Nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng của loài Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep., Ranunculaceae)

ĐẶT VẤN ĐỀ Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep. Ranunculaceae) được coi là một loài thực vật đặc hữu của vùng núi Sa pa do nhà thực vật học Françoise Gagnepain xác định từ năm 1929. Theo tác giả Françoise Gagnepain thì Phong quỳ sa pa có nhiều đặc điểm hình thái giống với loài A. howellii Jeffrey & W. W. Smith, nhưng có khác nhau một số điểm quan trọng nên là một loài riêng và đến nay vẫn được coi là loài đặc hữu của vùng Sapa. Quan điểm này được Ziman ủng hộ [125]. Thân rễ của loài Phong quỳ sa pa được người dân ở vùng Sa Pa (tỉnh Lào Cai) sử dụng làm thuốc chữa viêm họng, viêm túi mật, đau dạ dày, xương khớp. Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của cây thuốc này để cung cấp cơ sở khoa học cho giá trị sử dụng theo kinh nghiệm của nhân dân, các đặc điểm về hình thái thực vật cũng mới chỉ được mô tả sơ lược. Với mong muốn được nghiên cứu sâu hơn một loài thực vật đặc hữu của Vi ệt Nam, đóng góp các dữ liệu khoa học cho công tác nghiên cứu và đào tạo, cũng như góp phần bảo tồn, sử dụng và phát triển hợp lý loài này, nghiên cứu sinh đã lựa chọn đối tượng này làm đề tài nghiên cứu cho luận án tiến sĩ Dược học: “Nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của loài Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep., Ranunculaceae)’’. Đề tài được thực hiện, nhằm hướng tới 3 mục tiêu chính sau: 1. Thẩm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu thuộc loài Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep.), họ Mao lương (Ranunculaceae), mô tả được các đặc điểm hình thái thực vật và hình thái vi học của loài này. 2. Xác định được về thành phần hóa học của loài Phong quỳ sa pa: định tính các nhóm chất, phân lập được các hợp chất chính và xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất. 3. Đánh giá được một số tác dụng sinh học trên mô hình in vitro của các hợp chất phân lập từ loài Phong quỳ sa pa. Để đạt được 3 mục tiêu trên, cần thực hiện một số nội dung nghiên cứu chính sau: 1. Nghiên cứu về thực vật: - Thẩm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu thu thập tại khu vực Sa Pa, tỉnh Lào Cai (Anemone chapaensis Gagnep., thuộc họ Mao lương Ranunculaceae). - Phân tích, mô tả đầy đủ các đặc điểm hình thái thực vật. - Nghiên cứu, môt tả các đặc điểm hình thái vi phẫu và bột các bộ phận. 2. Nghiên cứu về hóa học: - Định tính các nhóm chất chính có trong phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất loài Phong quỳ sa pa. - Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ phần dưới mặt đất và phần trên mặt đất loài Phong quỳ sa pa. 3. Nghiên cứu một số tác dụng sinh học: - Đánh giá tác dụng chống viêm của một số hợp chất phân lập được từ Phong quỳ sa pa: ức chế sự hình thành NO và mức độ biểu hiện của của protein COX-2 trên tế bào trên đại thực bào RAW264.7 bị kích thích bởi LPS. - Đánh giá tác dụng gây độc một số dòng tế bào ung thư người của các hợp chất phân lập được từ Phong quỳ sa pa.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU HÀ THỊ THANH HƢƠNG NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG CỦA LOÀI PHONG QUỲ SA PA (Anemone chapaensis Gagnep., Ranunculaceae LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2020 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i Mục lục ………………………………………….………………………………i Danh mục chữ viết tắt iii Danh mục bảng…………………………………………………………….v Danh mục hình …………………………………………………………vii ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………… Chương 1: TỔNG QUAN …………………………………………………… 1.1 Tổng quan thực vật học chi Anemone 1.1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Anemone 1.1.2 Thành phần hóa học của chi Anemone 1.1.3 Cơng dụng của sớ lồi thuộc chi Anemone y học cổ truyền 16 1.1.4 Tác dụng sinh học của loài thuộc chi Anemone 20 1.2 Tổng quan loài Phong quỳ sa pa 27 1.2.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bớ sinh thái của lồi Phong quỳ sa pa Anemone chapaensis Gagnep 27 1.2.2 Thành phần hóa học của loài Phong quỳ sa pa 29 1.2.3 Một số công dụng tác dụng sinh học của loài Phong quỳ sa pa 29 Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Nguyên, vật liệu nghiên cứu 30 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 30 2.1.2 Thuốc thử, hóa chất, dung môi 30 2.2 Máy móc, trang thiết bị 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1 Nghiên cứu thực vật học 33 2.3.2 Nghiên cứu hóa học 33 2.3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 35 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41 3.1 Kết nghiên cứu thực vật 41 3.1.1 Thẩm định tên khoa học 41 3.1.2 Đặc điểm hình thái thực vật 41 3.1.3 Đặc điểm vi phẫu 45 3.1.4 Đặc điểm bột dược liệu 48 3.2 Kết nghiên cứu thành phần hóa học 50 3.2.1 Định tính nhóm hợp chất hữu 50 3.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất 51 i 3.2.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập từ loài Phong quỳ sa pa … 56 3.3 Tác dụng sinh học 95 3.3.1 Đánh giá tác dụng chống viêm 95 3.3.1.1 Tác dụng ức chế sự sản sinh NO đại thực bào RAW264.7 95 3.3.1.2 Tác dụng ức chế sự biểu hiện của protein COX-2 97 3.3.2 Tác dụng gây độc tế bào ung thư 97 Chương 4: BÀN LUẬN 99 4.1 Về thực vật học 99 4.2 Về hóa học 99 4.2.1 Kết định tính 100 4.2.2 Kết phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất 100 4.3 Về tác dụng sinh học 113 4.3.1 Về tác dụng ức chế sự sản sinh NO 113 4.3.2 Về tác dụng ức chế sự biểu hiện của protein COX-2 115 4.3.3 Về tác dụng gây độc với tế bào ung thư 116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .119 KẾT LUẬN 119 Về thực vật học 119 Về hóa học 119 Về tác dụng sinh học 119 KIẾN NGHỊ 120 TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………… 121 Danh mục cơng trình cơng bố liên quan đến Luận án 132 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu A-549 COSY Tiếng Anh Lung adenocarcinoma epithelial cell Angiosperm phylogeny group system Carbon-13 nuclear magnetic resonance Correlation spectroscopy CC Column chromatography Proton nuclear magnetic resonance Distortionless enhancement by polarisation transfer Dulbecco’s modified Eagle medium Dimethyl sulfoxide electrospray ionization Gas chromatography Human henrietta lack cell Human hepatocellular carcinoma cell Heteronuclear mutiple bond connectivity Heteronuclear singlequantum coherence High-resolution electrospray ionization mass spectrometry Inhibitory concentration at 50% Liquid chromatography Lipopolysaccharide Mass spectrometry 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2,5-Diphenyltetrazolium bromide APG 13 C-NMR H-NMR DEPT DMEM DMSO ESI GC HeLa HepG2 HMBC HSQC HR-ESIMS IC50 LC LPS MS MTT iii Diễn giải Tế bào ung thư phổi Hệ thống phân loại thực vật có hoa, hiện đại Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ tương quan protonproton Sắc kí cột Cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ DEPT Dung dịch đệm DMEM Sắc ký khí Tế bào ung thư cổ tử cung người Tế bào ung thư gan người Tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Tương tác dị hạt nhân qua liên kết Phổ khối lượng cao phun mù điện Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Sắ kí lỏng Phổ khối lượng Phương pháp đánh giá hoạt tính diệt tế bào ung thư, sử dụng MTT NSAIDs NO [α]D NOESY OD OVCAR-3 PQSP RP-18 SRB TLC TMS VAST WHO YHCT Nonsteroidal antiinflammatory drugs nitric oxide Optical rotation Nuclear overhauser effect spectroscopy Optical density Ovarian carcinoma cell Reserve phase C-18 Sulforhodamine B Thin layer chromatography Tetramethylsilane Vietnam academy of science and technology World Health Organization iv Thuốc chống viêm không steroid Độ quay cực riêng Phổ hiệu ứng hạt nhân Overhauser (cho thông tin tương quan không gian proton-proton) Mật độ quang học Tế bào ung thư buồng trứng Phong quỳ sa pa Chất hấp phụ pha đảo C-18 Sulforhodamin B Sắc ký lớp mỏng Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tổ chức Y tế Thế giới Y học cổ truyền DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Anemone và nơi ghi nhận phân bố Việt Nam5 Bảng 1.2 Các hợp chất triterpenoid phân lập từ chi Anemone Bảng 1.3 Các nhóm hợp chất khác phân lập từ chi Anemone 11 Bảng 1.4 Công dụng của sớ lồi thuộc chi Anemone 17 Bảng 1.5 Cơng dụng chữa bệnh của lồi thuộc chi Anemone Việt Nam 20 Bảng 1.6 Tổng hợp tác dụng sinh học của sớ lồi thuộc chi Anemone 21 Bảng 1.7 Các điểm khác biệt hình thái của lồi A howellii A chapaensis 28 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất của lồi Phong quỳ sa pa 50 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL1 hợp chất tham khảo 57 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL2 hợp chất tham khảo 62 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL3 hợp chất tham khảo 67 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL4 hợp chất tham khảo 70 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL5 hợp chất tham khảo 74 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL6 hợp chất tham khảo 75 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL7 hợp chất tham khảo 76 Bảng 3.9 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL8 hợp chất tham khảo 78 Bảng 3.10 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL9 hợp chất tham khảo 80 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL10 hợp chất tham khảo 82 Bảng 3.12 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACL11 hợp chất tham khảo 84 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACR1 hợp chất tham khảo 85 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACR2 hợp chất tham khảo 88 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACR3 hợp chất tham khảo 91 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ACR4 hợp chất tham khảo 94 v Bảng 3.17 Độc tính dịng tế bào RAW264.7 tác dụng ức chế sự sản sinh NO của hợp chất 95 Bảng 3.18 Tác dụng ức chế sự sản sinh NO của chất phân lập 96 Bảng 3.19 Tác dụng gây độc tế bào ung thư của hợp chất 98 Bảng 4.1 Dữ liệu phổ NMR của saponin ACL1-ACL4 ACR1-ACR3 104 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của triterpenoid phân lập từ chi Anemone Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của sapogenin từ chi Anemone 10 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của coumarin, flavonoid, lacton, lignan, steroid dẫn chất acid phenolic phân lập từ chi Anemone 15 Hình 3.1 Hình ảnh đặc điểm hình thái thực vật lồi Phong quỳ sa pa 44 Hình 3.2 Vi phẫu rễ nhỏ loài Phong quỳ sa pa 45 Hình 3.3 Vi phẫu thân rễ lồi Phong quỳ sa pa 46 Hình 3.4 Vi phẫu loài Phong quỳ sa pa 47 Hình 3.5 Đặc điểm bột phần mặt đất Phong quỳ sa pa 48 Hình 3.6 Đặc điểm bột phần mặt đất Phong quỳ sa pa 49 Hình 3.7 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phần mặt đất loài Phong quỳ sa pa 53 Hình 3.8 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phần mặt đất loài Phong quỳ sa pa 55 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất ACL1 hợp chất tham khảo 56 Hình 3.10 Các tương tác chính HMBC, COSY (A) NOESY (B) của ACL159 Hình 3.11 Sắc ký đồ GC của dẫn xuất TMS của đường thủy phân từ ACL1 61 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất ACL2 63 Hình 3.13 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC của ACL3 65 Hình 3.14 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của ACL4 69 Hình 3.15 Cấu trúc hóa học của hợp chất ACL5 73 Hình 3.16 Cấu trúc hóa học của hợp chất ACL6 74 Hình 3.17 Cấu trúc hóa học của hợp chất ACL7 76 Hình 3.18 Cấu trúc hóa học của hợp chất ACL8 77 vii Hình 3.19 Cấu trúc hóa học của hợp chất ACL9 79 Hình 3.20 Cấu trúc hóa học của hợp chất ACL10 81 Hình 3.21 Cấu trúc hóa học của hợp chất ACL11 84 Hình 3.22 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của ACR1 85 Hình 3.23 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của ACR2 87 Hình 3.24 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của ACR3 90 Hình 3.25 Cấu trúc hóa học của hợp chất ACR4 94 Hình 3.26 Ảnh hưởng của hợp chất ACR2 đến sự biểu hiện của protein COX-2 97 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất từ phần mặt đất 102 Hình 4.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất từ phần mặt đất 103 viii ĐẶT VẤN ĐỀ Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep Ranunculaceae) coi loài thực vật đặc hữu vựng nỳi Sa pa nh thc vt hc Franỗoise Gagnepain xỏc nh t nm 1929 Theo tỏc gi Franỗoise Gagnepain Phong quỳ sa pa có nhiều đặc điểm hình thái giống với lồi A howellii Jeffrey & W W Smith, có khác số điểm quan trọng nên loài riêng đến coi loài đặc hữu vùng Sapa Quan điểm Ziman ủng hộ [125] Thân rễ loài Phong quỳ sa pa người dân vùng Sa Pa (tỉnh Lào Cai) sử dụng làm thuốc chữa viêm họng, viêm túi mật, đau dày, xương khớp Tuy nhiên, đến chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý thuốc để cung cấp sở khoa học cho giá trị sử dụng theo kinh nghiệm nhân dân, đặc điểm hình thái thực vật mô tả sơ lược Với mong muốn nghiên cứu sâu lồi thực vật đặc hữu Việt Nam, đóng góp liệu khoa học cho công tác nghiên cứu đào tạo, góp phần bảo tồn, sử dụng phát triển hợp lý loài này, nghiên cứu sinh lựa chọn đối tượng làm đề tài nghiên cứu cho luận án tiến sĩ Dược học: “Nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học và số tác dụng sinh học của loài Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep., Ranunculaceae)’’ Đề tài thực hiện, nhằm hướng tới mục tiêu sau: Thẩm định tên khoa học mẫu nghiên cứu thuộc loài Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep.), họ Mao lương (Ranunculaceae), mơ tả đặc điểm hình thái thực vật hình thái vi học lồi Xác định thành phần hóa học lồi Phong quỳ sa pa: định tính nhóm chất, phân lập hợp chất xác định cấu trúc hóa học hợp chất ... “Nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học và số tác dụng sinh học của loài Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep., Ranunculaceae)? ??’ Đề tài thực hiện, nhằm hướng tới mục tiêu sau:... hình thái thực vật lồi Phong quỳ sa pa 44 Hình 3.2 Vi phẫu rễ nhỏ loài Phong quỳ sa pa 45 Hình 3.3 Vi phẫu thân rễ lồi Phong quỳ sa pa 46 Hình 3.4 Vi phẫu loài Phong quỳ sa pa ... hóa học của hợp chất từ phần mặt đất 103 viii ĐẶT VẤN ĐỀ Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep Ranunculaceae) coi loài thực vật đặc hữu vựng nỳi Sa pa nh thc vt hc Franỗoise Gagnepain