi xin gi li cm n ti anh ch, bn bố tụi ó c v ng viờn, giỳp tụi hon thnh lun ny Mt ln na tụi vụ cựng cm n H Ni, ngy thỏng 12 nm 2014 Hc viờn Nguyn Th Dung S húa bi Trung tõm Hc liu - HTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii NHNG CH VIT TT Kớ hiu a.a Tờn Ting Anh Amino acid Tờn Ting Vit Axit amin Amp+ Ampicilin Ampicilin APS Amonium persulphate Mui amonium persulphate bp Base pair Cp baz DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli Vi khun Escherichia coli ECM Extracellular matrix Cht nn ngoi bo EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide EtOH Ethanol Cn ethanol IPTG Isopropyl-thio--D-galactoside Isopropyl-thio--D-galactoside Kb Kilo base 1000 cp baz (1000 bp) kD Kilo Dalton Kilo Dalton LB Luria - Bertani Mụi trng LB MMPs Matrix metalloproteinases Metalloproteinases c cht mRNA Messenger RNA RNA thụng tin MT-MMPs Membrane-type MMPs MMPs dng mng PCR Polymerase chain reaction Phn ng chui trựng hp rRNA Ribosomal ribonucleic acid RNA ribosome SDS Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis in di bin tớnh trờn gel polyacrylamide TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA TEMED N, N, N, N-Tetramethyl Ethylendiamine N, N, N, N-Tetramethyl Ethylendiamine S húa bi Trung tõm Hc liu - HTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MC LC LI CM N i NHNG CH VIT TT iii MC LC iv DANH MC CC BNG S DNG TRONG LUN VN vi DANH MC CC HèNH S DNG TRONG LUN VN vii M U CHNG I: TNG QUAN TI LIU 1.1 Tng quan v Matrix metalloproteinases (MMPs) 1.1.1 Phõn loi v cu trỳc MMPs 1.1.2 Chc nng sinh hc ca MMPs 1.2 Tng quan v Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) 10 1.2.1 Cu trỳc gen MMP-9 11 1.2.2 Cu trỳc protein MMP-9 12 1.2.3 S kớch hot MMP-9 15 1.2.4 Chc nng sinh hc ca MMP-9 15 1.3 Tim nng ng dng ca MMP-9 y hc 17 1.3.1 Tim nng l ch th sinh hc chn oỏn cỏc bnh v tim mch 17 1.3.2 Tim nng l ch th sinh hc cho cỏc bnh lý khỏc 20 1.4 Tỡnh hỡnh nghiờn cu MMP-9 Vit Nam 20 CHNG II: VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 22 2.1 Vt liu, húa cht v thit b mỏy múc 22 2.2 Phng phỏp 24 2.2.1 Tỏch chit RNA tng s 24 2.2.2 Tng hp cDNA 24 2.2.3 Nhõn gen MMP-9 bng phn ng PCR 25 2.2.4 Phng phỏp ghộp ni DNA 26 2.2.5 Bin np plasmid vo E coli bng phng phỏp sc nhit 27 2.2.6 Tỏch chit DNA plasmid 28 2.2.7 Phng phỏp in di DNA trờn gel agarose 29 2.2.8 Thụi gel bng kit QIAquick Gel Extraction 29 2.2.9 Xỏc nh trỡnh t DNA 30 2.2.10 Thit k vector biu hin gen mó húa cho MMP-9 31 S húa bi Trung tõm Hc liu - HTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 2.2.11 Biu hin gen mó húa cho protein MMP-9 31 2.2.12 Phõn tớch protein bng k thut in di SDS-PAGE 31 2.2.13 K thut Western blot 32 CHNG III: KT QU V THO LUN 34 3.1 Kt qu tỏch dũng gen mó hoỏ cho MMP-9 34 3.1.1 Tỏch chit RNA tng s 34 3.1.2 Nhõn gen mó hoỏ cho MMP-9 bng phn ng PCR 34 3.1.3 Tỏch dũng v xỏc nh trỡnh t gen MMP-9 36 3.2 Thit k vector biu hin gen mó húa cho MMP-9 43 3.3 Biu hin gen MMP-9 vi khun E coli BL21(DE3) 48 KT LUN V KIN NGH 51 TI LIU THAM KHO 52 S húa bi Trung tõm Hc liu - HTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MC CC BNG S DNG TRONG LUN VN Bng Tiờu Bng 1.1 Phõn loi Matrix metalloproteinases Bng 1.2 Vai trũ ca MMPs Bng 1.3 Trang a hỡnh gen liờn quan ti s biu hin tng ca MMP-9 v bnh tim mch 18 Bng 2.1 Trỡnh t cỏc cp mi 22 Bng 2.2 Húa cht v enzyme 23 Bng 2.3 Mỏy múc v thit b 23 Bng 2.4 Thnh phn phn ng PCR 25 Bng 2.5 Thnh phn phn ng ni ghộp 26 Bng 2.6 Thnh phn mụi trng nuụi cy vi sinh vt 28 Bng 2.7 Thnh phn v cỏc dung dch m SDS-PAGE 32 S húa bi Trung tõm Hc liu - HTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MC CC HèNH S DNG TRONG LUN VN Hỡnh Tiờu Trang Hỡnh 1.1 c im cu trỳc ca mt s phõn nhúm MMPs Hỡnh 1.2 V trớ cỏc yu t phiờn mó trờn promoter ca gen mó húa cho MMP-9 11 Hỡnh 1.3 Cu trỳc ba chiu ca MMP-9 14 Hỡnh 3.1 Kt qu in di kim tra sn phm tỏch RNA tng s 34 Hỡnh 3.2 Kt qu in di kim tra sn phm PCR t cDNA mó húa cho MMP-9 36 Hỡnh 3.3 Hỡnh 3.4 Hỡnh 3.5 Kt qu in di kim tra sn phm tỏch DNA plasmid cỏc dũng khun lc Kt qu in di kim tra sn phm ct plasmid tỏi t hp bng EcoRI Kt qu in i kim tra sn phm PCR trc tip t khun lc ó chn lc 37 38 39 Hỡnh 3.6 Kt qu xỏc nh trỡnh t gen MMP-9 39 Hỡnh 3.7 Kt qu so sỏnh trỡnh t protein MMP-9 42 Hỡnh 3.8 S thit k vector biu hin ca gen mó húa cho MMP-9 44 Hỡnh 3.9 Kt qu in di kim tra on gen v vector sau x lý bng enzyme gii hn 45 Hỡnh 3.10 S enzyme gii hn NcoI v EcoRI ca vector MMP9-pCR2.1 46 Hỡnh 3.11 Kt qu in di kim tra plasmid tỏi t hp cho biu hin MMP-9 47 Hỡnh 3.12 Kt qu biu hin protein in di trờn gel polyacrylamide 12.5% 48 Hỡnh 3.13 Kt qu kim tra protein biu hin bng phn ng Western blot vi khỏng th khỏng MMP-9 S húa bi Trung tõm Hc liu - HTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii 49 M U Ngy nay, quỏ trỡnh cụng nghip húa, ụ th húa lm thay i hng lot cỏc yu t mụi trng, tỏc ng trc tip hoc giỏn tip n sc kho ngi ng thi ỏp lc cuc sng v cụng vic cng gúp phn khụng nh nh hng xu ti ngi lm gia tng t l mc cỏc bnh lý nghiờm trng nh tiu ng, cỏc bnh v tim mch, ung th, ri lon gõy suy thoỏi thn kinh hay cỏc bnh v xng khp e da ti tớnh mng ngi Tuy nhiờn, vi nhng tin b mi ca y hc hin cú th giỳp chn oỏn sm v a nhiu phng phỏp iu tr hiu qu, gúp phn kộo di tui th v nõng cao cht lng sng cho bnh nhõn Trong ú, phng phỏp chn oỏn sm s dng ch th sinh hc (biomarkers) tiờn lng s h tr bỏc s a nhng phng phỏp iu tr thớch hp Genomics v proteomics l cỏc k thut c s dng ph bin chn oỏn sm Nghiờn cu v cỏc gen v protein cú chc nng liờn quan n nhng bin i trng thỏi bnh lý khỏc ang c chỳ trng u t nhiu quc gia trờn th gii Trong s cỏc protein c quan tõm, Matrix metalloproteinases (MMPs) l mt h protein endopeptidases km c iu ho cht ch, cú th bt hot cỏc protein ngoi bo ng thi tỏi to li cỏc mụ liờn kt c trng thỏi bỡnh thng nh s phỏt trin phụi, sinh sn v tỏi t hp mụ cng nh trng thỏi bnh sinh nh ung th di cn, viờm tớnh, cỏc bnh v tim mch, tn thng mụ cng nh ri lon v thn kinh (Klein and Bischoff, 2011) Do ú, MMPs c coi l ch th sinh hc chn oỏn, tiờn lng v kim tra cỏc bnh khỏc nh bnh tiu ng, bnh tim mch, ung th, ri lon gõy suy thoỏi thn kinh v nhim trựng (Galliera et al, 2014) H matrix metalloproteinases gm sỏu phõn nhúm, phõn nhúm gelatinase MMP-9 (gelatinase B) cú cỏc chc nng ch yu vic phỏ v mng li ngoi bo, cú th phỏ hu nhiu loi protein ngoi bo bao gm gelatin, collagen type IV v nhiu protein mng MMP-9 c iu ho ch yu mc phiờn mó v sau dch mó bng s kớch hot ca zymogen v s c ch ca cht c -1- ch ni sinh TIMP-1 ó cú nhiu nghiờn cu v MMP-9, c bit l tim nng lm ch th sinh hc chn oỏn sm cỏc bnh lý nh tim mch, viờm (Halade et al, 2013), lon dng c Duchene (Nadarajah et al, 2011), ung th tuyn tin lit (Gong et al, 2014) Vỡ vy, MMP-9 ngy cng c chỳ trng nghiờn cu ng dng lm nhõn t ch th cho chn oỏn trc v giai on iu tr bnh Vi mc tiờu ú, chỳng tụi tin hnh ti nghiờn cu: Nghiờn cu biu hin gen Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) ca ngi E coli nhm to c protein tỏi t hp matrix metalloproteinase-9 ca ngi phc v cho cỏc nghiờn cu to khỏng th khỏng MMP-9, h tr chn oỏn bng cỏc phng phỏp sinh hc hin i nh thm dch, hoỏ mụ dch, Western Blot -2- CHNG I: TNG QUAN TI LIU 1.1 Tng quan v Matrix metalloproteinases (MMPs) Matrix metalloproteinases (MMPs) l mt h protein endopeptidases ph thuc km, úng vai trũ quan trng nhiu quỏ trỡnh nh s to phụi, tng sinh t bo, tỏi to mụ, lm lnh vt thng, s hỡnh thnh mch, Nm 1962, MMPs ln u tiờn c phỏt hin bi Jerome Gross v Charles M Lapiere nghiờn cu s suy thoỏi ca collagen xon bc ba bin thỏi ca uụi nũng nc (Gross and Lapiere, 1962) Nm 1968, enzyme ny ln u tiờn c phõn lp t t bo da ngi dng khụng hot ng l proMMP (cũn c gi l zymogen MMP) (Eisen et al., 1968) Sau ú MMPs c tỡm thy ng vt khụng xng sng v thc vt n nm 1990 mt nhúm nghiờn cu khỏc ó phỏt hin c ch iu hũa cỏc enzyme MMPs dng khụng hot ng (Van Wart and Birkedal-Hansen, 1990) 1.1.1 Phõn loi v cu trỳc MMPs Phõn loi Phõn lp metalloproteases l mt h protein endopeptidases bao gm cỏc enzyme xỳc tỏc ph thuc vo km (William and Robert, 1998) Matrix metalloproteinase (MMPs) thuc phõn h matrixin km Metalloprotease M10 (Nagase et al., 2006; Sbardella et al., 2012), cú c s d liu trờn MEROPS (http://www.merops.sanger.ac.uk/) Sau hon thnh vic gii mó trỡnh t b gen ngi vo nm 2003 thỡ MMPs c xỏc nh gm 24 gen mó húa cho ton b MMPs ngi Thnh viờn h MMPs ging khong 40% v cu trỳc chớnh Khong hn 20 loi MMPs khỏc c phỏt hin v phõn loi da vo v trớ trờn nhim sc th v da vo cỏc loi cht nn Mc dự cỏc tờn gi t MMP-1 n MMP-28 c s dng phõn loi, nhng mt s MMP cha c xỏc nh Danh sỏch MMPs c th hin h thng Bng 1.1 (Zitka et al., 2010) -3- Vector pET32c (+) v vector pCR2.1 tỏi t hp c x lý ng thi ln lt vi hai enzyme gii hn NcoI v EcoRI to u dớnh tng hp gia on gen cn chốn v vector Sn phm phn ng ct enzyme c in di kim tra trờn gel agarose 0.8% (Hỡnh 3.9) Hỡnh 3.9 Kt qu in di kim tra on gen v vector sau x lý bng enzyme gii hn A: Kt qu in di kim tra sn phm ct bi NcoI v EcoRI M: Thang DNA chun kb (SM0333, Fermentas); C 1: Vector pET32c sau m vũng dng mch thng; C 2: Sn phm MMP9-pCR2.1 c x lý bi NcoI v EcoRI B: Kt qu in di kim tra sn phm sau thụi gel M: Thang DNA chun kb (SM0333, Fermentas); C 1: Sn phm MMP-9 sau thụi gel; C 2: Vector pET32c m vũng sau thụi gel Kt qu in di trờn Hỡnh 3.9.A cho thy ng chy s cho mt bng nht cú kớch thc khong 5.9 kb tng ng vi kớch thc ca vector pET32c (+) sau m vũng dng mch thng, ng chy s xut hin ba bng DNA vi kớch thc ln lt l 1585 bp, 2121 bp v 2345 bp tng ng vi im ct ca cỏc enzyme NcoI v EcoRI nh Hỡnh 3.10 - 45 - EcoRI (3920) EcoRI NcoI MMP-9 2121 bp EcoRI (7) MMP9-pCR2.1 NcoI (1585) Hỡnh 3.10: S enzyme gii hn NcoI v EcoRI ca vector MMP9-pCR2.1 Sau ú kit QIAGEN c s dng tỏch vector pET32c v gen ớch nh ó mụ t phn phng phỏp mc 2.2.8 kt qu th hin trờn Hỡnh 3.9.B Kt qu cho thy sn phm thụi gel cho mt bng nht m bo tinh sch cao s dng cho phn ng ni ghộp Sau lm sch v tỏch chit t gel agarose, DNA mó húa cho MMP-9 v vector pET32c (+) c ni ghộp vi nh enzyme T4 ligase, qua ờm 14oC Sn phm ghộp ni c bin np vo chng E coli DH5 chn dũng nhng vector pET32c (+) cú cha gen MMP-9 Vector tỏi t hp ny c ký hiu l pET32c-MMP9 Kim tra s cú mt ca gen mó húa cho MMP-9 vector pET32c (+) Trong quỏ trỡnh ghộp ni gen vo vector biu hin pET32c (+) cú trng hp vector pET32c (+) t úng vũng m khụng cha on gen ớch Vỡ vy, xỏc nh c dũng t bo mang plasmid tỏi t hp mong mun, cỏc dũng khun lc c tin hnh kim tra, chn lc bng phng phỏp PCR trc tip t khun lc v ct kim tra cỏc plasmid tỏi t hp bng enzyme gii hn NcoI v EcoRI Kt qu c th hin Hỡnh 3.11 - 46 - Hỡnh 3.11 Kt qu in di kim tra plasmid tỏi t hp cho biu hin MMP-9 A: Kt qu in di kim tra sn phm PCR trc tip t khun lc M: Thang DNA chun kb (SM0333, Fermentas); C 1,2,3: Sn phm PCR ba dũng khun lc chn lc; C 4: i chng dng (Sn phm PCR gen MMP-9 t cDNA) B: Kt qu in di kim tra sn phm ct bi NcoI v EcoRI M: Thang DNA kb chun (SM0333, Fermentas); C 1: i chng dng (sn phm PCR gen MMP-9 t cDNA); C 2: Plasmid dũng sau x lý bi NcoI v EcoRI Kt qu in di trờn Hỡnh 3.11.A cho thy ti ng chy s v xut hin mt bng sỏng cú kớch thc khong 2.1 kb tng ng vi bng DNA ti ng chy s (sn phm PCR gen MMP-9 t cDNA), ú ti ng chy khụng thy xut hin bng DNA Sau ú, mt dũng plasmid (dũng 2) ó c chn x lý bng hai enzyme gii hn NcoI v EcoRI kt qu th hin trờn Hỡnh 3.11.B Kt qu Hỡnh 3.11.B cho thy ti ng chy s xut hin bng DNA, bng trờn cú kớch thc khong 5.9 kb tng ng vi kớch thc ca vector pET32c (+) ó m vũng; bng di cú kớch thc khong 2.1 kb tng ng vi bng DNA ti ng chy s (sn phm PCR gen MMP-9 t cDNA) so vi thang DNA chun (M) Hai kt qu ny ó khng nh plasmid dũng t bo cha vector tỏi t hp pET32c-MMP9 Nh vy, vector tỏi t hp pET32c-MMP9 mang gen mó húa cho MMP-9 ó c thit k thnh cụng v ó chn c dũng vi khun E - 47 - coli DH Plasmid dũng c chn biu hin s c tỏch chit v tinh sch trc c s dng lm nguyờn liu cho vic biu hin t bo vi khun E coli BL21(DE3) 3.3 Biu hin gen MMP-9 vi khun E coli BL21(DE3) T bo E coli BL21(DE3) cha t hp gen pET32c-MMP9 c nuụi cy trờn mụi trng LB c Sau ú, cỏc dũng t bo c chuyn sang mụi trng LB lng cú b sung Amp+ nng cui cựng l 100 àg/ml Dch t bo sau c cy chuyn vi t l 1% v nuụi lc 37oC, 200 vũng/phỳt cho n OD600 nm t t 0.6-0.8 thỡ b sung IPTG n nng cui cựng mM cm ng Tip theo sinh t bo c thu cỏc thi im 0h (trc cm ng) v 5h (sau cm ng) Kt thỳc thớ nghim, thu dch t bo cú cha protein tỏi t hp v phỏ t bo bng siờu õm sau ú ly tõm tỏch pha in di kim tra s biu hin ca protein dung hp mi Kt qu in di protein tng s ca cỏc mu th hin Hỡnh 3.12 Hỡnh 3.12 Kt qu biu hin protein in di trờn gel polyacrylamide 12.5% Trong ú M: Thang protein chun (PI-26610, Thermo Scientific); C 3: Protein tng s ti thi im 0h (trc cm ng); C 1,2: Protein tng s cỏc dũng t bo ti thi im 5h sau cm ng bng IPTG Kt qu in di Hỡnh 3.12 cho thy ng chy s 1, protein tng s cỏc dũng t bo thu ti thi im 5h sau cm ng bng IPTG xut hin mt bng - 48 - protein m nột cú kớch thc khong 96 kDa so vi thang protein chun, nhng khụng thy xut hin bng ny mu i chng ng chy s Thc cht protein MMP-9 cú kớch thc khong 78 kDa, nhng a vo vector biu hin s to thnh t hp gen mi, ng thi mt s protein vector pET32c (+) cng c biu hin Vic ng biu hin ny to iu kin thun li cho cỏc bc tỏch chit v tinh ch protein mong mun Do ú protein mi xut hin cú kớch thc khong 96 kDa phự hp vi tớnh toỏn lý thuyt (bao gm 109 a.a ca Trx v cỏc uụi His.Tag, S.Tag) V trớ ct ca mt protease enterkinase phớa trc ca gen mó húa cho MMP-9 to iu kin thun li cho vic tinh ch Kt qu ny cho thy cú th protein MMP-9 tỏi t hp ó c biu hin E coli khng nh protein MMP-9 tỏi t hp cú c biu hin chớnh xỏc hay khụng, tin hnh kim tra protein ny bng k thut Western blot vi khỏng th khỏng MMP-9 Kt qu Western blot th hin trờn Hỡnh 3.13 Hỡnh 3.13 Kt qu kim tra protein biu hin bng phn ng Western blot vi khỏng th khỏng MMP-9 M: Thang marker protein chun (SM0671, Fermentas); C 1: Protein c biu hin Western blot l mt k thut rt nhy, cú th nhn dng protein mt hn hp sau chỳng c phõn tỏch da trờn trng lng phõn t, kớch thc v in tớch hoc im ng in nhn din protein, phn ng Western blot c - 49 - thc hin vi khỏng th th nht khỏng MMP-9 Trong phn ng ny, hn hp protein c biu hin úng vai trũ l khỏng nguyờn Vi khỏng th th hai c cng hp vi enzyme Horseradish peroxidase (HRP), cỏc protein c phỏt hin vi nng rt thp (khong 10 picogram) v mt thi gian ngn Kt qu trờn Hỡnh 3.13 cho thy protein MMP-9 tỏi t hp ( ng chy s xut hin mt bng nht cú kớch thc khong di 100 kDa) cho phn ng dng tớnh vi khỏng th khỏng MMP-9 T nhng kt qu trờn cú th a kt lun ó biu hin thnh cụng protein MMP-9 tỏi t hp dng dung hp vi thioredoxin vi khun E coli - 50 - KT LUN V KIN NGH KT LUN T nhng kt qu thu c trờn, chỳng tụi cú mt s kt lun sau: ó tỏch dũng v gii c trỡnh t gen mó húa cho MMP-9 cú di tng ng khong 2121 bp mó húa 707 a.a ó thit k c vector biu hin pET32c-MMP9 mang gen mó húa MMP-9 E coli v biu hin c protein MMP-9 tỏi t hp dng dung hp vi Trx cú kớch thc khong 96 kDa KIN NGH Tip tc nghiờn cu cỏc iu kin biu hin ti u MMP-9 E coli Tinh sch protein MMP-9 bng cỏc phng phỏp sc ký phc v cho nghiờn cu to khỏng th khỏng MMP-9 - 51 - TI LIU THAM KHO TI LIU TING VIT Hu Chớ, Lờ Th Bớch Tho, Nguyn Tin Dng, Phm c an, Bựi Th Huyn, Nguyn Th Minh Phng, Doón Li, Nguyn Bớch Nhi, Phan Vn Chi (2013) Xỏc nh a hỡnh nucleotide n vựng promoter on gen Matrix metalloproteinase-9 bnh nhõn hi chng mch vnh cp Tp Cụng ngh Sinh hc 11(2): 203-210 Lờ Th Huyn Trang, Thỏi Th Thựy Linh, Lờ Th Tuyt Lan (2012) t bin gen Matrix metalloprotease bnh nhõn phi tc nghn tớnh Tp Y hc Thnh Ph H Chớ Minh 16(1): 54-57 Nguyn Th Ngc H, T Vn T, Hũa Bỡnh, Phan Th Phi Phi (2008) Vai trũ ca Matrix metalloproteinase -9 (MMP-9) di cn ung th vũm mi hng Tp Nghiờn cu Y hc 58(5): 1-7 Nguyn Th Ngc H, T Vn T, Hũa Bỡnh, Phan Th Phi Phi (2010) Vai trũ ca Matrix metalloproteinase -9 (MMP-9) v s to mch di cn ung th vũm mi hng Tp Ung th hc Vit Nam 1:655-661 TI LIU TING ANH Bergers G, Brekken R, McMahon G, Vu TH, Itoh T, Tamaki K, Tanzawa K, Thorpe P, Itohara S, Werb Z, Hanahan D (2000) Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis Nat Cell Biol 2(10): 737744 Blankenberg S, Rupprecht HJ, Poirier O, Bickel C, Smieja M, Hafner G, Meyer J, Cambien F, Tiret L (2003) Plasma concentrations and genetic variation of matrix metalloproteinase and prognosis of patients with cardiovascular disease Circulation 107:15791585 Bond M, Chase AJ, Baker AH, Newby AC (2001) Inhibition of transcription factor NF-kappaB reduces matrix metalloproteinase-1, -3 and -9 production by vascular smooth muscle cells Cardiovasc Res 50(3): 556-565 - 52 - Demacq C, Vasconcellos VB, Marcaccini AM, Gerlach RF, Silva WA Jr, Tanus-Santos JE (2008) Functional polymorphisms in the promoter of the matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) gene are not linked with significant plasma MMP-9 variations in healthy subjects Clin Chem Lab Med 46(1): 5763 Dufour A, Sampson NS, Li J, Kuscu C, Rizzo RC, Deleon JL, Zhi J, Jaber N, Liu E, Zucker S, Cao J (2011) Small-molecule anticancer compounds selectively target the hemopexin domain of matrix metalloproteinase-9 Cancer Res 71: 49774988 10 Eisen AZ, Jeffrey JJ, Gross J (1968) Human skin collagenase Isolation and mechanism of attack on the collagen molecule Biochim Biophys Acta 151(3): 637645 11 Engsig MT, Chen QJ, Vu TH, Pedersen AC, Therkidsen B, Lund LR, Henriksen K, Lenhard T, Foged NT, Werb Z, Delaissộ JM (2000) Matrix metalloproteinase and vascular endothelial growth factor are essential for osteoclast recruitment into developing long bones J Cell Biol 151(4): 879-889 12 Fallah S, Seifi M, Ghasemi A, Firoozrai M, Samadikuchaksaraei A (2010) Matrix metalloproteinase-9 and paraoxonase Q/R192 gene polymorphisms and the risk of coronary artery stenosis in Iranian subjects J Clin lab Anal 24: 305-310 13 Farina AR, Mackay AR (2014) Gelatinase B/MMP-9 in Tumour Pathogenesis and Progression Cancers (Basel) 6(1): 240-96 14 Fertin M, Dubois E, Belliard A, Amouyel P, Pinet F, Bauters C (2012) Usefulness of circulating biomarkers for the prediction of left ventricular remodeling after myocardial infarction Am J Cardiol 110(2): 277-283 15 Folgueras AR, Pendỏs AM, Sỏnchez LM, Lúpez-Otin C (2004) Matrixmetalloproteinases in cancer: from new functions to improved inhibition strategies Int J Dev Biol 48(5-6): 411-424 - 53 - 16 Galliera E, Tacchini L, Corsi Romanelli MM (2014) Matrix metalloproteinases as biomarkers of disease: updates and new insights Clin Chem Lab Med 17 Gong Y, Chippada-Venkata UD, Oh WK (2014) Roles of matrix metalloproteinases and their natural inhibitors in prostate cancer progression Cancers (Basel) 6(3): 1298-1327 18 Grimm T, Chovanovỏ Z, Muchovỏ J, Sumegovỏ K, Liptỏkovỏ A, Durackovỏ Z, Hửgger P (2006) Inhibition of NF-kappaB activation and MMP-9 secretion by plasma of human volunteers after ingestion of maritime pine bark extract (Pycnogenol) J Inflamm (Lond) 3: 19 Gross J, Lapiere CM (1962) Collagenolytic activity in amphibian tissues: a tissue culture assay Proc Natl Acad Sci U S A 48: 1014-1022 20 Halade GV, Jin YF and Lindsey ML (2013) Matrix metalloproteinase (MMP)9: a proximal biomarker for cardiac remodeling and a distal biomarker for inflammation Pharmacol Ther 139(1): 32-40 21 http://www.uniprot.org/uniprot/P14780 22 Jones GT (2014) Matrix metalloproteinases in biologic samples Adv Clin Chem 65: 199-219 23 Khan MM, Simizu S, Suzuki T, Masuda A, Kawatani M, Muroi M, Dohmae N, Osada H (2012) Protein disulphide isomerase-mediated disulphide binds regulate gelatinolytic activity and secretion of matrix metalloproteinase-9 Exp Cell Res, 318(8): 904911 24 Klein T, Bischoff R (2011) Physiology and pathophysiology of matrix metalloproteases Amino Acids 41(2):271-290 25 Kobayashi N, Hata N, Kume N, Yokoyama S, Shinada T, Tomita K, Kitamura M, Shirakabe A, Inami T, Yamamoto M, Seino Y, Mizuno K (2011) Matrix metalloproteinase-9 for the earliest stage acute coronary syndrome Circ J 75(12): 2853-2861 26 Nadarajah VD, van Putten M, Chaouch A, Garrood P, Straub V, Lochmỹller H, Ginjaar HB, Aartsma-Rus AM, van Ommen GJ, den Dunnen JT, 't Hoen PA - 54 - (2011) Serum matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) as a biomarker for monitoring disease progression in Duchenne muscular dystrophy (DMD) Neuromuscul Disord 21(8):569-578 27 Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227(5259): 680-685 28 Li H, Zhang K, Liu LH, Ouyang Y, Bu J, Guo HB, Xiao T (2014) A systematic review of matrix metalloproteinase as a biomarker of survival in patients with osteosarcoma Tumour Biol 35(6): 5487-5491 29 Liu G, Zhang X, Lin H, Wang H, Li Q, Ni J, Zhu C (2006) Effects of Ecadherin on mouse embryo implantation and expression of matrix metalloproteinase -2 and -9 Biochem Biophys Res Commun 343(3): 832-838 30 Lyons JG, Birkedal-Hansen B, Moore WG, O'Grady RL, Birkedal-Hansen H (1991) Characteristics of a 95-kDa matrix metalloproteinase produced by mammary carcinoma cells Biochemistry 30(6): 1449-1456 31 Nagase H, Visse R, Murphy G (2006) Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs Cardiovasc Res 69(3): 562-573 32 Nanda DP, Dutta K, Ganguly KK, Hajra S, Mandal SS, Biswas J, Sinha D (2014) MMP-9 as apotential biomarker for carcinoma of oral cavity: a study in eastern India Neoplasma 61(6):747-757 33 Ndinguri MW, Bhowmick M, Tokmina-Roszyk D, Robichaud TK, Fields GB (2012) Peptide-based selective inhibitors of matrix metalloproteinase-mediated activities Molecules 17(12):14230-14248 34 Newby AC (2005) Dual role of matrix metalloproteinases (matrixins) in intimal thickening and atherosclerotic plaque rupture Physiol Rev 85: 1-31 35 Ma HP, Li W, Liu XM (2014) Matrix metalloproteinase is involved in airway inflammation in cough variant asthma Exp Ther Med 8(4): 1197-1200 36 Maeda S, Haneda M, Guo B, Koya D, Hayashi K, Sugimoto T, Isshiki K, Yasuda H, Kashiwagi A, Kikkawa R (2001) Dinucleotide repeat polymorphism of matrix metalloproteinase-9 gene is associated with diabetic nephropathy - 55 - Kidney Int 60: 14281434 37 Mahmud A, Zhou S, Ryan AW, Jerrard-Dunne P, Feely J (2009) A haplotype at the MMP-9 locus is associated with high-blood pressure and arterial stiffness in patients with essential hypertension Artery Res 3: 1723 38 Mainardi CL, Dixit SN, Kang AH (1980) Degradation of type IV (basement membrane) collagen by a proteinase isolated from human polymorphonuclear leukocyte granules J Biol Chem 255(11): 5435-5441 39 Massova I, Kotra LP, Fridman R, Mobashery S (1998) Matrix metalloproteinases: structures, evolution, and diversification FASEBJ 12(12): 1075-1095 40 Mizon-Gộrard F, de Groote P, Lamblin N, Hermant X, Dallongeville J, Amouyel P, Bauters C, Helbecque N (2004) Prognostic impact of matrix metalloproteinase gene polymorphisms in patients with heart failure according to the aetiology of left ventricular systolic dysfunction Eur Heart J 25: 688693 41 Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51(1): 263-273 42 Murphy G, Cawston TE, Galloway WA, Barnes MJ, Bunning RA, Mercer E, Reynolds JJ, Burgeson RE (1981) Metalloproteinases from rabbit bone culture medium degrade types IV and V collagens, laminin and fibronectin Biochem J 199( 3): 807-811 43 Murphy G, Reynolds JJ, Bretz U, Baggiolini M (1982) Partial purification of collagenase and gelatinase from human polymorphonuclear leucocytes Analysis of their actions on soluble and insoluble collagens Biochem J 203(1): 209-210 44 Murphy G, Ward R, Hembry RM, Reynolds JJ, Kuhn K, Tryggvason K (1989) Characterization ofgelatinase from pig polymorphonuclear leucocytes A metalloproteinase resembling tumour type IV collagenase Biochem J 258(2): 463- 56 - 472 45 OFarrell TJ, Guo R, Hasegawa H, Pourmotabbed T (2006) Matrix metalloproteinase-1 takes advantage of the induced fit mechanism to cleave the triple-helical type I collagen molecule Biochemistry 45: 1541115418 46 OFarrell TJ, Pourmotabbed T (2000) Identification of structural elements important for matrix metalloproteinase type V collagenolytic activity as revealed by chimeric enzymes Role of fibronectin-like domain and active site of gelatinase B J Biol Chem 275: 2796427972 47 Ogura Y, Tajrishi MM, Sato S, Hindi SM, Kumar A (2014) Therapeutic potential of matrix metalloproteinases in Duchenne muscular dystrophy Front Cell Dev Biol 2: 11 48 Opstad TB, Pettersen AA, Weiss TW, Akra S, ỉvstebứ R, Arnesen H, Seljeflot I (2012) Genetic variation, gene-expression and circulating levels of matrix metalloproteinase-9 in patients with stable coronary artery disease ClinicaChimicaActa 413: 113120 49 Page-McCaw A, Ewald AJ and Werb Z (2007) Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling Nat Rev Mol Cell Biol 8(3): 221-233 50 Peters DG, Kassam A, St Jean PL, Yonas H, Ferrell RE (1999) Functional polymorphism in the matrix metalloproteinase-9 promoter as a potential risk factor for intracranial aneurysm Stroke 30: 26122616 51 Provot S, Schipani E (2005) Molecular mechanisms of endochondral bone development Biochem Biophys Res Commun 328(3): 658-665 52 Sambrook J, Russel WD (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 53 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A 74(12): 5463-5467 54 Sbardella D, Fasciglione GF, Gioia M, Ciaccio C, Tundo GR, Marini S, Coletta M (2012) Human matrix metalloproteinases: an ubiquitarian class of enzymes involved in several pathological processes Mol Aspects Med 33(2): 119-208 - 57 - 55 Sopata I, Dancewicz AM (1974) Presence of a gelatin-specific proteinase and its latent form in human leucocytes Biochim Biophys Acta 370: 510-523 56 Squire IB, Evans J, Ng LL, Loftus IM, Thompson MM (2004) Plasma MMP-9 and MMP-2 following acute myocardial infraction in man: correlation with echocardiographic and neurohumoral parameters of left ventricular dysfunction J Card Fail 10: 328-333 57 Van den Steen PE, Dubois B, Nelissen I, Rudd PM, Dwek RA, Opdenakker G (2002) Biochemistry and Molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B/MMP-9) Crit Rev Biochem Mol Biol 37: 375 536 58 Van den Steen PE, Van Aelst I, Hvidberg V, Piccard H, Fiten P, Jacobsen C, Moestrup SK, Fry S, Royle L, Wormald MR, Wallis R, Rudd PM, Dwek RA, Opdenakker G (2006) The hemopexin and O-glycosylated domains tune gelatinase B/MMP-9 bioavailability via inhibition of binding to cargo receptors J Biol Chem 281: 1862618637 59 Vandooren J, van den Steen PE, Opdenakker G (2013) Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B/MMP-9): The next decade Crit Rev Biochem Mol Biol 48: 222272 60 Van Wart HE, Birkedal-Hansen H (1990) The cysteine switch: a principle of regulation of metalloproteinase activity with potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene family Proc Natl Acad Sci U S A 87(14): 55785582 61 Vilen ST, Nyberg P, Hukkanen M, Sutinen M, Ylipalosaari M, Bjartell A, Paju A, Haaparanta V, Stenman UH, Sorsa T, Salo T (2008) Intracellular colocalization of trypsin-2 and matrix metalloprotease-9: possible proteolytic cascade of trypsin-2, MMP-9 and enterokinase in carcinoma Exp Cell Res 314(4): 914-926 62 Vilen ST, Salo T, Sorsa T, Nyberg P (2013) Fluctuating roles of matrix metalloproteinase-9 in oral squamous cell carcinoma ScientificWorldJournal - 58 - 2013: 920595 63 Vu TH, Shipley JM, Bergers G, Berger JE, Helms JA, Hanahan D, Shapiro SD, Senior RM, Werb Z (1998) MMP-9/gelatinase B is a key regulator of growth plate angiogenesis and apoptosis of hypertrophic chondrocytes Cell 93(3): 411422 64 William CP, Robert PM (1998), Matrix metalloproteinase, Academic press, California 65 Yabluchanskiy A, Ma Y, Iyer RP, Hall ME, Lindsey ML (2013) Matrix metalloproteinase-9: Many shades of function in cardiovascular disease Physiology (Bethesda) 28(6): 391-403 66 Yoshii N, Hamatani T, Inagaki N, Hosaka T, Inoue O, Yamada M, Machiya R, Yoshimura Y, Odawara Y (2013) Successful implantation after reducing matrix metalloproteinase activity in the uterine cavity Reprod Biol Endocrinol 11: 37 67 Zitka O, Kukacka J, Krizkova S, Huska D, Adam V, Masarik M, Prusa R, Kizek R (2010) Matrix metalloproteinases Current Medicinal Chemistry 17: 3751-3768 68 Zhang B, Henney A, Eriksson P, Hamsten A, Watkins H, Ye S (1999) Genetic variation at the matrix metalloproteinase-9 locus on chromosome 20q12.213.1 Hum Genet 105: 418-423 69 Zhi H, Wang H, Ren L, Shi Z, Peng H, Cui L, Ma G, Ye X, Feng Y, Shen C, Zhai X, Zhang C, Zen K, Liu N (2010) Functional polymorphisms of matrix metallopeptidase-9 and risk of coronary artery disease in a Chinese population MolBiol Rep 37:1320 70 Wang X, Shi LZ (2014) Association of matrix metalloproteinase-9 C1562T polymorphism and coronary artery disease: a meta-analysis J Zhejiang Univ Sci B 15(3): 256-263 71 Wilhelm SM, Collier IE, Marmer BL, Eisen AZ, Grant GA, Goldberg GI (1989) SV40-transformed human lung fibroblasts secrete a 92-kDa type IV collagenase which is identical to that secreted by normal human macrophages J Biol Chem 264(29): 17213-17221 - 59 - [...]... chủng E coli BL21(DE3) của hãng Novagen (Merck Millipore, Đức) được sử dụng để biểu hiện protein MMP-9  Các vector: Vector tách dòng pCR 2.1 (3930 bp) của hãng Invitrogen (CA, Mỹ) được sử dụng để tách dòng và vector biểu hiện pET32c (+) (5901 bp) của hãng Novagen (Merck Millipore, Đức)  Các cặp mồi Cặp mồi F1/R1 được đặt tổng hợp từ hãng Alphal (Canada) dùng để nhân gen, chọn dòng và biểu hiện gen Trình... nghiên cứu MMP-9 ở Việt Nam Ở Việt Nam hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu về MMP-9 như: vai trò của MMP-9 trong di căn ung thư vòm mũi họng (UTVMH) Kết quả trong 33 mẫu sinh thiết bệnh nhân UTVMH có 93.94% trường hợp có biểu hiện MMP-9, - 20 - trong đó 39.4% biểu lộ MMP-9 ở mức độ mạnh, chưa tìm thấy mối liên quan giữa sự biểu lộ MMP-9 tại mô sinh thiết với phân loại T và giai đoạn lâm sàng của. .. đa hình đơn ở vị trí -1562C/T trong vùng promoter của gen MMP9 ở 3 bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định và 7 bệnh nhân nhồi máu cơ tim (Đỗ Hữu Chí và cs, 2013) Những nghiên cứu trên chỉ đánh giá vai trò và tác động của MMP-9 trong một số tình trạng bệnh lý, cũng như một số đột biến trên gen chưa khai thác được tiềm năng ứng dụng của gen MMP-9 Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này với mục... hai lần của promoter và sự xuất hiện của allele T có xu hướng gây bệnh mạch vành cao hơn (Zhang et al., 1999; Opstad et al., 2012) Nghiên cứu của Mizon-Gérard và cộng sự (2004) đã phát hiện bệnh nhân có tỷ lệ tử vong vì bệnh tim mang alen -1562T cao hơn ở người không có alen này (Mizon-Gérard et al., 2004) Đặc biệt, đa hình -1562C/T làm tăng sự biểu hiện gen MMP-9 đi kèm với mức độ nghiêm trọng của xơ... MMP-9 của người phục vụ cho các nghiên cứu tạo kháng thể kháng MMP-9 nhằm hỗ trợ chẩn đoán - 21 - CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc 2.1.1 Vật liệu  Nguyên liệu: Mẫu máu toàn phần của người bình thường do Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai cung cấp  Chủng vi sinh vật: Chủng E coli DH5α của hãng Invitrogen (CA, Mỹ) được sử dụng để tách dòng gen mã... trò của MMP-9 và sự tạo mạch trong di căn ung thư vòm mũi họng (Nguyễn Thị Ngọc Hà và cs., 2010) và nghiên cứu đột biến gen MMP-9 ở bệnh nhân phổi tắc nghẽn mãn tính đã xác định đột biến ở promoter -1562C/T của gen MMP-9 ở bệnh nhân phổi tắc nghẽn mãn tính (PTNMT) trên 100 bệnh nhân Kết quả tỷ lệ bệnh nhân PTNMT có allen (C/T hay T/T) là 23%, bệnh nhân có kiểu gen C/C là 77% Tỷ lệ đột biến gen MMP-9 ở. .. phục của tâm thất trái sau nhồi máu cơ tim (Fertin et al., 2012) Đáng chú ý, một số đa hình trong gen đã được chứng minh có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện MMP-9 Sự thay đổi mức độ biểu hiện protein MMPs có liên quan đến sự biến đổi về mặt di truyền Sự biến đổi trong gen MMP-9 có thể dẫn đến sự thay đổi kiểu hình của protein và gây ra những nguy cơ của bệnh mạch vành (Bảng 1.3) Bảng 1.3 Đa hình gen. .. có biểu hiện MMP-9 thấp hoặc không biểu hiện Từ kết quả trên cho thấy MMP-9 là một chỉ thị sinh học hiệu quả để dự đoán tỷ lệ sống sót của bệnh nhân mắc u xương ác tính (Li et al., 2014) Các nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng chỉ thị sinh học của MMP-9 trong rất nhiều bệnh lý khác nhau Nghiên cứu về MMP-9 không chỉ ứng dụng cho các bệnh liên quan đến tim mạch mà còn các bệnh lý khác 1.4 Tình hình nghiên. .. 77% Tỷ lệ đột biến gen MMP-9 ở bệnh nhân PTNMT ở Việt Nam cũng tương tự với một số nghiên cứu của Nhật Bản và Trung Quốc (Lê Thị Huyền Trang và cs., 2012) Tại Viện Công nghệ Sinh học cũng đã thực hiện nghiên cứu xác định đa hình nucleotide đơn trong vùng promoter đoạn gen MMP-9 ở bệnh nhân hội chứng mạch vành cấp trên 41 cá thể người Việt Nam bao gồm 9 mẫu người bình thường, 14 mẫu bệnh nhân đau thắt... collagen (type IV và V) của protease này được nhận biết từ môi trường nuôi cấy xương thỏ (Murphy et al., 1981) và bạch cầu trung tính của người (Murphy et al., 1982), protease này được xác định thuộc họ MMPs có kích thước khoảng 90-110 kDa Các hoạt tính tượng tự của phân tử protease có kích thước 82-97 kDa cũng được phát hiện ở bạch cầu trung tính của lợn (Murphy et al., 1989) Hàng loạt các nghiên cứu ... nghiên cứu ứng dụng làm nhân tố thị cho chẩn đoán trước giai đoạn điều trị bệnh Với mục tiêu đó, tiến hành đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu biểu gen Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) ngƣời E coli ... hưởng tới hoạt tính xúc tác MMP-9 3.2 Thiết kế vector biểu gen mã hóa cho MMP-9 Trong nghiên cứu này, vector pET32c (+) hãng Novagen lựa chọn cho biểu protein có nhiều đặc tính ưu việt Khi gen. .. Các nghiên cứu cho thấy tiềm thị sinh học MMP-9 nhiều bệnh lý khác Nghiên cứu MMP-9 không ứng dụng cho bệnh liên quan đến tim mạch mà bệnh lý khác 1.4 Tình hình nghiên cứu MMP-9 Việt Nam Ở Việt