Xây dựng quy trình xác định một số tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược (FULL TEXT)

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ chức Y tế Thế giới có đến 80% người dân ở các nước đang phát triển sử dụng thường xuyên các thuốc thảo dược trong chăm sóc sức khỏe [69]. Ưu điểm của các chế phẩm này là hầu hết các vị thuốc trong y học cổ truyền đã được sử dụng lâu đời, không gây độc hại cho cơ thể và không xuất hiện hiện tượng kháng thuốc; không chỉ chữa bệnh mà còn giúp cân bằng âm dương, thay đổi cơ địa. Do vậy, doanh thu từ các chế phẩm đông dược ở Châu Âu lên đến hơn 3,7 tỷ Euro hàng năm [69]. Nhằm hấp dẫn khách hàng và gia tăng lợi nhuận, một số nhà sản xuất và cơ sở khám chữa bệnh tư nhân đã trộn trái phép một số hoạt chất tân dược có tác dụng tương đồng với chỉ định vào từng loại chế phẩm đông dược [67], [117], [121], [132]. Điển hình các nhóm thuốc tân dược thường được trộn trái phép là nhóm thuốc giảm glucose máu, thuốc chống viêm nhóm glucocorticoid, thuốc giảm đau, chống viêm không steroid, thuốc hạ huyết áp, thuốc giảm béo, thuốc ức chế phosphodiesterase-5 [132], [121] … chiếm tỷ lệ cao nhất là nhóm thuốc giảm đau chống viêm [60], [65]. Các trường hợp phát hiện tập trung phần lớn ở Trung Quốc [55], [98], Singapore [73], [75], Ấn Độ [67], [122]… Khi người bệnh sử dụng chế phẩm đông dược có trộn lẫn tân dược nhóm giảm đau chống viêm, sẽ bị xuất huyết dạ dày, hội chứng cushing …[4], [67], [119]; với nhóm giảm glucose máu, sẽ bị nhiễm toan lactic, tổn thương gan thận…. với nhóm ức chế PDE-5, sẽ bị đột ngột mất thị lực nghiêm trọng, mất thính giác, khó thở, dương vật cương cứng, đau đớn kéo dài hơn 4 giờ [129], [117], [121], [132]. Việc trộn hoạt chất tân dược vào chế phẩm đông dược là bất hợp pháp, gian lận thương mại, ngụy tạo tác dụng của chế phẩm đông dược nhằm tạo ra tác dụng nhanh và rõ rệt. Hậu quả là gây ra nhiều trường hợp biến chứng nghiêm trọng do không kiểm soát được liều lượng và thời gian tác dụng thuốc. Do đó, yêu cầu phát hiện tân dược trong chế phẩm đông dược hiện nay là phát hiện nhanh ở hàm lượng tân dược thấp và áp dụng được trên số lượng mẫu lớn và đa dạng, tích cực phát huy các hệ thống máy hiện đại như LC-MS hay quang phổ Raman [81], [58]. Đặc biệt, sự kết hợp sắc ký lớp mỏng với tán xạ Raman tăng cường bề mặt (TLC-SERS) đang được phát triển mạnh mẽ để phát hiện tân dược trong đông dược nhằm tận dụng các ưu điểm sàng lọc mẫu, loại nhiễu nền huỳnh quang của bản mỏng và sự nhanh chóng, chính xác của thiết bị quang phổ Raman hiện đại [151], [63], [101]. Hiện nay, việc phát hiện các tân dược trộn trái phép vào các sản phẩm đông dược tại Việt Nam chủ yếu tập trung vào phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [20], [26], [10], [13], [22], [33], [35]; chỉ một số nghiên cứu sàng lọc, phát hiện nhanh bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) [26], [34]; khẳng định bằng sắc ký lỏng khối phổ (LCMS) [25], [29], [34]. Như vậy, Việt Nam còn thiếu các nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) và sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMS/MS) cho kết quả chính xác trên các nhóm giảm đau, chống viêm, giảm glucose máu, ức chế PDE-5 trộn trái phép trong nền mẫu đông dược có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh lý cơ xương khớp, bệnh đái tháo đường và bệnh lý liệt dương. Bên cạnh đó, các nghiên cứu tại Việt Nam chỉ phát hiện các thuốc tân dược [23], [24] bằng Raman; mà chưa có nghiên cứu nào phát hiện thuốc tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng TLC-SERS. Từ các thực tế và lý do trên, đề tài “Xây dựng quy trình xác định một số tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược” được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng quy trình định tính và định lượng nhóm giảm đau, chống viêm, giảm glucose máu, ức chế PDE-5 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký hai lần khối phổ (LC-MS/MS). 2. Xây dựng quy trình phát hiện nhanh một số tân dược trên trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) và tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS). 3. Áp dụng các quy trình đã xây dựng để kiểm tra phát hiện một số tân dược trên trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược đang lưu hành tại Việt Nam.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ CẨM MINH XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÂN DƯỢC TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tân dược trộn trái phép chế phẩm đông dược 1.1.1 Khái niệm, phân loại chế phẩm đông dược 1.1.2 Tình hình tân dược trộn trái phép đơng dược giới 1.1.3 Tình hình tân dược trộn trái phép đông dược Việt Nam 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 12 1.2.1 Nhóm giảm đau, chống viêm steroid phi steroid 12 1.2.2 Nhóm giảm glucose máu 16 1.2.3 Nhóm ức chế PDE-5 18 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 19 19 1.3.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC-SERS) 24 1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 32 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Nguyên liệu, trang thiết bị 39 2.1.1 Nguyên liệu 39 2.1.2 Trang thiết bị 40 2.2 Đối tượng nghiên cứu 41 2.2.1 Mẫu thử 41 2.2.2 Mẫu placebo 41 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 43 2.3.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng số tân dược trộn trái phép chế phẩm đông dược LC-MS/MS 43 2.3.2 Xây dựng quy trình định tính số tân dược trộn trái phép chế phẩm đông dược HPTLC 46 2.3.3 Phát triển quy trình định tính sildenafil trộn trái phép chế phẩm đông dược phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với tán xạ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS) 48 2.3.4 Ứng dụng phương pháp phân tích 50 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 51 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 52 3.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng phương pháp LCMS/MS 52 3.1.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng số thuốc nhóm giảm đau, chống viêm trộn trái phép chế phẩm đông dược 52 3.1.2 Xây dựng quy trình định tính, định lượng số thuốc nhóm giảm glucose máu trộn trái phép chế phẩm đông dược 68 3.1.3 Xây dựng quy trình định tính, định lượng số thuốc nhóm ức chế PDE-5 trộn trái phép chế phẩm đông dược 78 3.2 Xây dựng quy trình định tính phương pháp HPTLC 87 3.2.1 Xây dựng quy trình định tính nhóm glucorticoid phương pháp HPTLC 87 3.2.2 Xây dựng quy trình định tính nhóm NSAID phương pháp HPTLC 92 3.2.3 Xây dựng quy trình định tính nhóm giảm glucose máu phương pháp HPTLC 97 3.2.4 Xây dựng quy trình định tính nhóm ức chế PDE-5 phương pháp HPTLC 102 3.3 Phát triển quy trình định tính phương pháp TLC-SERS 106 3.3.1 Xây dựng quy trình định tính phương pháp TLC-SERS 106 3.3.2 Thẩm định phương pháp định tính sildenafil TLC-SERS 109 3.4 Đánh giá khả ứng dụng phương pháp HPTLC, LC-MS/MS TLC-SERS 110 3.4.1 Ứng dụng phương pháp HPTLC mẫu thực 111 3.4.2 Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS xác định dược chất trộn lẫn chế phẩm đông dược 117 3.4.3 Ứng dụng phương pháp TLC-SERS mẫu thực CHƯƠNG BÀN LUẬN 120 122 4.1 Xây dựng mẫu chế phẩm đông dược 122 4.2 Phương pháp LC-MS/MS 124 4.2.1 Xây dựng quy trình chiết xuất thuốc tân dược chế phẩm đông dược 124 4.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích LC-MS/MS 126 4.2.3 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS 128 4.3 Phương pháp HPTLC 130 4.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích HPTLC 130 4.3.2 Thẩm định phương pháp HPTLC 133 Phương pháp TLC-SERS 135 4.4 4.4.1 Lựa chọn phương pháp 135 4.4.2 Xây dựng quy trình định tính sildenafil TLC – SERS 136 4.4.3 Thẩm định phương pháp TLC-SERS 139 Đánh giá khả ứng dụng phương pháp 139 4.5.1 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 139 4.5.2 Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS phân tích mẫu thực 141 4.5.3 Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phân tích mẫu thực 143 4.5 4.5.4 Bước đầu đánh giá tình hình dược chất trộn lẫn mẫu thực 144 4.6 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 145 147 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AOAC Hiệp hội nhà hóa phân tích thống (Association of Official Analytical Chemists) AR Thuốc thử phân tích BETA Betamethason CRE Hiệu ứng giọt cà phê (Coffe ring effect) CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis) COX Cyclooxygenase DEXA Dexamethason acetat ESI Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization) GLIB GLIC Glibenclamid Gliclazid GLM Glimepirid GLIP Glipizid Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography) HPLC- DAD Sắc ký lỏng hiệu cao – Detector diod (High Performance Liquid Chromatography-Diode-Array Detection) HYDRO Hydrocortison acetat HPLC KETO ICH LOD Ketoprofen Hội đồng hòa hợp quốc tế (International Conference on Harmonisation) Indomethacin Hồng ngoại (Irradation) Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (Liquid chromatography - mass spectrometry) Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography tandem mass spectrometry) Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ m/z MeOH Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) Khối lượng/điện tích Methanol INDO IR LC-MS LC-MS/MS MRM MS Chế độ khảo sát đa phản ứng (Multiple Reaction Monitoring) Khối phổ (Mass Spectrometry) NMR NSAID TAD Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) Thuốc chống viêm khơng steroid (Non-Steroidal AntiInflammatory Drug) Tinh khiết phân tích (Pure Analysis) Paracetamol Phosphodiesterae – Piroxicam Prednisolon Prednison Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) Tán xạ Raman tăng cường bề mặt (Surface- enhanced Raman spectroscopy) Tín hiệu/nhiễu (Signal/noise) Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Sildenafil citrat Chế độ khảo sát ion lựa chọn (Selected Ion Monitoring) Chế độ khảo sát phản ứng lựa chọn (Selected Reaction Monitoring) Nhóm cơng tác khoa học cho phân tích thuốc bị thu giữ (Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs) Tadalafil TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron microscopy) TFA Trifluoroacetic Acid TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TLC-SERS TOF Sắc ký lớp mỏng kết hợp tán xạ Raman tăng cường bề mặt (Thin Layer Chromatography – Surface Enhanced Raman Spectroscopy) Thời gian bay (Time Of Flight) TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe TPCN Thực phẩm chức UV-Vis Tử ngoại – Khả kiến (Ultra Violet - Visible) VAR Vardenafil hydrochlorid VNKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương PA PARA PDE – PIRO PREL PREN RSD SERS S/N SD SIL SIM SRM SWGDRUG DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Cấu trúc hố học, tính chất vật lý liều dùng thuốc giảm đau, chống viêm phi steroid nghiên cứu 14 Bảng 1.2.Cấu trúc, tính chất vật lý liều dùng thuốc glucocorticoid 15 Bảng 1.3 Cấu trúc, tính chất vật lý liều dùng thuốc nghiên cứu 17 Bảng 1.4 Cấu trúc, tính chất vật lý liều dùng thuốc ức chế PDE-5 19 Bảng 1.5 So sánh vài thông số HPTLC TLC 20 Bảng 1.6 Các nghiên cứu phát tân dược trộn lẫn chế phẩm đông dược phương pháp TLC 23 Bảng 1.7.Phân loại kỹ thuật phân tích SWGDRUG 28 Bảng 1.8 Các nghiên cứu phát tân dược trộn lẫn chế phẩm đông dược phương pháp TLC-SERS 31 Bảng 1.9 Các nghiên cứu phát tân dược trộn lẫn chế phẩm đông dược phương pháp LC-MS 35 Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng nghiên cứu 39 Bảng 3.1 Các thông số máy khối phổ 52 Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ nhóm giảm đau, chống viêm 53 Bảng 3.3 Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient nhóm giảm đau, chống viêm 55 Bảng 3.4 Kết khảo sát dung môi chiết 58 Bảng 3.5 Kết khảo sát thời gian siêu âm nhóm giảm đau, chống viêm 59 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ phù hợp nhóm giảm đau chống viêm hệ thống LC-MS/MS 60 Bảng 3.7 Sự phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic chất nghiên cứu 64 Bảng 3.8 Kết LOD LOQ mẫu nhóm giảm đau, chống viêm 65 Bảng 3.9 Kết đánh giá độ độ xác nhóm giảm đau, chống viêm NX1 66 Bảng 3.10 Kết đánh giá độ độ xác nhóm giảm đau, chống viêm NX2 67 Bảng 3.11 Kết đánh giá độ độ xác nhóm giảm đau, chống viêm nén 67 Bảng 3.12 Các điều kiện khối phổ để phân mảnh nhóm giảm glucose máu 69 Bảng 3.13 Điều kiện khảo sát pha động theo gradient nhóm giảm glucose máu 70 Bảng 3.14 Khảo sát hiệu suất chiết nhóm giảm glucose máu LC-MS/MS 71 Bảng 3.15 Kết đánh giá độ phù hợp nhóm giảm glucose máu LCMS 73 Bảng 3.16 Kết xác định LOD LOQ nhóm giảm glucose máu 75 Bảng 3.17 Kết xây dựng đường chuẩn nhóm giảm glucose máu phương pháp LC-MS/MS 75 Bảng 3.18 Kết đánh giá độ độ xác nhóm giảm glucose máu phương pháp LC-MS/MS 77 Bảng 3.19 Điều kiện khối phổ nhóm ức chế PDE-5 78 Bảng 3.20 Chế độ gradient pha động phân tích nhóm ức chế PDE-5 79 Bảng 3.21 Kết khảo sát hiệu suất chiết nhóm ức chế PDE-5 phương pháp 81 Bảng 3.22 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống nhóm ức chế PDE-5 82 Bảng 3.23 Kết xác định LOD, LOQ nhóm ức chế PDE-5 phương pháp 84 Bảng 3.24 Kết đánh giá khoảng tuyến tính nhóm ức chế PDE-5 84 Bảng 3.25 Kết xác định độ đúng, độ xác ngày khác ngày nhóm ức chế PDE-5 85 Bảng 3.26 Kết LOD nhóm corticoid 92 Bảng 3.27 Kết xác định LOD nhóm NSAID 96 Bảng 3.28 Kết xác định LOD LOQ nhóm giảm glucose máu 101 Bảng 3.29 Kết xác định LOD, LOQ nhóm ức chế PDE-5 105 Bảng 3.30 Kết định tính mẫu dương tính với nhóm glucocorticoid 112 Bảng 3.31 Kết định tính mẫu dương tính với nhóm NSAID 114 Bảng 3.32 Kết định tính mẫu dương tính với nhóm giảm glucose máu 115 Bảng 3.33 Kết định tính mẫu chế phẩm đơng dược dương tính với dược chất nhóm ức chế PDE-5 117 Bảng 3.34 Kết mẫu chế phẩm phát có dược chất nghiên cứu 120 Bảng 3.35 Bảng đỉnh đặc trưng tỉ lệ cường độ SERS đỉnh mẫu dương tính sildenafil 121 Bảng 4.1 Các đỉnh dao động lý thuyết thực nghiệm sildenafil 137 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1.Biểu đồ phân bố số lượng cơng bố nghiên cứu theo năm theo Hình 1.2.Quy trình phân tích thiết bị HPTLC 21 Hình 1.3.Sơ đồ nguyên lý SERS 25 Hình 1.4.Quy trình phân tích mẫu theo phương pháp TLC-SERS 29 Hình 1.5 Số lượng phát minh kỹ thuật SERS cho lĩnh vực dược phẩm 30 Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 32 Hình 1.7 Sơ đồ tạo ion nguồn ES 33 Hình 1.8 Tứ cực chập ba gập cong hệ máy LC-MS/MS Bruke 34 Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký nhóm giảm đau, chống viêm 54 Hình 3.2 Sắc ký đồ nhóm giảm đau, chống viêm với pha động lựa chọn 56 Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dịng nhóm giảm đau, chống viêm 57 Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu nhóm giảm đau, chống viêm nang (NX1) LC-MS/MS 62 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu nhóm giảm đau, chống viêm bột (NX2) LC-MS/MS 62 Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu nhóm giảm đau, chống viêm nén (NX3) LC-MS/MS 63 Hình 3.7 Sắc ký đồ pha động nhóm giảm glucose máu LC-MS/MS 70 Hình 3.8 Sắc ký đồ giảm glucose máu hồn ND3 LC-MS/MS 74 Hình 3.9 Sắc ký đồ giảm glucose máu nén ND1 LC-MS/MS 74 Hình 3.10 Sắc ký đồ giảm glucose máu nang ND2 LC-MS/MS 74 Hình 3.11 Sắc ký đồ nhóm ức chế PDE-5 LC-MS/MS 80 Hình 3.12 Sắc ký đồ nhóm ức chế PDE-5 cao NP3 LC-MS/MS 83 Hình 3.13 Sắc ký đồ nhóm ức chế PDE-5 hồn NP2 LC-MS/MS 83 Hình 3.14 Sắc ký đồ nhóm ức chế PDE-5 nang NP1 LC-MS/MS 83 Hình 3.15 Kết khảo sát thành phần dung mơi pha động nhóm corticoid 87 BÁO CÁO THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT STT Nguyên vật liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc Chất chuẩn Sildenafil citrat Tadalafil hydroclorid Vardenafil hydroclorid Chuẩn DĐVN Chuẩn DĐVN Chuẩn EU Chuẩn VKNTTW số lô WS.0316265.03, HL: 98,28% Độ ẩm : 0,04% Chuẩn VKNTTW SKS: 0103129, HL: 100,10% (HPLC), 99,70% (UV- VIS) Độ ẩm: 0,09% Chuẩn Dược Điển Châu ÂU CAS Number: 330808-8-3, HL: 100,0% Dung môi 10 Methanol Acetonitril Acid formic Ether dầu hỏa Methanol 11 Nước cất HPLC HPLC PA AR AR Tinh khiết Merck - Đức Merck - Đức Merck - Đức Trung Quốc Trung Quốc 2.2 Thiết bị, dụng cụ -Máy sắc ký lỏng khối phổ Brucker Evog Qube, (Mỹ)- Cột tách Restek Ultra II C18 (100mm × 2,1 mm, 1,9m), (Mỹ) 2.3 Nền mẫu Nền mẫu viên nang cứng nhóm nghiên cứu Trường Đại học Dược cung cấp với mức liều dự kiến khoảng 2,00 g III Quy trình phân tích kết thẩm định 3.1 Mơ tả phương pháp Xử lý mẫu Cân xác đơn vị mẫu, tính khối lượng trung bình Đồng mẫu, nghiền mịn Cân xác lượng bột tương ứng ½ liều (1,00 g) vào ống falcon dung tích 50 ml Thêm xác 25 ml methanol, lắc xoáy phút, siêu âm 10 phút, ly tâm 6000 vịng/phút phút Pha lỗng lớp dịch phía 50 lần methanol Lọc qua màng lọc 0,22 µm Điều kiện sắc ký: - Cột: Restek Ultra II C18 (100 mm × 2,1 mm; 1,9 m) (Mỹ) - Cột bảo vệ: Restek Ultra C18 Guard Cartridge (10 mm × mm; m) (Mỹ) Trang 3/17 BÁO CÁO THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT - Nhiệt độ buồng cột: 40oC - Thể tích tiêm mẫu: µl - Tốc độ dịng: 0,3 ml/phút - Thời gian phân tích: 12 phút - Pha động: Kênh A HCOOH 0,1%/H2O kênh B HCOOH 0,1%/ACN - Gradient bảng sau: Thời gian (phút) %A %B 0-7 70 → 30 30 → 70 - 8,5 30 → 70 70 → 30 8,5 - 12 70 30 Điều kiện khối phổ: Điện áp đầu phun: 3500V Khí chắn: 20psi Nhiệt độ nón: 250C Khí ion hóa 1: 40psi Nhiệt độ ion hóa: 250C Khí ion hóa 2: 45psi CID gas: Ar 1.5mTorr Bảng Điều kiện khối phổ chất phân tích Tên chất Sildenafil Ion mẹ (m/z) 475,2 Vardenafil 489,2 Tadalafil 390,0 Ion (m/z) 100,3 283,0 151,1 312,0 268,0 169,0 CE (eV) 24 35 40 37 11 34 Tỷ lệ (%) 73,9 26,1 75,0 25,0 75,4 24,6 3.2 Kết thẩm định 3.2.1 Độ đặc hiệu * Thực nghiệm - Mẫu chuẩn: Mẫu hỗn hợp chuẩn SIL 500 ng/ml; VAR, TAD 160 ng/ml methanol - Mẫu nền: chuẩn bị phần Xử lý mẫu, mục 3.1 Mô tả phương pháp; Trang 4/17 BÁO CÁO THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT Mẫu tự tạo: thêm vào mẫu hỗn hợp chuẩn chất phân tích có nồng độ - tương đương nồng độ chất mẫu hỗn hợp chuẩn Chuẩn bị phần Xử lý mẫu, mục 3.1 Mô tả phương pháp * Kết Nền mẫu thêm chuẩn Hỗn hợp chuẩn Nền mẫu Hình Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp Kết cho thấy sắc ký đồ mẫu hồn khơng xuất pic trùng với thời gian lưu chất phân tích Trên sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn, pic xuất trùng với thời gian lưu chuẩn, pic có hình dạng cân đối, sắc nét Như vậy, phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu độ đặc hiệu 3.2.2 .Độ thích hợp hệ thống * Thực nghiệm - Mẫu chuẩn: Sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp pha mục 3.2.1 Độ đặc hiệu - Phân tích lặp lại lần dung dịch chuẩn hỗn hợp hệ thống LC-MS/MS với điều kiện sắc ký mục 3.1 Mô tả phương pháp * Kết Bảng Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS Hoạt chất tR SIL Spic L1 3,850 L2 3,851 L3 3,853 L4 3,857 L5 3,858 L6 3,855 TB 3,854 48230 47116 48355 47467 48392 48255 47969,2 RSD 0,1 1,1 Trang 5/17 BÁO CÁO THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT VAR TAD tR 3,212 3,213 3,217 3,216 3,222 3,252 3,222 0,5 Spic 8866 8907 8884 8742 8511 8731 8773,5 1,7 tR 3,260 3,251 3,263 3,267 3,255 3,259 3,260 0,2 Spic 61394 60998 60477 61982 63335 63815 62000,2 2,1 *: tR (phút); Spic (Counts) Nhận xét: Kết cho thấy hệ số biến thiên (RSD) thời gian lưu thấp (