vi sinh vat

CHỌN LỌC DÒNG ACETOBACTER XYLINUM THÍCH HỢP CHO CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG DÙNG TRONG SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN VỚI QUY MÔ LỚN Nguyễn Thúy Hương Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa tp.HCM Phạm Thành Hổ Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên tp.HCM MỞ ĐẦU. Thạch dừa (Nata-deCoco) được sản xuất từ nguồn nước dừa già là loại thực phẩm phổ biến trên thị trường Việt Nam hiện nay. Thạch dừa thực chất là sinh khối của tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum , mà thành phần chủ yếu là cellulose . Loại cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose – BC) này, ngoài giá trị thực phẩm như thạch dừa , các nhà khoa học trên thế giới đã tìm ra hàng loạt những ứng dụng mới, độc đáo trong nhiều lãnh vực khác nhau : thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường , v v [ 1 ,6] . Sự phát triển các ứng dụng này đòi hỏi sản xuất BC phải đạt quy mô công nghiệp với nhiều yêu cầu : - Đa dạng hoá nguồn nguyên liệu ban đầu ( không chỉ là nước dừa già , mà số lượng rất hạn chế ). - Các chủng giống mới phù hợp hơn với yêu cầu kỹ thuật như tế bào dài để BC có độ bền chắc hơn, đặc biệt là phát triển nhanh trong các loại môi trường khác nhau. - Sàng lọc các chủng giống thích hợp với điều kiện lên men chìm. Nghiên cứu này nhằm sàng lọc một số dòng A.xylinum phát triển tốt trên 2 loại môi trường mật rỉ đường và nước mía. Các kết quả đạt được trên 2 loại môi trường này hứa hẹn sử dụng tốt trong sản xuất BC với quy mô công nghiệp. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. Bảng 1. Thành phần môi trường nghiên cứu dùng để sàng lọc giống. - Các dòng vi khuẩn Acetobacter được phân lập từ các nguồn : 11 nguồn sản xuất Nata- deCoco ở Thái Lan; 4 nguồn sản xuất Nata-deCoco ở Philippines ; 2 chủng giống có nguồn gốc từ Viện Công nghệ châu á (AIT); 3 chủng giống có nguồn gốc từ viện Công nghệ Thực phẩm và môi trường (IEF) Philippines; ngoài ra còn từ các nguồn nguyên liệu giấm, bia, nước quả và Nata-deCoco ở trong nước. - Phân lập nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thạch đĩa. - Môi trường dinh dưỡng : gồm các môi trường phân lập, sàng lọc và môi trường sản xuất BC được trình bày qua bảng 1. . Môi trường đối chứng : Môi trường truyền thống nước dừa già [Saccharose:10-20 g; (NH 4 ) 2 S0 4 :8 g ;(NH 4 ) 2 HPO 4 : 2g ; Acid acetic: 5 ml; Nước dừa già: 1000 ml.] -(MT5) - Sàng lọc giống thông qua các chỉ tiêu: + Kích thước và hình dạng tế bào (µm). + Mật độ tế bào ( 106 tế bào / ml). + Trọng lượng BC (g / l). + Độ chịu lực của màng BC (N / m 2 ). - Kết quả thí nghiệm là trung bình của 3 lần lập lại. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 1. Phân lập và tuyển chọn. Từ các nguồn phân lập thu thập trong và ngoài nước, chúng tôi tiến hành phân lập trên môi trường 1 (MT1) và môi trường 3 (MT3) và thu được tổng cộng 59 dòng vi khuẩn có các đặc điểm sau : - Quan sát đại thể : các dòng đều có hình dạng tròn, nhầy, trơn bóng trắng trong hoặc trắng sữa, rìa mép khuẩn lạc nhẵn, sau 4 ngày nuôi cấy đường kính đạt 2-5 mm. - Quan sát vi thể : vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi. - Đặc điểm sinh hóa : được kiểm tra thông qua 7 đặc điểm sinh hóa phân loại Acetobacter. Trong 59 dòng vi khuẩn phân lập trên đây, sau khi thử khả năng oxy hóa, chúng tôi khẳng định đây là những giống Acetobacter, trong đó có 30 dòng được xác định là Acetobacter nhưng không tổng hợp cellulose nên không đề cập đến, còn lại 29 dòng có kết quả sinh hóa như sau : Bảng 2. Đặc điểm sinh hóa của 29 dòng vi khuẩn phân lập. Kết hợp quan sát đại thể , vi thể và sinh hóa cho kết luận : Từ các nguồn phân lập, chúng tôi thu được 29 dòng vi khuẩn Acetobacter có khả năng sản sinh cellulose. Kết quả phân loại 29 dòng này đều thuộc loài Acetobacter xylinum. Bảng 3. Ký hiệu các dòng A.xylinum được phân lập và sơ tuyển. 2. Mật độ tế bào của 29 dòng A.xylinum. Sau 6 ngày nuôi cấy trên 2 môi trường nhân giống, mật độ tế bào của các dòng A.xylinum khảo sát thu được thể hiện ở bảng 4. Bảng 4. Mật độ tế bào ( 10 6 tế bào / ml) Mật độ tế bào vi khuẩn tỷ lệ với lượng cellulose sinh ra theo thời gian nuôi cấy [ 3,4 ]. Vì vậy, tiêu chuẩn để tuyển chọn dòng vi khuẩn thích hợp trên các môi trường khác nhau thông qua 2 chỉ tiêu chính là mật độ tế bào và lượng BC sinh ra. Giữa 2 môi trường rỉ đường và môi trường nước mía, có những dòng phát triển nhanh và phù hợp hơn ở từng loại môi trường. Những dòng được sơ tuyển trên đây đều có mật độ tế bào dao động trong khoảng từ 32,11. 106 đến 48,15.10 6 tế bào / ml. Kết quả bảng 4 chỉ ra rằng, trên môi trường rỉ đường (MT1) có 6 dòng phát triển nhanh : T.8, P.16, P.17, P.18, V.25 và V.28. Trên môi trường nước mía (MT3) có 7 dòng phát triển nhanh , ngoài 6 dòng kể trên còn có dòng T.7. 3. Khảo sát trọng lượng BC khô của các dòng A.xylinum sàng lọc từ môi trường rỉ đường. Sản phẩm BC của A.xylinum bằng các kiểu lên men bề mặt hay lên men chìm là khác nhau [ 2 ] và có các ứng dụng hoàn toàn khác nhau [ 6 ]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát trọng lượng BC thu được từ các dòng A.xylinum theo 3 kiểu lên men : lên men bề mặt, lắc và sục khí. Kết quả thu được sau 6 ngày nuôi cấy như sau : Bảng 5. Trọng lượng BC khô thu được từ các kiểu lên men khác nhau trên môi trường rỉ đường ( g / l). Qua thử nghiệm sản xuất BC từ nguồn nguyên liệu rỉ đường, kết quả cho thấy cả 6 dòng vi khuẩn khảo sát đều phù hợp lên men bề mặt. Trọng lượng BC khô thu được thay đổi từ 6,55 đến 7,11 g/l. Khảo sát bằng nuôi cấy chìm cho thấy : với kiểu nuôi cấy lắc có 2 dòng P.16 và P.17 cho lượng BC khô là 3,86 g/l và 4,58 g/l. Với kiểu nuôi cấy sục khí cũng chỉ có 2 dòng này với lượng BC tương ứng là 3,50 g/l và 5,42 g/l . Như vậy, xét chung lại dòng P.16 là dòng phát triển nhanh cho lượng BC cao trong cả 2 kiểu lên men bề mặt và lên men chìm. 4. Khảo sát trọng lượng BC khô của các dòng A.xylinum sàng lọc trên môi trường nước mía. Tương tự như ở mục 3, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát trên môi trường nước mía. Kết quả thu được sau 6 ngày nuôi cấy thể hiện qua bảng 6. Bảng 6. Trọng lượng BC khô thu được từ các kiểu lên men khác nhau trên môi trường nước mía ( g / l). Khảo sát trọng lượng BC khô trên môi trường nước mía , cả 7 dòng đều phát triển tốt cho lượng BC cao khi lên men bề mặt (từ 7,00 đến 7,82 g/l). Khảo sát 2 kiểu lên men chìm là lắc và sục khí, chỉ sàng lọc được một dòng duy nhất là P.17 cho lượng BC là 4,05 g/l và 4,64 g/l. 5. Khảo sát trọng lượng BC khô của các dòng Acetobacter xylinum trên môi trường đối chứng – môi trường truyền thống nước dừa già. Kết quả mục 2 khảo sát mật độ tế bào của 29 dòng A.xylinum sàng lọc được 7 dòng phát triển nhanh . Đưa 7 dòng phát triển nhanh này vào môi trường đối chứng – môi trường nước dừa già kết quả thu được như sau: Trên môi trường truyền thống cả 7 dòng vi khuẩn đều phát triển nhanh , cho lượng BC từ 7,05 đến 7,28 g/l (lên men bề mặt). Với kiểu lên men chìm sàng lọc được 2 dòng là P.16 và V.28 cho lượng BC là 4,51 g/l và 4,60 g/l. Bảng 6. Trọng lượng BC khô thu được từ các kiểu lên men khác nhau trên môi trường nước dừa ( g/l) 6. Mối liên hệ giữa hình dáng kích thước tế bào vi khuẩn và độ chịu lực màng BC. Vi khuẩn A.xylinum có sự thay đổi hình dạng và kích thước tuỳ theo giống. Màng BC thực chất là sinh khối của tế bào vi khuẩn A.xylinum, mà thành phần chủ yếu là cellulose. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát mối liên hệ giữa các dòng và độ chịu lực của màng BC , một trong những chỉ tiêu chất lượng quan trọng của màng BC khi đưa ra ứng dụng. Khảo sát trên 3 dòng thu được từ kết quả bảng 5 và 6 trên đây (dòng P.16, P.17 và V.25) và một dòng A.xylinum có hình dạng tròn dài trong bộ lưu trữ giống có ký hiệu P.S.14 (đối chứng). Bảng 8. Mối liên hệ giữa hình dáng kích thước tế bào vi khuẩn và độ chịu lực màng BC. Màng BC sử dụng trong các ứng dụng làm màng trị phỏng, màng lọc, giấy , vải đòi hỏi chịu lực cao. Dòng P.16 và P.17 đều là những dòng có tế bào dài, cho độ chịu lực của màng BC tương ứng là 86.106 và 91.106 N/m 2 . Riêng đối với dòng V.25 có tế bào dạng tròn dài và dòng A.xylinum đối chứng dạng tròn dài trong bộ sưu tập đều có độ chịu lực thấp hơn cách biệt (68.10 5 và 56.105 N/m 2 ) . Những giống có tế bào dài cho khả năng giữ nước tốt hơn, có độ dai chắc hơn. KẾT LUẬN. - Bacterial cellulose có thể sản xuất từ nguồn nguyên liệu rỉ đường và nước mía, nguồn nguyên liệu khá dồi dào và rẻ tiền, có thể tiến hành sản xuất BC ở quy m ô công nghiệp : + Với nguyên liệu là rỉ đường, chúng tôi sàng lọc được dòng P.16 thích hợp cho cả 2 kiểu lên men bề mặt và lên men chìm : trọng lượng BC khô đạt 7,11 g/l (lên men bề mặt) và 5,42 g/l (lên men chìm). + Với nguyên liệu là nước mía, chọn lọc dòng P.17 thích hợp cho cả 2 kiểu lên men BC bề mặt và lên men chìm : trọng lượng BC khô đạt 7,15 g/l (lên men bề mặt) và 4,64 g/l (lên men chìm). + So với đối chứng là nguyên liệu truyền thống nước dừa già đạt cao nhất là 7,28 g/l (lên men bề mặt) và 4,60 g/l (lên men chìm ), thì sự khác biệt không đáng kể trong cùng thời gian lên men ( 6 ngày). - Chọn lọc các dòng Acetobacter xylinum tế bào dài có kích thước là ( 0,3-0,5) x 3 mð m : dòng P.16 và P.17. - Màng BC theo kiểu lên men bề mặt có độ chịu lực cao (86.106 - 91.106 N/m 2 ), phù hợp với yêu cầu ứng dụng về màng. TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. Nguyễn Thúy Hương.1998. Chọn dòng Acetobacter xylinum phát triển nhanh và một số biện pháp cải thiện sản xuất cellulose vi khuẩn. Luận văn Thạc sĩ, Đại học Khoa học Tự nhi ên tp.HCM. 2. Hùynh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh. 2001. Nghiên cứu tạo màng sinh học trị phỏng từ Acetobacter xylinum.Y Học Thực Hành,Số 4. 3. Kouda T., Yano H., Yoshinaga. 1997. Effects of agitator configuration on bacterial cellulose productivity in aereated and agitated culture . J. Ferment. Bioeng. 83, 371-376. 4. Millman B., Covin J. R. 1996. The formation of cellulose microfibrils by A.xylinum in agar surface. Canadian Journal of microb. 7, 383-387. 5. Toyosaki H., Naritomi T., Seto A. 1995. Screening of bacterial cellulose - producing Acetobacter strains suitable for agitated culture . Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1498-1502. 6. Yoshinaga F., Tonouchi N. 1997. Research progress in production of bacterial cellulose by aeration and agitation culture and its application as new inductrial materials. Biosci. Biotech. Biochem. 61, 219-224. 7. Yamanaka S. 1989. Production an application of bacterial cellulose. In . H. Inagaki and G. O. Phillips (eds) Cellulosic utilization: Research and rewards in cellulose . Elsevier /North-Holland Pub. Co. Amsterdam. 171-185. . 29 dòng có kết quả sinh hóa như sau : Bảng 2. Đặc điểm sinh hóa của 29 dòng vi khuẩn phân lập. Kết hợp quan sát đại thể , vi thể và sinh hóa cho kết luận. sát vi thể : vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi. - Đặc điểm sinh hóa : được kiểm tra thông qua 7 đặc điểm sinh