Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất của cây Dây thìa canh Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex. Schult (FULL TEXT)

ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (DTC) (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.), thuộc chi Gymnema R.Br, phân bố rất rộng từ Tây Châu Phi sang Châu Úc, Châu Á. DTC đã đƣợc sử dụng trong nền Y học cổ truyền Ấn Độ từ hơn 2000 năm để điều trị Đái tháo đƣờng (ĐTĐ), cho đến nay có hàng trăm nghiên cứu tại Ấn Độ và nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Ấn Độ, Nhật Bản, M , Trung Quốc …liên quan đến DTC, tập trung vào nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, trong đó chủ yếu là tác dụng hạ đƣờng huyết cũng nhƣ một số bệnh lý chuyển hóa khác. Tại Việt Nam, Dây thìa canh bắt đầu đƣợc tập trung nghiên cứu từ năm 2008, trên các khía cạnh đa dạng sinh học, phân bố, độc tính, tác dụng hạ đƣờng huyết, từ đó nghiên cứu phát triển tạo ra nhiều sản phẩm hạ đƣờng huyết dƣới dạng viên nang, viên nén, dạng trà túi lọc và cả dạng dƣợc liệu khô đóng gói để sắc uống. Nhằm bảo đảm nguồn nguyên liệu, DTC cũng đã đƣợc nghiên cứu nhân giống, trồng trọt. Đến năm 2015, đã có 2 vùng trồng đạt tiêu chuẩn GACP - WHO của công ty Nam Dƣợc tại Hải Hậu (Nam Định) và của công ty DK Natura tại Phú Lƣơng (Thái Nguyên). Trong quá trình phát triển và ứng dụng trong thực tiễn DTC có nguồn gốc tự nhiên ở Việt Nam, xuất hiện nhiều vấn đề chƣa đƣợc làm sáng tỏ nhƣ thành phần hóa học khác so với DTC ở Ấn Độ, khó đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu dựa trên hàm lƣợng hoạt chất, xác định thời gian thu hái cho chất lƣợng tốt nhất trong trồng trọt,... Lý do chính là thiếu các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các chất trong DTC. Từ những lý do trên, đề tài ‖Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất của cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.)‖ đƣợc thực hiện với 2 mục tiêu chính:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN DƢỢC LIỆU

HOÀNG MINH CHÂU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI

TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA

SYLVESTRE (RETZ.) R Br EX SCHULT.)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1 THỰC VẬT HỌC 3

1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema R Br 3

1.2 Chi Gymnema R Br ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố của các loài 6

2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R Br 7

2.1 Nhóm hợp chất saponin 7

2.2 Các nhóm chất khác 19

3 TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT VÀ CHỐNG TĂNG LIPID HUYẾT CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R Br 20

3.1 Tác dụng hạ đường huyết 20

3.2 Tác dụng chống tăng lipid huyết 25

4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT SAPONIN TRONG MỘT SỐ DƯỢC LIỆU 28

4.1 Phương pháp định lượng và đánh giá động thái tích lũy hoạt chất 28

4.2 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo tuổi cây 28

4.3 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời gian thu hái trong năm 29

4.4 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời điểm sinh trưởng và bộ phận của cây 30

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 33

2.1.2 Vật liệu, dung môi, hóa chất 34

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 35

2.1.4 Động vật thực nghiệm dùng trong nghiên cứu 37

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 38

2.2.1.2.Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập 38

2.2.2 Nghiên cứu tác dụng sinh học 38

2.2.2.1 Phương pháp điều chế mẫu dịch chiết DTC cho thử tác dụng hạ đường huyết 39

2.2.2.2.Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết trên chuột của dịch chiết Dây thìa canh 39

2.2.2.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các chất phân lập được 41

2.2.2.3.1 Phương pháp xác định khả năng ức chế enzym PTP1B của hoạt chất 41

2.2.2.3.2 Phương pháp biệt hóa tế bào mô mỡ 3T3-L1 42

2.2.2.3.3 Phương pháp đo độ hấp thu glucose trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 của các chất phân lập 43

2.2.2.3.2.4 Phương pháp chụp ảnh tế bào phát huỳnh quang 43

2.2.2.3.5 Phương pháp phân tích kết quả 43

2.2.3 Nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất trong lá Dây thìa canh 44

2.2.3.1 Phương pháp thủy phân và xác định cấu trúc aglycon 44

2.2.3.2.Phương pháp định lượng aglycon và theo dõi động thái tích lũy hoạt chất 44 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 46

3.1.1 Chiết xuất và phân lập các chất tinh khiết từ Dây thìa canh 46

3.1.2 Xác định cấu trúc hóa học các chất đã phân lập được 48

3.1.2.1 Chất 1 48

3.1.2.2 Chất 2 52

3.1.2.3 Chất 3 55

3.1.2.4 Chất 4 58

3.1.2.5 Chất 5 61

3.1.2.6 Chất 6 65

3.1.2.7 Chất 7 66

3.1.2.8 Chất 8 69

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 74

3.2.1 Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết trên chuột 74

3.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các chất phân lập 85

3.3.2.1.Hoạt tính ức chế enzym PTP1B 85

3.2.2.2.Hoạt tính hấp thu glucose trong tế bào 3T3-L1 của các chất 86

3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT 88

3.3.1 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc aglycon gymnemagenol 88

3.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng gymnemagenol và theo dõi động thái tích lũy hoạt chất trong DTC 96

3.3.2.1 Chuẩn bị mẫu dược liệu và khảo sát điều kiện phân tích 96

3.3.2.2 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống 98

3.3.2.3 Độ lặp lại của phương pháp 98

3.3.2.4 Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp 99

3.3.2.5 Độ đúng của phương pháp 100

3.3.2.6 Giới hạn của phương pháp 101

3.3.2.7 Định lượng gymnemagenol các mẫu Dây thìa canh theo các tháng thu hái102 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 106

4.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 107

4.3 VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 112

4.3.1 Về tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết Dây thìa canh 112

4.3.2 Về tác dụng hạ đường huyết của các chất phân lập từ Dây thìa canh 115

4.4 VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT 117

4.5 BÀN LUẬN CHUNG 119

KẾT LUẬN 121

1 Về thành phần hóa học 121

2 Về tác dụng sinh học 122

3 Về động thái tích lũy hoạt chất 122

ĐỀ XUẤT 124

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

…liên quan đến DTC, tập trung vào nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, trong đó chủ yếu là tác dụng hạ đường huyết cũng như một số bệnh lý chuyển hóa khác

Tại Việt Nam, Dây thìa canh bắt đầu được tập trung nghiên cứu từ năm 2008, trên các khía cạnh đa dạng sinh học, phân bố, độc tính, tác dụng hạ đường huyết, từ đó nghiên cứu phát triển tạo ra nhiều sản phẩm hạ đường huyết dưới dạng viên nang, viên nén, dạng trà túi lọc và cả dạng dược liệu khô đóng gói để sắc uống Nhằm bảo đảm nguồn nguyên liệu, DTC cũng đã được nghiên cứu nhân giống, trồng trọt Đến năm 2015, đã có 2 vùng trồng đạt tiêu chuẩn GACP

- WHO của công ty Nam Dược tại Hải Hậu (Nam Định) và của công ty DK Natura tại Phú Lương (Thái Nguyên)

Trong quá trình phát triển và ứng dụng trong thực tiễn DTC có nguồn gốc tự nhiên ở Việt Nam, xuất hiện nhiều vấn đề chưa được làm sáng tỏ như thành phần hóa học khác so với DTC ở Ấn Độ, khó đánh giá chất lượng dược liệu dựa trên hàm lượng hoạt chất, xác định thời gian thu hái cho chất lượng tốt nhất trong trồng trọt, Lý do chính là thiếu các nghiên cứu về thành phần hóa học

và tác dụng sinh học của các chất trong DTC Từ những lý do trên, đề tài

‖Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất

của cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.)‖ được

thực hiện với 2 mục tiêu chính:

1 Xác định cấu trúc hóa học các thành phần hóa học chính của lá Dây

2 Xác định sự thay đổi hàm lượng một số hoạt chất chính theo thời gian thu hái trong năm của lá Dây thìa canh

Để đạt được mục tiêu trên, Luận án tiến hành nghiên cứu với các nội dung sau:

Về nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất:

- Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất chính trong lá Dây thìa canh

- Theo dõi sự thay đổi hàm lượng hoạt chất của các mẫu lá Dây thìa canh thu hái trong năm

R Br vào họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [2], [7],[8]

Tuy nhiên, năm 2009 Takhtajan đã công bố hệ thống phân loại trong đó xếp

Gymnema R Br là một chi trong phân họ Asclepiadoideae của một họ lớn là

Apocynaceae [17] Cho đến nay, quan điểm này được thừa nhận rộng rãi trong

các hệ thống phân loại quốc tế [32],[79] Theo đó, Gymnema R Br là một chi

thuộc phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae), họ Trúc đào (Apocynaceae), bộ Long đởm (Gentianales), phân lớp Bạc hà (Lamiidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [17]

 Đặc điểm hình thái chung của chi Gymnema R Br

Cây leo, không có rễ phụ trên thân Lá mọc đối, không nạc Cụm hoa xim, tán hoặc chùm Hoa nhỏ Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, ít khi không có tuyến Tràng hình bánh xe, thùy tràng không gập trong nụ, tiền khai hoa vặn phải Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ đính ở tràng, thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng Chỉ nhị dính nhau; bao phấn 2 ô, thường có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót dính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy Cột nhị-nhụy hình ống nhọn đầu [20],[32]

 Các loài thuộc chi Gymnema R Br và sự phân bố của chúng trên thế

giới

Có nhiều nhận định khác nhau về số lƣợng loài của chi Gymnema R Br, một

số tài liệu cho rằng chi này có khoảng 25 loài trên toàn thế giới [7], [20], [32] Tuy nhiên, sau khi tổng hợp các cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới, các tác giả thuộc dự án ―The plant list‖ đã xác định đƣợc 144 tên loài thuộc chi

Gymnema R Br trong đó có 51 tên khoa học đƣợc chấp nhận (35,4%), 66 tên

đƣợc xác định là tên đồng nghĩa (45,8%) và 27 tên chƣa xác định đƣợc chính xác thông tin (18,8%) [80]

Bảng 1.1 Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R Br trên thế giới

STT Tên các loài thuộc chi Gymnema R

Br đƣợc chấp nhận [50]

Phân bố

1 Gymnema acuminatum Wall Nepal, Ấn Độ, Malaysia [80]

2 Gymnema albidum Decne Timor [80]

3 Gymnema albiflorum Costantin Việt Nam [91]

4 Gymnema brevifolium Benth Úc [80]

5 Gymnema calycinum Schltr Luzon [80]

6 Gymnema chalmersii Schltr New Guinea [80]

7 Gymnema cumingii Schltr Philippin [80]

8 Gymnema cuspidatum (Thunb.)

Kuntze

9 Gymnema decaisneanum Wight Tamil Nadu [80]

10 Gymnema dissitiflorum Ridl Malaysia [80]

11 Gymnema dunnii (Maiden & Betche)

P.I.Forst

Úc [80]

12 Gymnema elegans Wight & Arn Tamil Nadu [80]

13 Gymnema erianthum Decne New Caledonia [80]

14 Gymnema foetidum Tsiang Việt Nam [1], Trung Quốc [20]

STT Tên các loài thuộc chi Gymnema R

Br đƣợc chấp nhận [50]

Phân bố

15 Gymnema glabrum Wight Myanmar [80]

16 Gymnema griffithii Craib Thái Lan, Việt Nam

17 Gymnema hainanense Tsiang Trung Quốc [20]

18 Gymnema hirtum Ridl Malaysia [80]

19

Gymnema inodorum (Lour.) Decne Trung Quốc, Ấn độ, Đông Nam

Á [79]

20 Gymnema javanicum Koord Java [80]

21 Gymnema khandalense Santapau Maharashtra [80]

26 Gymnema littorale Blume Java [80]

27 Gymnema longiretinaculatum Tsiang Trung Quốc [20]

28 Gymnema lushaiense M.A.Rahman &

Wilcock

Thành phố Assam [80]

29 Gymnema macrothyrsa Warb Sulawesi [80]

30 Gymnema maingayi Hook.f Malacca [80]

31 Gymnema mariae Schltr Philipin [80]

32 Gymnema micradenium Benth Queensland [80]

33 Gymnema molle Wall ex Wight Myanmar [80]

34 Gymnema montanum Hook.f Ấn Độ [80]

35 Gymnema muelleri Benth Úc [80]

36 Gymnema pachyglossum Schltr Luzon [80]

STT Tên các loài thuộc chi Gymnema R

Br được chấp nhận [50]

Phân bố

38 Gymnema pleiadenium F.Muell Queensland [80]

39 Gymnema recurvifolium Blume New Guinea [80]

40 Gymnema rotundatum Thwaites Sri Lanka [80]

41 Gymnema rufescens Decne Madagascar [80]

42 Gymnema schlechterianum Warb Philipin [80]

43 Gymnema spirei Costantin Lào [80]

44 Gymnema suborbiculare K.Schum New Guinea [80]

45 Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex

Việt Nam [1] Timor

47 Gymnema thorelii Costantin Lào [80]

48 Gymnema tricholepis Schltr New Guinea [80]

49 Gymnema trinerve R.Br Úc [80]

50 Gymnema uncarioides Schltr Luzon [80]

51 Gymnema yunnanense Tsiang Trung Quốc [20]

1.2 Chi Gymnema R Br ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố của các loài

Theo Danh lục các loài thực vật Việt Nam của Viện Sinh thái và Tài nguyên

sinh vật xuất bản năm 2005, chi Gymnema tại Việt Nam có 8 loài là: Gymnema albiflorum Cost., Gymnema alterniflorum (Lour.) Merr., Gymnema foetidum Tsiang, Gymnema griffithii Craib, Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnema reticulatum (Moon) Alston, Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult [6]

Bảng 1.2 Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R Br ở Việt Nam

TT Tên khoa học Tên thường dùng Phân bố

2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI

GYMNEMA R Br

2.1 Nhóm hợp chất saponin

Từ lá của Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult, các nhà khoa học đã

phân lập đƣợc hơn 50 saponin tritecpen, trong đó có hơn 40 hợp chất có khung olean, số còn lại có khung dammaran [33], [34], [36], [42], [45], [57], [69],

[71] Từ Gymnema alternifolium (Lour.) Merr có ít nhất 19 saponin khung

olean đã đƣợc phân lập [27], [40] Từ Gymnema inodorum (Lour.) Decne cũng

có 4 saponin khung olean đã đƣợc phân lập [70]

2.1.1 Saponin có khung olean

 Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

Các hợp chất saponin khung olean phân lập từ G sylvestre gồm các acid

gymnemic, gymnemasaponin, gymnemosid, gymnemasin,… Chúng có cấu tạo

từ khung olean (hình 1.1), khác nhau ở vị trí các nhóm thế ( hình 1.2) Ngoài ra, tại Việt Nam, năm 2011, Trần Văn Ơn và cộng sự đã phân lập đƣợc một

saponin có khung olean từ lá của G sylvestre là glochioeriosid A [5]

Hình 1.1 Cấu trúc khung olean của các hợp chất trong Gymnema sylvestre

(Retz.) R Br ex Schult

Hình 1.2 Cấu trúc các nhóm thế của hợp chất saponin khung olean trong

Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài G.sylvestre trên thế giới chủ yếu từ

mẫu thu tại Ấn độ và Trung Quốc, tuy cùng là các saponin tritecpen phân lập đƣợc từ cùng loài này nhƣng có một sự khác biệt rõ ràng, tất cả mẫu thu của Ấn

Độ đều có nhóm thế OH hay O-Glc tại ví trí C23, còn mẫu thu tại Trung Quốc thì không có nhóm OH gắn vào vị trí C23 [34], [42],[57] [71]

Bảng 1.3 Các hợp chất saponin có khung olean trong Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

3 Acid gymnemic III -glA CH2OH OH CH2OH OH -O-Mba [33, 36, 42, 45, 69]

4 Acid gymnemic IV -glA CH2OH OH CH2OH OH -O-Tga [33, 36, 42, 45, 69]

5 Acid gymnemic V -glA CH2OH OH CH2OH

-O-Tga -O-Tga [33, 36, 42, 45, 69]

6 Acid gymnemic VI -glA3-glc CH2OH OH CH2OH OH -O-Tga [33, 36, 42, 45, 69]

7 Acid gymnemic VIII -glA

10 Acid gymnemic XI -glA CH2OH OH - CH2O-Tga OH -O-Tga [34], [42]

11 Acid gymnemic XII -glA3-glc CH2OH OH CH2OCOCH

3

OH -O-Tga [34], [42]

14 Acid gymnemic XV -glA CH2OH OH CH2OH

20 Gymnemasaponin III H CH2O-glc OH CH2O-glc

32 Gymnemosid d H

-CH2glc6-glc6-glA

* Gymnema alternifolium (Lour.) Merr

Từ rễ của loài G alternifolium, tác giả Kazuko Yoshikawa đã phân lập

đƣợc 19 saponin có khung olean [27],[40]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học chung của các alternosid phân lập từ loài G

alternifolium (Lour.) Merr

Hình 1.4 Cấu trúc các nhóm thế trong các hợp chất alternosid phân lập

từ loài Gymnema alternifolium (Lour.) Merr Bảng 1.4 Cấu trúc hóa học các hợp chất alternosid phân lập từ Gymema

STT Tên chất R1 R2 R3 R4 TLTK

1 Alternosid 1 -glA3-glc O- Ac S4 H [27]

2 Alternosid II -glA3-glc OH S4 Ac [27]

3 Alternosid III -glA3-glc O-tig -rha H [27]

6 Alternosid VI -glA3-glc OH -glc H [27]

7 Alternosid VII -glA3-glc OH H H [27]

9 Alternosid IX -glA3-glc H -glc H [27]

10 Alternosid X -glA3-glc OH -rha H [27]

11 Alternosid XI -glA3-glc O-Tga H H [40]

12 Alternosid XII -glA3-glc OH -Tga H [40]

13 Alternosid XIII -glA3-glc OH H Tga [40]

14 Alternosid XIV -glA3-glc O-Tga -rha H [40]

15 Alternosid XV -glA3-glc O- Tga -fuc H [40]

16 Alternosid XVI -glA3-glc O- Tga -xyl H [40]

17 Alternosid XVII -glA O- Tga -rha H [40]

19 Alternosid XIX -glc6-glc6-xyl H -rha H [40]

 Gymnema inodorum (Lour.) Decne

Năm 2001, từ lá của G inodorum, tác giả Kazumasa Shimizu đã phân lập

đƣợc 4 hợp chất thuộc nhóm olean saponin là GiA-1, GiA-2, GiA-5 và GiA-7 [70] Cấu trúc phân tử của chúng đƣợc trình bày ở hình 1.5

Hình 1.5 Cấu trúc của một số saponin có khung olean phân lập từ loài

Gymnema inodorum (Lour.) Decne

Bảng1.5 Cấu trúc hóa học một số saponin có khung olean của Gymnema

inodorum (Lour.) Decne

Trong đó: -glc: β-D-glucopyranosyl, O-NMAt: -O-N-methylanthraniloxy

2.1.2 Saponin có khung damaran

Năm 1992, từ lá của G sylvestre, Kazuko Yoshikawa và cộng sự đã phân

lập đƣợc 12 saponin thuộc nhóm dammaran, gồm các gymnemasid I –VII, các gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII và LXIII [72] Cấu trúc của chúng đƣợc trình bày ở hình 1.6, 1.7, 1.8 và bảng 1.6

Hình 1.6 Cấu tạo của gymnemasid VI và gymnemasid VII

Hình 1.7 Cấu tạo chung của các gymnemasid I-V

Hình 1.8 Cấu trúc các nhóm thế trong các gymnemasid phân lập từ loài

Gynema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

Bảng 1.6 Một số saponin khung damaran phân lập từ Gymnema sylvestre

chiết ethanol thân G sylvestre mẫu thu ở tỉnh Quảng Tây 5 pregnan glycosid,

trong đó có 4 chất mới lần đầu tiên phân lập đƣợc từ Dây thìa canh, đặt tên là gymsylvestrosid ( A-D) [61]

 Gymnema alternifolium (Lour.) Merr

Năm 1998, từ rễ của G alternifolium, tác giả Kazuko Yoshikawa và

cộng sự đã phân lập đƣợc 6 polyoxypregnan glycosid là các gymnepregosid A-F [38] Nghiên cứu sau đó của cùng nhóm tác giả năm 1999 đã phân lập

đƣợc 11 polyoxypregnan glycosid khác từ rễ của G alternifolium là các

gymnepregosid G-Q [39]

2.2 Các nhóm chất khác

2.2.1 Nhóm flavonoid glycosid

Năm 2004, tác giả X Liu và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất flavonol

glycosid từ lá của G sylvestre là kaempferol α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-galactopyranosid, kaempferol 3-O- robinobiosid, rutin, quercetin 3-O-robinobiosid và tamarixetin 3-O-

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-robinobiosid [90]

Một nghiên cứu năm 2008 của Xu-Min Zhu và cộng sự đã phát hiện trong lá

của G sylvestre có sự hiện diện của kaemferol và isonoin [50]

Ở Việt Nam, năm 2011 Vũ Đình Doanh đã phân lập được từ lá của G.sylvestre hợp chất 3 , 4 , 5 , 7- tetrahydroxyflavon-3-O- α- L- rhamnopyranosyl - (1-6 )- β-D -glucopyranosid [3]

2.2.2 Nhóm chất polyphenol

Năm 1993, Kazutaka Miyatake và cộng sự đã phân lập hợp chất conduritol A

từ lá của Gymnema sylvestre [73]

Năm 2011, Vũ Đình Doanh đã phân lập được 2 hợp chất phytosterol là

stigmasterol và stigmasterol 3- β - D - glucopyranosid từ lá của Dây thìa canh

ở Thái Nguyên [3]

2.2.3 Peptid

Năm 1991, Toshiaki Imoto và cộng sự đã phân lập được 1 peptid có cấu tạo từ

35 amino acid và có khối lượng phân tử khoảng 4000 là gurmarin [14]

3 TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT VÀ CHỐNG TĂNG LIPID

HUYẾT CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R Br

Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của Dây thìa canh trên thế giới rất đa dạng, bao gồm tác dụng hạ đường huyết, chống tăng lipid huyết, chống loét, chống viêm và kháng khuẩn, chống stress, chống oxy hóa hay chống dị ứng và một số tác dụng khác Trong khuôn khổ Luận án này, chúng tôi tập trung tổng quan vào 2 tác dụng chính được nghiên cứu nhiều nhất là tác dụng hạ đường huyết và chống tăng lipid huyết

3.1 Tác dụng hạ đường huyết

3.1.1.Tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết toàn phần

Một số loài thuộc chi Gymnema như Gymnema sylvestre R Br ex Schult,

Gymnema montanum Hook.f, Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema ynnansense Tsiang, Gymnema hirsutum Wight & Arn, … có tác dụng hạ

đường huyết ở chuột đái tháo đường [10],[16], [23], [44], [48], [54], [63], [70]

Năm 2013, K Thangavel và V.A Doss đã nghiên cứu tác dụng của lá

Gymnema hirsutum trên chuột gây đái tháo đường bằng streptozotocin Kết quả cho thấy cao chiết cồn 50% của G hirsutum có tác dụng làm giảm nồng

độ đường huyết, giảm nồng độ HbA1C và tăng nồng độ insulin trong huyết

tương [23] Bên cạnh đó, G hirsutum cũng cải thiện các chỉ số về lipid huyết

ở chuột đái tháo đường [23] Nghiên cứu năm 2003 của nhóm tác giả Trung

quốc cho thấy cao chiết methanol từ lá của G yunnanense với liều lượng 100

mg/kg/ngày có tác dụng làm giảm nồng độ đường huyết lúc đói, giảm khối lượng cơ thể, giảm nồng độ đường huyết trong test dung nạp glucose huyết

trên chuột béo phì [10] G yunnanense cũng cho thấy có tác dụng làm giảm

nồng độ đường huyết và khối lượng cơ thể chuột đái tháo đường, cụ thể, sau

12 ngày sử dụng, nồng độ đường huyết của chuột đái tháo đường đã trở về mức bình thường (119 ± 3,3 mg/dl so với 240 ± 12,9 mg/dl) [10]

Năm 2007, K.M Ramkumar và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá tác dụng

của cao chiết ethanol từ lá của G.montanum trên chuột gây đái tháo đường bằng alloxan Kết quả cho thấy cao ethanol từ lá của G.montanum có tác dụng

làm giảm rõ rệt nồng độ glucose, glycoprotein trong huyết tương, tăng nồng

độ insulin trong huyết tương và tăng nồng độ các glycoprotein (hexose, hexosamin, sialic acid, fucose) trong gan và thận chuột đái tháo đường [50]

Nhóm nghiên cứu đã so sánh tác dụng của cao ethanol G.montanum liều

200mg/kg với glibenclamid 600μg/kg và cho thấy cao ethanol của

G.montanum cải thiện các chỉ số trên tốt hơn glibenclamid [48] Nghiên cứu

của tác giả Kunga Mohan Ramkumar và cộng sự (2011) chỉ ra rằng

phosphate dehydrogenase, giảm hoạt tính các enzym glucose -6-phosphatase

và fructose-1,6-bisphosphatase ở gan chuột đái tháo đường, do đó ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa glucose ở chuột [47]

Nghiên cứu năm 2010 của Ali Ahmeda và cộng sự cho thấy cao chiết

methanol từ lá của G.sylvestre có tác dụng cải thiện các chỉ số về khối lượng

cơ thể, khối lượng gan, tuyến tụy và glycogen ở gan chuột bị gây đái tháo đường bằng alloxan [18] Nhóm tác giả cũng đã quan sát mô bệnh học tuyến tụy của chuột bị gây đái tháo đường bằng alloxan và nhận thấy điều trị bằng

cao chiết methanol từ lá của G sylvestre có tác dụng hạn chế ảnh hưởng của

alloxan trên tế bào đảo tụy thông qua làm tăng một cách rõ rệt mức độ tái sinh của các tế bào β đảo tụy so với nhóm chứng [18] Năm 2012, R.Karthic và cộng sự cũng đã nghiên cứu đánh giá tác dụng của cao chiết ethanol 70% từ lá

của G sylvestre trên chuột gây đái tháo đường bằng alloxan Kết quả cho thấy

G sylvestre có tác dụng làm giảm một cách rõ rệt nồng độ đường huyết, nồng

độ insulin trong huyết tương và cải thiện các chỉ số khác như khối lượng cơ thể, glucose niệu, protein huyết tương và hemoglobin toàn phần trong máu [75]

Năm 2012, Aziza A.M El Shafey và cộng sự nghiên cứu tác dụng của cao

chiết ethanol từ lá G sylvestre với liều 18 mg/ kg thể trọng trên chuột gây đái

tháo đường typ 2 bằng chế độ ăn giàu chất béo (HDF) và tiêm streptozocin, kết quả ghi nhận được mức giảm đường huyết rõ rệt ( 20,2%) so với lô chuột

không dùng G sylvestre, cũng như nồng độ insulin trong máu tăng 83,4% so với lô chuột không dùng G Sylvestre [16]

3.1.2.Tác dụng hạ đường huyết của phân đoạn GS3, GS4

GS3, GS4 là phân đoạn giàu saponin chiết xuất từ lá G.sylvestre bằng cách

chiết với dung môi ethanol 50%, sau đó thêm acid tới pH bằng 3 rồi cô thu hồi dưới áp suất giảm thu được GS3 Từ GS3, hòa tan trong NaOH 0.1N, sau đó acid hóa tới pH 3, cô thu hồi dưới áp suất giảm, thu được GS4 [76]

Một nghiên cứu năm 1990 của Yoshinori Okabayashi và cộng sự đã đánh giá tác dụng của GS4 từ G sylvestre trên đường huyết của chuột bình thường

và chuột tăng đường huyết nhẹ Kết quả cho thấy ở liều 1g/kg, GS4 thể hiện tác dụng làm giảm nồng độ glucose trong máu chuột bình thường và chuột tăng đường huyết sau khi uống 1g glucose [63] Bổ sung GS4 vào chế độ ăn của chuột bình thường và chuột đái tháo đường với liều 1g/kg thể trọng/ngày cho thấy sau 32-35 ngày, nồng độ đường huyết giảm một cách rõ rệt và khả năng dung nạp glucose được cải thiện [67]

Nghiên cứu năm 1990 của E.R.B Shanmugasundaram và cộng sự đã đánh giá tác dụng của GS3 và GS4 trên chuột đái tháo đường và chuột bình thường Kết quả cho thấy với liều 20g GS3 hoặc GS4/chuột/ngày (120-150g/chuột), có tác dụng điều chỉnh đường huyết của chuột đái tháo đường về mức bình thường Cụ thể, chuột dùng GS3 có mức đường huyết bình thường sau 60 ngày Thời gian này đối với nhóm dùng GS4 là 20 ngày Đồng thời cả GS3 và

GS4 đều thể hiện tác dụng làm tăng nồng độ insulin trong huyết tương chuột Nghiên cứu sâu hơn về mô bệnh học cho thấy, số lượng tế bào đảo tụy và tế

bào β đều tăng lên gấp đôi ở cả hai nhóm [37]

Năm 1990, E.R.B Shanmugasundaram và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng điều trị của GS4 đối với bệnh nhân đái tháo đường type 1 Kết quả cho thấy điều trị bằng GS4 liều 400mg/ngày giúp làm giảm nhu cầu insulin, có thể do làm tăng lượng insulin có tác dụng; giảm nồng độ HbA1C và nồng độ glycosylate protein trong máu; kiểm soát tình trạng tăng lipid liên quan đến đái tháo đường; giảm hoạt tính của amylase huyết tương; tăng cường chức

năng của tế bào β đảo tụy thông qua tăng hoạt tính C-peptid huyết tương [24]

Năm 1988, Shanmugasundaram và cộng sự đã đánh giá tác dụng của phân đoạn GS4 từ lá của G sylvestre trên chuột đái tháo đường Kết quả cho thấy

GS4 với liều 20mg/ngày/chuột (albino rats 150 – 160g) có tác dụng làm giảm nồng độ đường huyết, tăng khả năng dung nạp glucose, tăng nồng độ insulin

Tác dụng này xuất hiện rõ rệt sau 8 tuần điều trị và còn tồn tại sau khi ngừng điều trị 4 tuần [46] Bên cạnh đó, với liều như trên, GS4 còn cải thiện các chỉ

số về hàm lượng carbohydrat (hexose, hexosamin, acid sialic) liên kết với protein trong các mô gan, thận, mô mỡ, mô cơ và mô ruột của chuột đái tháo đường [46]

Nghiên cứu in vitro cho thấy GS4 có tác dụng làm tăng cường giải phóng

insulin từ tế bào β đảo tụy thông qua làm tăng tính thấm của màng tế bào[25]

3.1.3.Tác dụng hạ đường huyết của các chất phân lập

Nghiên cứu năm 1993 của Kazutaka Miyatake và cộng sự đã cho thấy hợp

chất conduritol A, một polyol phân lập được từ Gymnema sylvestre có tác

dụng ức chế sự hấp thu glucose ở ruột, do đó có tác dụng làm giảm nồng độ đường huyết trong thí nghiệm dung nạp glucose [73] Nghiên cứu của cùng nhóm tác giả này năm 1994 cho thấy conduritol A có tác dụng làm giảm tỷ lệ đục thủy tinh thể ở chuột bị gây đái đường bằng streptozotocin [74]

Nghiên cứu năm 1997 của Masayuki Yoshikawa và cộng sự đã đánh giá tác

dụng của một số chất phân lập được từ G sylvestre lên nồng độ đường huyết ở

chuột đái tháo đường Kết quả cho thấy ở nồng độ 100 mg/kg, các hợp chất gymnemosid A, acid gymnemic III, V, VII có tác dụng làm giảm nồng độ đường huyết trên chuột đái tháo đường [45]

Năm 2000, Yoshitaka Sugihara và cộng sự đã đánh giá tác dụng của một số

chất phân lập được từ lá của G sylvestre lên chuột đái tháo đường Kết quả

cho thấy acid gymnemic IV ở liều 3,4-13,4 mg/kg có tác dụng hạ đường huyết

ở chuột gây đái tháo đường bằng STZ Ở liều 13,4 mg/kg, tác dụng hạ đường huyết của acid gymnemic IV tương đương glibenclamid liều 14,8 mg/kg Tuy nhiên acid gymnemic IV không thể hiện tác dụng lên đường huyết chuột bình thường, không thể hiện tác dụng ức chế enzym α-glucosidase ở màng tế bào thành ruột non Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy aicd gymnemic I, II, III và gymnemasaponin V ở liều 20 mg/kg tiêm tĩnh mạch cũng không thể hiện tác dụng lên nồng độ đường huyết của chuột [26]

Trong một nghiên cứu năm 2001, Kazumasa Shimizu và cộng sự đã đánh

giá ảnh hưởng của 4 triterpenoid từ lá của G inodorum lên nồng độ đường

huyết trên chuột Kết quả cho thấy 3 trong số chúng có tác dụng ức chế sự hấp thu glucose ở ruột, giảm nồng độ glucose huyết trong thí nghiệm dung nạp đường huyết [70]

Nghiên cứu năm 2009 của Pitchai Daisy và cộng sự cho thấy chất

dihydroxy gymnemic triacetate từ lá của G sylvestre có tác dụng đối với

chuột đái tháo đường do streptozotocin [29] Cụ thể, với liều 20 mg/kg/ngày, dihyroxy gymnemic triacetate có tác dụng làm giảm một cách có ý nghĩa nồng

độ glucose huyết, HbA1C, tăng nồng độ insulin trong huyết tương Ở liều ngày, dihydroxy gymnemic triacetat còn thể hiện tác dụng làm tăng nồng độ glycogen ở cơ và gan, giảm nồng độ cholesterol, TG, LDL trong máu, tăng nồng độ HDL trong máu, giảm nồng độ ASAT, ALAT trong huyết tương chuột đái tháo đường [29] Các tác dụng này thể hiện rõ rệt sau 45 ngày điều trị [29]

3.2 Tác dụng chống tăng lipid huyết

Năm 1994, Anupam Bishayee và Malay Chatterjee đã nghiên cứu tác dụng

của cao chiết cồn 50% từ lá của G sylvestre trên lipid huyết của chuột được

cho ăn chế độ ăn giàu chất béo Kết quả cho thấy với liều 25-100 mg/kg/ngày

trong 2 tuần, G sylvestre làm giảm một cách có ý nghĩa nồng độ TG, TC,

LDL trong máu chuột với chế độ ăn giàu chất béo Cao chiết cồn 50% từ lá

của G sylestre liều 100 mg/kg/ngày cho thấy kết quả tương đương với

clofibrat liều 100 mg/kg/ngày [43] Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy ở liều

này, G sylvestre có tác dụng làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch trên chuột

[43]

Nghiên cứu của Norihiro Shigematsu và cộng sự năm 2001 cho thấy cao

chiết cồn 50% từ lá của G sylvestre với liều 33 mg/kg có tác dụng làm giảm

đáng kể nồng độ TG, cholesterol và làm tăng nồng độ HDL-cholesterol trong

Nghiên cứu năm 2006 của Hong Luo và cộng sự cho thấy bổ sung cao chiết

nước từ lá của G sylvestre vào thức ăn của chuột béo phì với liều 62,5 g/kg có

tác dụng làm giảm trong lượng cơ thể 57,2% và 75,5% sau 1 và 2 tuần, giảm 1/3 lượng thức ăn và 2/3 lượng nước uống tiêu thụ hàng ngày [15] Tiếp tục theo dõi 3 tuần sau khi ngừng dùng cao chiết, không thấy có phản ứng ―dội

ngược‖ Bên cạnh đó, G sylvestre cũng điều chỉnh chuyển hóa lipoprotein

trên chuột béo phì, cụ thể làm giảm nồng độ LDL và VLDL cholesterol và tăng nồng độ HDL cholesterol trong huyết tương [15]

Nghiên cứu của Aziza A.M El Shafey và cộng sự năm 2012 cho thấy cao

G sylvestre thương mại với liều 18 mg/kg/ngày có tác dụng làm giảm nồng độ

triglycerid, cholesterol toàn phần, LDL-cholesterol và tăng nồng độ cholesterol ở chuột đái tháo đường [16] Tác dụng này thể hiện trên cả chuột bình thường [16]

Như vậy, đến nay đã có 5 loài trong chi Gymnema được nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết và chống tăng lipid huyết gồm có Gymnema sylvestre R

Br ex Schult, Gymnema montanum Hook.f, Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema ynnansense Tsiang, Gymnema hirsutum Wight & Arn trong

đó có các nghiên cứu trên dịch chiết toàn phần, từ các phân đoạn và từ các chất phân lập (Bảng 1.7)

Bảng 1.7 Tổng hợp một số tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi

Gymnema R.Br

Tên loài

Bộ phận dùng

G

sylvestre R Lá

Cao chiết methanol Hạ đường huyết [18], [43]

Br ex

ethanol

Hạ đường huyết [44],[54],[63], [75] Chống tăng lipid huyết [43], [62]

Cao chiết nước

Hạ đường huyết [44]

Chống tăng lipid huyết [15]

Hỗn hợp các acid gymnemic

Làm mất cảm giác ngọt [42]

GS3 Hạ đường huyết [37]

GS4 Hạ đường huyết [ 24],[25], [46], [67]

Gymnemosid A, Acid gymnemic III, V, VII

α-Thân Cao chiết

4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT SAPONIN TRONG MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

4.1 Phương pháp định lượng và đánh giá động thái tích lũy hoạt chất

Các nghiên cứu đánh giá động thái tích lũy hoạt chất thường được tiến hành

để so sánh hàm lượng hoạt chất trong cây theo tuổi cây, thời điểm sinh trưởng hoặc theo thời gian thu hái trong năm Điều này giúp ích cho việc xác định tuổi thu hái dược liệu cho hàm lượng hoạt chất cao nhất cũng như thời điểm thu hái tối ưu, giúp nâng cao chất lượng dược liệu hay nâng cao hiệu suất chiết xuất hoạt chất Phương pháp định lượng hoạt chất trong dược liệu thường dùng hiện nay là phương pháp sắc ký HPLC [31], [78], [86]

Hoạt chất đem định lượng và so sánh có thể là các chất cụ thể như các ginsenosid trong nhân sâm, cũng có thể là các aglycon thu được sau phản ứng thủy phân các saponin, được xem là chất đánh dấu đại diện cho nhóm chất như gymnemagenin với Dây thìa canh hay acid oleanolic với Ngưu tất, điều này có thể lý giải thành phần các chất saponin có công thức đa dạng, hàm lượng khác nhau và thường rất nhỏ, khó phân tách thường quy do vậy cần phải tìm cách thủy phân để làm giàu trước khi định lượng [31], [78], [86]

4.2 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo tuổi cây

Nghiên cứu của Zhi Liu và công sự năm 2017 đánh giá tích lũy các hoạt chất thông dụng đã được tìm thấy ở nhân sâm là các ginsenosid, bao gồm các ginsenosid trung tính thông thường (Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc và Rd), các ginsenosid acid oleanolic (Ro), và Malonyl ginsenosid (mRb1, mRb2, mRc và mRd)[86]

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng của ginsenosid Rg1, Re, Ro tăng lên theo năm thu hái, nhưng có tỷ lệ khác nhau, hàm lượng Ro trong rễ nhân sâm 6 năm tuổi tăng lên 9 lần so với 2 năm tuổi, trong khi đó hàm lượng Re

và Rg1 tăng lên không nhiều ( Hình 1.9) Ginsenosid Rg1 có hàm lượng cao nhất khi thu hái vào tháng 10, trong khi Re có hàm lượng cao nhất khi thu hái

ở tháng 5[86]

Hình 1.9 Sự thay đổi hàm lượng ginsenosid Rg1, Re và Ro trong rễ nhân

sâm theo tuổi thu hái [86]

4.3 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời gian thu hái trong năm

Nghiên cứu của Suman Singh và cộng sự trên các mẫu lá cùng cây Dây thìa

canh 8 năm tuổi thu hái vào cùng ngày 15 hàng tháng, trong 12 tháng liên tục

trong năm (2010 -2011), tại Vườn thử nghiệm Viện nghiên cứu cây làm

Thuốc và hương liệu Lucknow, miền Trung Ấn độ Các mẫu lá thu hái được

làm khô theo 4 cách khác nhau: Phơi trong bóng râm, sử dụng vi sóng, sử

dụng tủ sấy, phơi dưới ánh mặt trời Mẫu sau khi thu được thủy phân bằng

dung dịch acid - bazơ, rồi định lượng gymnemagenin bằng phương pháp

HPLC với máy hiệu Shimadzu LC10A, pha động là hệ dung môi MeCN:H2O

(nồng độ50:50), tốc độ chảy 0,6ml/phút

Kết quả cho thấy hàm lượng GM thay đổi khá lớn giữa các tháng từ 0,24%

đến 1,23% Lượng GM ghi nhận thấp nhất vào mùa đông ở tháng 12, cao nhất

vào mùa hè, đặc biệt là ở tháng 5 với mẫu lá thu hái và phơi khô bằng phương

pháp phơi trong bóng râm [78]

Bảng 1.8 Hàm lượng gymnemagenin trong các mẫu DTC thu theo tháng

với các cách làm khô khác nhau [78]

Trong một nghiên cứu năm 2009, Shirugumbi Hanamanthagouda Manohar

và cộng sự đã định lượng hàm lượng acid gymnemic II với bộ phận dùng là lá

DTC, kết quả cho thấy hàm lượng acid gymnemic II trong lá non cao hơn

trong lá già (35,39 mg/g so với 23,07 mg/g) Nghiên cứu cũng so sánh và chỉ

ra hàm lượng acid gymnemic II trong đốt non, đốt bánh tẻ và đốt già đều cao

hơn trong lá, trong khi đó hàm lượng trong cành non, cành bánh tẻ và già đều

thấp hơn trong lá Tuy nhiên sự chênh lệch về hàm lượng không nhiều, dao

động từ 23,94 – 26,47 mg/g đối với lóng, 27,96 – 29,66 mg/g đối với đốt và 27,67 đối với lá [48]

Hình 1.10 Hàm lượng acid gymnemic II tại tại các bộ phận của Gymnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult [51]

Nhóm tác giả Jinting Li và Zhenghai Hu đã tiến hành nghiên cứu động thái

tích lũy nhóm saponin tritecpen trên cây Ngưu tất, được trồng bằng gieo hạt tại vườn Thực vật thuộc trường Đại học Tây Bắc Trung Quốc từ đầu tháng 7/

2006, các mẫu rễ, thân lá được thu hoạch vào các thời điểm từ đầu tháng 8/

2006 đến đầu tháng 12/ 2006 Mẫu thu được chiết xuất bằng methanol, dịch chiết được thủy phân bằng acid HCl nồng độ 4 mol/ lít ở 85 độ C trong 1 giờ Chất thu được sau thủy phân được đem định lượng acid oleanolic bằng phương pháp HPLC[31]

Kết quả cho thấy mẫu thu đầu tháng 8 cho hàm lượng cao nhất lần lượt ở rễ, thân và lá là 7,76%; 4,09 và 4,13%, cũng là tháng có tỷ lệ tích lũy OA cao nhất, đây là giai đoạn cây đang sinh trưởng mạnh, các chất được sinh tổng hợp chuyển vào rễ và phần trên mặt đất Đến giai đoạn đầu tháng 9, là giai đoạn cây sinh sản, lượng OA ở rễ và thân giảm xuống nhanh chóng, điều này được

lý giải do cây phải dùng chất dinh dưỡng để phát triển cơ quan sinh sản Ở tháng tiếp theo, khi đến giai đoạn quả chín, lượng chất dinh dưỡng tiêu thụ giảm, hàm lượng OA trong rễ lại tăng và có xu hướng ổn định, cũng như hàm

giảm dần và biến mất khi lá chuyển vàng và bắt đầu héo, các tác giả cho rằng thời điểm thu hái tốt nhất của Ngưu tất là tháng 11, khi hàm lượng saponin tritecpen trong rễ đạt mức ổn định cao đồng thời khối lượng rễ đạt mức cao nhất [31]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu được sử dụng trong các thí nghiệm là mẫu lá Dây thìa canh được thu hái tại vùng trồng của công ty Nam Dược tại xã Hải Lộc, huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 6 năm

2017 và được xác định tên khoa học là Gymnema sylvestre R Br ex Schult

bởi PGS.TS Trần Văn Ơn, Trường Đại Học Dược Hà Nội và TS Trần Thế Bách, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Mẫu nghiên cứu được lưu tại Bộ Môn Thực vật, trường Đại Học Dược Hà Nội

Mẫu lá DTC thu tháng 7 năm 2016 được dùng để phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất hóa học, thử tác dụng sinh học dịch chiết toàn phần cũng như các chất phân lập được 12 mẫu lá DTC thu trên cùng 1 khóm cây 5 năm tuổi lần lượt từng tháng từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017 được dùng để đánh giá động thái tích lũy hoạt chất

Bảng 2.1 Thời gian thu mẫu G.sylvestre R Br ex Schult

Hình 2.1 Khóm cây Dây thìa canh tại vùng trồng Hải Hậu, Nam Định

làm nguồn thu mẫu ngày 15/7/2016 2.1.2 Vật liệu, dung môi, hóa chất

- Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập và thủy phân như Ethanol,

methanol (MeOH), n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan

(CH2Cl2), acetonitril, acid HCl, nước cất đạt tiêu chuẩn phân tích (Daejung - Hàn Quốc)

- Enzym Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B, human, recombinant) được mua từ Enzo Life Sciences (M )

- Dòng tế bào 3T3-L1 do ATCC, M cung cấp

- P-nitrophenyl phosphate (p-NPP); dithiothreitol (DTT); acid ursolic;

dexamethason; 3-isobutyl-1-methyl-xanthine; 2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid (MTT) được mua từ công ty Sigma - Aldrich, M

(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl) Môi trường Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM); fetal bovine serum (FBS) mua từ Hyclone, UT, M

(2 Phosphat buffered salin (PBS) (Takara Bio Inc, Nhật Bản)

- Streptozotocin lọ 1g của hãng Sigma-Aldrich, Singapore

- Diamicron (gliclazid) viên nén 30 mg do hãng Servier (Pháp) sản xuất

- Dung dịch đệm citrat pH 4.5

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

- Sắc ký cột pha thuận được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha