BÁO CÁO ĐỒ ÁN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM XÁC ĐỊNH AURAMINE O, RHODAMINE B, PARAROSANILINE TRONG THỰC PHẨM ĐÃ CHẾ BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

BÁO CÁO ĐỒ ÁN, PHÂN TÍCH THỰC PHẨM , XÁC ĐỊNH AURAMINE O, RHODAMINE B, PARAROSANILINE ,TRONG THỰC PHẨM ĐÃ CHẾ BIẾN, BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM -o0o BÁO CÁO ĐỒ ÁN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM XÁC ĐỊNH AURAMINE O, RHODAMINE B, PARAROSANILINE TRONG THỰC PHẨM ĐÃ CHẾ BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GVHD: Ths Phan Thị Xuân SVTH: Nguyễn Phương Giang LỚP: 04DHDB1 MSSV: 2022130023 Tp Hồ Chí Minh, Tháng 5/2016 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô trường Đại học công nghiệp thực phẩm TP.HCM, đặc biệt thầy cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường tạo điều kiện cho em thực đồ án mơn học để có nhiều kinh nghiệm cho khóa luận tốt nghiệp Và em xin chân thành cảm ơn cô Phan Thị Xn nhiệt tình hướng dẫn em hồn thành tốt đồ án mơn học phân tích thực phẩm Trong q trình thực đồ án khó tránh khỏi sai sót, mong thầy bỏ qua Đồng thời trình độ lý luận kinh nghiệm làm đồ án chưa có nên báo cáo khơng thể tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp Thầy, Cơ để em học hỏi thêm nhiều kinh nghiệm hoàn thành tốt báo cáo tốt nghiệp tới Em xin chân thành cảm ơn ! TP.HCM,ngày 19 tháng năm 2016 Sinh viên thực Nguyễn Phương Giang i Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Sinh viên : Nguyễn Phương Giang MSSV 2022130023 Nhận xét : Điểm đánh giá: Ngày … tháng … năm 2016 ( ký tên, ghi rõ họ tên) ii Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN Sinh viên : Nguyễn Phương Giang MSSV 2022130023 Nhận xét : Điểm đánh giá: Ngày … tháng … năm 2016 ( ký tên, ghi rõ họ tên) iii Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP MỤC LỤC DANH SÁCH HÌNH ẢNH DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương Auramine O[1] 1.1.1 Công thức cấu tạo 1.1.2 Đặc tính hóa lý 1.1.3 Ứng dụng: 1.1.4 Độc tính AO 1.2 Đại cương Rhodamine B[2] 1.2.1 Công thức cấu tạo 1.2.2 Đặc tính hóa lý: 1.2.3 Ứng dụng: 1.2.4 Độc tính Rhodamine B 1.3 Một vài nét Pararosaniline[3] 1.3.1 Công thức cấu tạo 1.3.2 Đặc tính hóa lý 1.3.3 Ứng dụng 1.3.4 Độc tính PA Chương 2: THỰC NGHIỆM[4] 2.1 Hóa chất cần sử dụng 2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 2.3 Chuẩn bị mẫu 2.4 Kiểm tra hiệu suất thu hồi xác nhận phương pháp 10 2.5 Phân tích HPLC 10 2.6 Phân tích TLC 11 GVHD: Phan Thị Xuân Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP 2.7 Phân tích LC/MS 11 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN[4] 12 3.1 Tối ưu hóa việc chuẩn bị dung dịch mẫu 12 3.2 Tối ưu hóa trình làm cột chiết pha rắn 12 3.3 Tối ưu hóa điều kiện HPLC 15 3.4 Kiểm chứng phương pháp 16 3.5 TLC 18 3.6 LC/MS 19 KẾT LUẬN 21 TÀI LIỆU KHAM KHẢO 22 GVHD: Phan Thị Xuân Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP DANH SÁCH HÌNH ẢNH Hinh 1.1 Cơng thức cấu tạo AO[4] Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo RB[4] Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo PA[4] Hình 3.1 Hiệu suất (%) thu hồi PA từ cột Oasis HLB điều kiện pH khác nhau[4] 13 Hình 3.2 Hiệu suất thu hồi (%) PA, AO, RB làm cột Oasis HLB sử dụng dung môi rửa giải khác nhau: 1% acetic acid THF:MeOH (1:4) (A) 1% acetic acid MeOH (B) [4] 14 Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC (tại 450 550 nm) dung dịch chuẩn PA, AO, RB (0.1µg/mL) giá trị pH khác (pH 6.5, 4.5, 3.5) [4] 16 Hình 3.4 Sắc ký đồ (tại 450 550nm) dung dịch chuẩn PA, AO RB (0.1µg/mL), mẫu trắng mẫu từ bột cà ri nhão[4] 18 Hình 3.5 Sắc ký đồ TLC dung dịch chuẩn (STD), mẫu trắng (BK), mẫu (SMP) từ bột cà ri nhão 254 366nm, ánh sáng trắng sử dụng hệ thống dung môi A [2-butanone-methanol-5%Na2SO4 (1:1:1, v/v/v)] B [2-butanone-methanol- 1.6M ammonium formate (pH 2.5) (7:2:7, v/v/v)] [4] 19 GVHD: Phan Thị Xuân Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT PA AO RB HPLC PDA TLC LC LC/MS THF EtOH HLB RSDr RSDR LOD LOQ ODS ESI SIM RT Pararosaniline Auramine O Rhodamine B Sắc ký lỏng hiệu cao Photodiode array detector Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lỏng Sắc ký lỏng ghép detector khối phổ Tetrahydrofuran Ethanol Hydrophilic lipophilic balance Độ xác ngày Độ xác nhiều ngày Giới hạn định tính Giới hạn định lượng Octadecylsilane Ion hóa tia điện Selected Ion Monitoring Thời gian lưu GVHD: Phan Thị Xuân Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP LỜI MỞ ĐẦU Màu thực phẩm tổng hợp sử dụng toàn giới để tránh màu sắc ban đầu thực phẩm sau chế biến, đồng thời làm cho sản phẩm thực phẩm hấp dẫn mắt người tiêu dùng Màu thực phẩm tổng hợp có nhiều ưu điểm vượt trội so với màu thực phẩm tự nhiên giá trị màu sắc, tính đồng khả áp dụng cho nhiều loại thực phẩm Màu thực phẩm tổng hợp ủy quyền quy định liều lượng sử dụng cho thực phẩm nhiều quốc gia Tuy nhiên việc sử dụng số chất màu pararosaniline (PA), auramine O (AO) Rhodamine B (RB) coi trái phép số quốc gia Nhật Bản, EU Hoa Kỳ Vì việc sử dụng PA AO thực phẩm gây ảnh hưởng xấu cho người sử dụng độc tính chất xếp vào nhóm 2B Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế cơng bố (2010) RB chứng minh có gây ngộ độc cho người động vật Tuy bị cấm sử dụng thực phẩm, chất màu phát nhiều loại thực phẩm số nước phát triển Malaysia, Philippines, Ấn Độ, Argentina Trung Quốc Tại Việt Nam, thời gian vừa qua, quan chức phát nhiều vụ việc sở kinh doanh có sử dụng AO trộn vào thức ăn cho gà thời gian chăn nuôi để tạo màu vàng bắt mắt cho da thân, da chân gà lịng đỏ trứng gà Ngồi nhiều vụ việc măng, dưa cải muối chua ngâm AO để tạo màu vàng tự nhiên phát khắp nước RB phát có sử dụng để tạo màu đỏ cho tương ớt, bột ớt hạt dưa Vì việc nghiên cứu xác định hàm lượng chất màu vấn đề cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng Mặc dù có số phương pháp phát xác định chất màu thực phẩm, phương pháp lại có số nhược điểm tốn thời gian thực hiện, khơng ứng dụng hồn tồn vào loại thực phẩm khác khơng có phương pháp xác định đồng thời PA, AO RB Vì phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng detector photodiode array (HPLC-PDA) hữu dụng việc xác định phát PA, AO, RB hàm lượng thấp (khoảng 0.5 µg/g) nhiều loại thực phẩm Ngồi ra, cịn đề cập đến hai phương pháp khác phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) phương pháp sắc ký lỏng ghép detector khối phổ (LC/MS), phương pháp TLC có ưu điểm chi phí thấp, nhanh chóng, đơn giản, cho phép phát chất màu Còn phương pháp LC/MS dùng để định tính chất màu Các phương pháp áp dụng cho loại thực phẩm giàu chất béo, sản phẩm chứa ớt (gochujang tương ớt), thực phẩm giàu protein ( bột tôm súp bột) Dựa kết nghiên cứu phân tích hàm lượng AO, RB PA mẫu thực phẩm mà đánh giá vấn đề an tồn thực phẩm sở sản xuất GVHD: Phan Thị Xuân Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương Auramine O[1] 1.1.1 Công thức cấu tạo Auramine O hợp chất hóa học, sử dụng để làm thuốc nhuộm cho công nghiệp Các tên gọi khác: C.I 41000; Basic Yellow 2; Canary yellow; Pyoktaninum aureum; 4,4'-(imidocarbonyl)bis(N,N-dimethylaniline)monohydrochloride Công thức phân tử C17H21N3.HCl Phân tử khối 303.8 Công thức cấu tạo Auramine O Hinh 1.1 Công thức cấu tạo AO[4] 1.1.2 Đặc tính hóa lý AO tinh thể có màu vàng kim, khơng mùi, tan tốt nước tan ethanol Nhiệt độ nóng chảy 267.2oC 1.1.3 Ứng dụng: Trong y học, AO sử dụng để nhuộm màu vi khuẩn Mycobacterium, nhờ khả liên kết với mycolic acid thành tế bào loại vi khuẩn Tương tự thuốc nhuộm Ziehl-Neelsen, AO sử dụng làm thuốc nhuộm huỳnh quang Schiff AO kết hợp với RB tạo thành thuốc nhuộm auramine-rhodamine Chất sử dụng chất khử trùng làm thuốc nhuộm vi khuẩn Lao (Mycobacterium tuberculosis) AO dùng công nghiệp nhuộm vải, giấy, gỗ … dùng làm màu sơn qt tường, ngồi cịn sử dụng việc in ấn, tạo màu loại mực AO khuyến cáo sử dụng công nghiệp, tuyệt đối không sử dụng thực phẩm, chăn nuôi chất bị cấm sử dụng (Thông tư số 42/2015/TTBNNPTNT ngày 16/11/2015 Bộ Nông nghiệp PTNT Danh mục bổ sung hóa chất, GVHD: Phan Thị Xuân Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP Tuy chưa xác định nồng độ tối thiểu cho phép RB tích tụ dần thể, gây nhiều tác hại gan thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh tác nhân nghi ngờ gây ung thư 1.3 Một vài nét Pararosaniline[3] 1.3.1 Công thức cấu tạo Giống AO RB, Pararosaniline hợp chất hóa học sử dụng làm thuốc nhuộm công nghiệp Công thức phân tử C19H18ClN3 Phân tử khối 323.83g/mol Công thức cấu tạo PA Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo PA[4] 1.3.2 Đặc tính hóa lý PA tồn dạng tinh thể màu xanh cây, không mùi Nhiệt độ nóng chảy khoảng 268 – 270oC Ít hịa tan nước, độ hòa tan nước 10g/l 25oC 1.3.3 Ứng dụng PA chất hoá học dùng để nhuộm giấy, màu sơn, vải sợi, da nhựa; tuyệt đối cấm sử dụng thực phẩm thuố PA khơng có tên Danh mục phụ gia sử dụng thực phẩm Bộ Y tế 1.3.4 Độc tính PA PA xếp vào nhóm 2B (nhóm chất gây ung thư cho người) Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế công bố (2010) GVHD: Phan Thị Xuân Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM[4] 2.1 Hóa chất cần sử dụng Tất dung dịch sử dụng phương pháp chuẩn bị nước tinh khiết Milli-Q Ammonium acetate, sodium hydroxide, ammonium formate, sodium sunfate, hydrochloric acid, tetrahydrofuran (THF), ethanol (EtOH) acetic acid mua từ Wako Pure Chemical Industry,Ltd (Osaka, Japan) 2-butanone, ethyl acetate hexane mua từ Kanto Chemical Co., Inc (Tokyo Japan) Dung môi methanol acetonitrile cung cấp bới Merck (Darmstadt, Germany) Chất chuẩn RB (độ tinh khiết 98.3%) mua từ Wako Pure Chemical Industry,Ltd., chất chuẩn AO (độ tinh khiết 90.8%) PA (độ tinh khiết 94.4%) mua từ Chroma Technology Corp Acros Organics (Geel, Belgium) Dung dịch NaCl bão hịa có chứa 0.1M NaOH chuẩn bị cách hòa tan 4g NaOH 1L dung dịch NaCl Dung dịch amoni formate 1.6M (pH 2.5) chuẩn bị cách cân xác 10g amoni formate hịa tan vào 50 mL nước, chuyển dung dịch vào bình định mức 100mL, sau điều chỉnh pH 2.5 formic acid Địch mức tới vạch nước 2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Các dung dịch chuẩn gốc AO, RB, PA chuẩn bị cách hòa tan chuẩn methanol bình định mức với nồng độ 1mg/mL (Tức 1000ppm) Các dung dịch chuẩn gốc pha loãng với methanol thành nồng độ 250ppm 25ppm dùng để kiểm tra hiệu suất thu hồi Để dựng đường chuẩn, Dung dịch chuẩn gốc pha lỗng methanol có chứa 1% acid acetic thành dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0.05, 0.1, 0.5, µg/mL 2.3 Chuẩn bị mẫu Tất mẫu thực phẩm bột cà ri nhão, tương ớt, gochujang, gà tandoori, bột tôm súp bột thu thập từ chợ Tokyo Mẫu rắn đồng cách cắt xay nhuyễn, cân xác 5g mẫu hịa tan 20mL dung dịch chứa 0.1M HCl: Ethanol (1:2) Lắc dung dịch mẫu vòng phút thêm 20mL ethyl acetate, sau khuấy trộn thêm phút Cuối cùng, dung dịch ly tâm 3000 vòng/phút (1500 – 2000g) phút Chất lỏng lên bỏ vào phễu chiết Thực lần tương tự với lượng kết tủa cịn sót lại Chất lỏng lên bề mặt đổ vào phễu chiết sử dụng ethyl acetate làm dung GVHD: Phan Thị Xuân Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP môi để chiết Sau thêm 1mL NaOH 2.5M (trừ bột tơm) thêm 50mL dung dịch NaCl bão hòa (chứa 0.1M NaOH) đến lớp chiết ethyl acetate phễu chiết Lắc hỗn hợp tháo bỏ lớp cuối Sau thêm 40mL hexane 20mL HCl 0.1M đến lớp chiết ethyl acetate lại phễu chiết lại lắc hỗn hợp Các chất màu chiết đến lớp sau bỏ vào bình định mức 100mL Thêm 20mL HCL 0.1M vào lớp lại khuấy trộn lớp thu thập (với phần cịn lại) vào bình định mức 100mL Định mức tới vạch nước Lấy 20mL dung dịch chuẩn bị phía điều chỉnh pH từ 10 -12 (sử dụng NaOH 2.5M) Hỗn hợp sử dụng để tối ưu hóa q trình làm cột chiết pha rắn Cột rửa 10mL nước Mill-Q tách rửa 4mL acetic acid 1% methanol Thêm lượng methanol có chứa acetic acid vào hỗn hợp để có thể tích cuối 5mL dung dịch mẫu cho thí nghiệm HPLC 2.4 Kiểm tra hiệu suất thu hồi xác nhận phương pháp Kiểm tra hiệu suất thu hồi thực để đánh giá độ phương pháp Thêm 0.1mL dung dịch chuẩn (25 µg/mL) vào 5g bột tơm, bột súp, bột cà ri nhão, tương ớt, gochujang, thịt gà tandoori (thái cắt) khơng có PA, AO, RB Các mẫu giữ nhiệt độ phòng 30 phút sau xử lý tương tự bước “chuẩn bị mẫu” Đường chuẩn xây dựng với dung dịch chuẩn PA, AO, RB nồng độ 0.05- 50 100µg/mL nhằm kiểm tra độ tuyến tính đường chuẩn Độ xác ngày (RSDr ) độ xác nhiều ngày (RSDR ) đánh giá cách phân tích mẫu bột cà ri nhão giống hệt thêm chuẩn PA, AO, RB (0.5µg/g) ngày năm ngày khác Các giới hạn định tính (LOD) định lượng (LOQ) PA, AO RB ước lượng tỷ lệ S/N >3 S/N > 10 peak dung dịch chuẩn 2.5 Phân tích HPLC Hệ thống LC gồm Hewlett Packard 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) có chứa đầu dị PDA G1315A (theo dõi 550nm PA RB, 450nm AO), cột L (octadecylsilane (ODS), i.d: 4.6mm x 150mm; kích cỡ hạt: 5µm; kích thước lỗ: 12 nm ) gia nhiệt cột 40°C Các pha động gồm: Pha động A: ammonium acetate (20mmol/L), có pH=4,5 (được điều chỉnh cách thêm giọt acetic acid) Pha động B: acetonitrile Các điều kiện Gradient sau: (1) Gradient tuyến tính từ 20% đến 60% pha động B (trong vòng 15 phút) (2) rửa giải isocratic 60% pha động B (5 phút) GVHD: Phan Thị Xuân 10 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP Thể tích tiêm 20µL với tốc độ dịng 1.0mL/phút Các phận máy kiểm soát (và liệu thu thập phân tích) phần mềm Agilent Chem-station 2.6 Phân tích TLC Thí nghiệm TLC thực TLC RP- 18 từ Merck có kích cỡ: 20cm x 20cm, TLC RP- 18 cắt thành nhiều đoạn có kích cỡ 10cm x 10cm Lấy xác 2mL dung dịch mẫu, lọc khí nitơ nhiệt độ phịng đặc đến 0.2mL Chấm 5- 20µL dung dịch mẫu 1-4µL dung dịch chuẩn chất màu lên sắc ký, khoảng 20mm từ đáy lên ống mao quản có dung tích 5µL Các có kích cỡ 10cm x 10cm nâng lên 7cm buồng phát triển bão hịa Các dung mơi rửa giải 2-butanone-methanol-5 w / w% Na2SO4 (1: 1: 1, v / v / v) (hệ thống dung môi A) 2-butanone-methanol-1.6M amoni formate (pH 2.5) (7: 2: 7, v / v / v) (hệ thống dung môi B) Sau kết thúc q trình sắc ký, sấy khơ nhiệt độ phòng quan sát ánh sáng trắng, 254nm cho RB 366nm cho AO RB Ghi nhận kết cách sử dụng dụng cụ quan sát TLC (Camag) 2.7 Phân tích LC/MS Phân tích LC thực cách sử dụng thiết bị HPLC-electrospray ionization -MS (HPLC-ESI-MS) từ Shimadzu (LCMS-2010; Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản) Quá trình tách sắc ký thực pha nghịch đảo HPLC cột L- ODS (i.d: 2.1mm x 150mm, kích thước hạt: 5µm; kích thước lỗ: 12nm) Pha động gồm 20mmol/L ammonium acetate (pH 4.5) (pha động A) acetonitrile (pha động B) Điều kiện Gradient sau: (1) Một gradient tuyến tính từ 20% đến 60% pha động B (trong vòng 15 phút) (2) Rửa giải isocractic 60% pha động B (5 phút) Tốc độ dòng chảy 0,2 mL / phút thể tích tiêm µL; lị cột trì 40 ° C Các dung dịch mẫu tiêm phân tích ESI (+) với chế độ theo dõi ion chọn lọc (SIM) sử dụng khối lượng ion chọn lọc m/z 288 [PA-Cl], m/z 268 [AO-Cl], m/z 443 [RB-Cl-H] cho đầu dò LC / MS GVHD: Phan Thị Xuân 11 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN[4] 3.1 Tối ưu hóa việc chuẩn bị dung dịch mẫu Để tối ưu hóa điều kiện chiết mẫu, kiểm tra thời gian chiết số lần chiết 0,1M HCl: ethanol (1: 2) ethyl acetate làm dung môi chiết Để loại bỏ tạp chất dung dịch sau chiết, sử dụng dung dịch bão hòa NaCl chứa 0,1M NaOH (để bazơ hóa dung dịch bão hịa NaCl) Biện pháp giúp loại bỏ tạp chất dung dịch chiết xuất từ ớt bột Để loại bỏ tạp chất hiệu từ mẫu chiết ớt bột, nên thêm dung dịch bão hịa NaCl có chứa 0.1M NaOH vào lớp chiết ethyl acetate, dung dịch chiết thơng thường dự kiến có độ pH 9-11 Tuy nhiên, trường hợp tương ớt, độ pH < Quan sát cho thấy có lượng PA lớp chiết ethyl acetate ảnh hưởng mẫu Sự có mặt chất đặc giấm tương ớt gây lượng PA cịn sót lại lớp NaCl /NaOH Để ngăn chặn mát này, thêm 1mL NaOH 2,5M đến dung dịch chiết lớp chiết ethyl acetate trước thêm dung dịch bão hịa NaCl có chứa NaOH Rõ ràng, PA ảnh hưởng đến trình chiết lớp ethyl acetate biện pháp dự kiến Từ kết này, kết luận pH lớp chiết ethyl acetate khơng đủ để kiềm hóa tác động mẫu thực phẩm, cách giải thêm lượng NaOH 2,5M để điều chỉnh độ pH mơi trường kiểm 3.2 Tối ưu hóa trình làm cột chiết pha rắn Một số cột chiết pha rắn octadecyl silica (ODS; Gagliardi et al 1996), styrenedivinylbenzene polymeric surfaces (Strata-X, Strata-SCX, Oasis HLB, Sep-abeads SP70; Mitrowska et al 2005; Lee et al 2006; Chiang et al năm 2011; Soylak et al 2011), nhôm cột trao đổi cation mạnh (Halme et al 2004), cột immune affinity (Xie et al 2013), polyamide (Dixit et al 2011) sử dụng để làm thuốc nhuộm tổng hợp từ loại thực phẩm, sản phẩm mỹ phẩm, mô Chiang et al (2011) Soylak et al (2011) báo cáo polyme stylene-divinylbenzene có hiệu làm thuốc nhuộm RB malachite green từ thực phẩm Do đó, chúng tơi cố gắng làm chất màu dung dịch chuẩn bị cách sử dụng cột chiết có chứa polymer stylene-divinylbenzene (Oasis HLB) AO, RB giữ lại cột chiết, cịn PA chảy khỏi cột chiết, chúng tơi tin việc PA chưa lọc khỏi cột chiết điện tích dương Do đó, chúng tơi thêm dung dịch kiềm vào dung dịch chuẩn bị sau pha lỗng với nước cất để trung hịa điện tích thuốc nhuộm GVHD: Phan Thị Xuân 12 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP Theo dự kiến (xem hình 3.1), chúng tơi thấy PA sau giữ lại cột chiết mẫu phục hồi đáng kể Hình 3.1 Hiệu suất (%) thu hồi PA từ cột Oasis HLB điều kiện pH khác nhau[4] Dung dịch chuẩn bị pha loãng ba lần với nước để làm giảm ảnh hưởng dung môi hữu RB AO giữ lại Oasis HLB, cịn PA khơng Do chúng tơi kiểm tra độ pH dung dịch rửa giải có ảnh hưởng đến lưu giữ PA Để đạt điều này, dung dịch pha loãng chuẩn bị từ mẫu tương ớt thêm chuẩn, điều chỉnh pH=9 cách sử dụng 10% nước có chứa amoni pH=12 sử dụng 0,5M NaOH 8mL NaOH 2,5M Các mẫu sau cho vào Oasis HLB, 1mL thành phần rút Như thể Hình 3.1, trường hợp dung dịch pha loãng chuẩn bị cách sử dụng 10% nước amoni (pH=9) NaOH 0.5M (pH=12), pH có tính axit nhẹ có 30% - 50% PA không giữ lại cột chiết Mặt khác, PA chứa dung dịch pha loãng sử dụng 8mL NaOH 2,5M (pH =12) giữ lại cột chiết nhiều Thu hồi 90% PA cách rửa giải với 1% axit axetic methanol:THF (4: 1) Dung dịch sử dụng làm chất rửa giải, 90% RB, AO, PA tách rửa hiệu 1mL (Hình 3.2A) Tuy nhiên, chất màu sau rửa giải từ cột chiết sử dụng 1% acetic acid methanol: THF (4: 1), peak tương ứng với màu rộng, độ nhạy AO thấp, chí pH thay đổi từ 3,5 đến 6,5 để tối ưu hóa điều kiện HPLC Vì THF thường khơng ổn định, ảnh hưởng đến hình GVHD: Phan Thị Xuân 13 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP dạng peak phân tích HPLC - Chúng thay 1% acetic acid methanol: THF (4: 1) với 1% acetic acid dung dịch rửa giải metanol tinh khiết Như thể hình 3.2B, hình dạng peak chất màu, sắc ký đồ HPLC cải thiện, độ nhạy cao so với peak thu sử dụng THF làm chất rửa giải, 1-2mL dung dịch rửa giải cần thiết để rửa giải hiệu tất chất màu từ cột chiết Cho nên, 1% acetic acid methanol sử dụng làm chất rửa giải thích hợp cho lọc chất màu từ cột chiết Hình 3.2 Hiệu suất thu hồi (%) PA, AO, RB làm cột Oasis HLB sử dụng dung môi rửa giải khác nhau: 1% acetic acid THF:MeOH (1:4) (A) 1% acetic acid MeOH (B) [4] GVHD: Phan Thị Xuân 14 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP 3.3 Tối ưu hóa điều kiện HPLC Theo báo cáo trước phân tích chất màu thực phẩm tổng hợp HPLC LC/MS, ammonium acetate (dung môi A) acetonitrile (dung môi B) sử dụng làm pha động cho điều kiện gradient phân tích HPLC (Suzuki et al 2007) Trong nghiên cứu này, cố gắng để tối ưu hóa pH dung mơi A Như thể hình 3.3, peak AO PA rộng, tỷ lệ S/N thu cách sử dụng dung môi A pH=6,5 (tức là, cho AO 9.5 cho PA) thấp so với S/N thu pH 4,5 (8 cho AO 17 PA) pH 3,5 (5 cho AO cho PA), cho thấy độ nhạy việc xác định AO PA sử dụng dung môi A pH 6.5 thấp so với độ pH 4.5 3.5 Ngoài ra, trường hợp RB, thời gian lưu (RT) sử dụng dung môi A pH 3,5 dài pH 4.5 (Hình 3.3), cho thấy phân tích RB nhiều thời gian trường hợp trước lần sau Độ nhạy AO PA pH 4.5 tương tự pH 3.5 Do đó, chúng tơi sử dụng 10 mmol/L ammonium acetate (pH = 4,5) làm dung mơi A cho phân tích HPLC chất màu GVHD: Phan Thị Xuân 15 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC (tại 450 550 nm) dung dịch chuẩn PA, AO, RB (0.1µg/mL) giá trị pH khác (pH 6.5, 4.5, 3.5) [4] 3.4 Kiểm chứng phương pháp Các phương pháp phân tích tài liệu kiểm chứng cách xác định độ tuyến tính, LOD, LOQ, độ (bằng kiểm tra hiệu suất thu hồi), độ xác Các đường chuẩn cho PA có độ tuyến tính nồng độ 0.05-50 µg/mL, AO RB có độ tuyến tính 0.05-100 µg/mL Bảng 3.1: Hiệu suất thu hồi PA, AO, RB từ mẫu thêm chuẩn[4] Hiệu suất thu hồi (%)1 PA AO RB Gà Tandoori 102.4 ± 0.8 92.7 ± 5.7 91.3 ± 1.1 Gochujang 102.8 ± 3.3 92.6 ± 9.7 93.6 ± 0.9 Tương ớt 85.4 ± 8.0 92.7 ± 5.8 95.9 ± 1.9 Bột cà ri nhão 86.2 ± 2.6 85.4 ± 6.3 92.8 ± 1.7 Bột súp 88.1 ± 3.2 70.2 ± 1.7 99.0 ± 3.6 Bột tôm2 87.8 ± 3.9 76.8 ± 3.0 95.2 ± 2.9 nghĩa ± SD hiệu suất thu hồi từ mẫu bột tôm không thêm NaOH GVHD: Phan Thị Xuân 16 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP Các hệ số hồi quy lớn 0,999 tất trường hợp (PA, AO, RB) LOD LOQ xác định cách sử dụng dung dịch chuẩn Các LOD dựa ba lần tỷ lệ S/N 0.0125µg /g cho PA, 05µg/g cho AO, 0.0125µg/g cho RB Các LOQ dựa mười lần tỷ lệ S/N 0.05 µg/g cho PA, 0.125µg/g cho AO, 0.025µg/g cho RB Việc xác định LOD cho ba màu AO, RB, PA dựa đánh giá trực quan phổ PDA ước tính 0,025µg/g Độ độ xác phương pháp đánh giá hiệu suất thu hồi Dung dịch chuẩn PA, AO, RB thêm vào bột tôm, súp bột, hỗn hợp cà ri, tương ớt, gochujang, thịt gà tandoori nồng độ chất màu cuối 0.5µg/g Bảng cho thấy hiệu suất thu hồi độ lệch chuẩn tương đối (RSDs) thu phương pháp phân tích Hiệu suất thu hồi RSDs cho PA, AO, RB (trừ bột tôm) dao động từ 70,2% đến 102,8% từ 0,8% đến 8,0% Hiệu suất thu hồi RSDs cho PA, AO, RB bột tôm từ 51,7% đến 75,2% 2,3% đến 26,4% Hiệu suất thu hồi độ xác thấp giá trị quan sát bột tơm tổn thất PA, AO, RB trình làm sử dụng cột chiết, gây tượng lắng cặn thêm 1mL dung dịch NaOH 2,5M đến lớp chiết ethyl acetate Để ngăn ngừa tượng lắng cặn, không thêm NaOH vào dung dịch chuẩn bị từ bột tôm Dung dịch chuẩn bị phải làm sử dụng Oasis HLB Như vậy, hiệu suất thu hồi cải thiện đến 87.8% cho PA, 76.8% cho AO 95.2% cho RB Kết lặp lại đánh giá cách xác định RSDr RSDR trình kiểm tra hiệu suất thu hồi việc giữ lại dung dịch chuẩn PA, AO, RB với nồng độ 0.5µg/g cho chất màu bột cà ri nhão Khoảng giá trị RSDr từ 1.7% đến 4.5% khoảng giá trị RSDR khoảng 3.7% đến 7.7% (bảng 3.2) Bảng 3.2: Độ xác Intraday (RSDr ) độ xác interday (RSDR ) từ mẫu bột cà ri nhão có thêm chuẩn PA, AO, RB[4] Độ xác Chất phân tích Thêm chuẩn (µg/g) Phát (µg/g) Hiệu suất thu hồi (%) Intraday RSDr Interday RSDR PA 0.50 0.40 ± 0.03 80.0 2.9 7.7 AO 0.50 0.43 ± 0.02 85.4 4.5 3.7 RB 0.50 0.49 ± 0.02 97.9 1.7 4.1 Sắc ký đồ điển hình hiệu suẩt thu hồi PA, AO, RB sử dụng bột cà ri nhão thể hình 3.4 Các peak thu chất màu khơng dính vào nhau, RT 8.5 phút GVHD: Phan Thị Xuân 17 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP PA, 12 phút AO 17.5 phút RB Quang phổ PDA dung dịch mẫu cho thí nghiệm HPLC phù hợp với dung dịch chuẩn Chúng thu sắc ký đồ HPLC khơng dính vào trình kiểm tra hiệu suất thu hồi phân tích PA, AO, RB sử dụng mẫu gà tandoori, gochujang, tương ớt, bột súp bột tơm Hình 3.4 Sắc ký đồ (tại 450 550nm) dung dịch chuẩn PA, AO RB (0.1µg/mL), mẫu trắng mẫu từ bột cà ri nhão[4] 3.5 TLC Để áp dụng dung dịch mẫu chuẩn bị thí nghiệm TLC đánh giá giới hạn phát màu bản, chúng tơi thực phân tích TLC sử dụng dung dịch mẫu chuẩn bị (5-20µL, ~ 5-20ng chất màu) thử nghiệm phục hồi mô tả phần "Xác nhận phương pháp." Sắc ký đồ TLC điển hình thu PA, AO, RB thử nghiệm phục hồi cách sử dụng bột nhão cà ri nhão thể hình 3.5 Như thể hình 3.5C F, PA, AO, RB phát riêng biệt thành đốm màu đỏ, vàng, màu hồng hệ thống A B cách chấm 5µL dung dịch mẫu ánh sáng trắng Tuy nhiên, khó để phát mắt thường vị trí GVHD: Phan Thị Xuân 18 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP AO ánh sáng trắng màu vàng AO RB phát mắt đốm màu vàng màu cam huỳnh quang 366nm, tách từ điểm màu xanh huỳnh quang khỏi tạp chất bột cà ri não hệ thống A B (Hình 3.5B E) Hình 3.5 Sắc ký đồ TLC dung dịch chuẩn (STD), mẫu trắng (BK), mẫu (SMP) từ bột cà ri nhão 254 366nm, ánh sáng trắng sử dụng hệ thống dung môi A [2-butanone-methanol-5%Na2SO4 (1:1:1, v/v/v)] B [2-butanone-methanol1.6M ammonium formate (pH 2.5) (7:2:7, v/v/v)] [4] Một đốm AO rõ ràng phát 366nm hệ thống B Đốm PA, AO, RB phát mắt 254nm 5µL dung dịch mẫu sử dụng hệ thống A B Tuy nhiên, cường độ phát huỳnh quang đốm AO RB, cường độ trực quan đốm PA, thấp nhiều so với đốm quan sát ánh sáng trắng 366nm, quan sát tương tự với dung dịch mẫu từ thịt gà tandoori, gochujang, tương ớt, súp bột bột tôm 3.6 LC/MS Chúng tơi phát triển phương pháp định tính LC/MS để xác định chất màu bản, hiệu suất định lượng phương pháp không đánh giá Hình 3.6AGVHD: Phan Thị Xuân 19 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP F cho thấy SIM LC/MS điển hình sắc ký đồ HPLC-PDA 550nm 450nm phân tích PA, AO, RB thử nghiệm phục hồi sử dụng súp bột Peak phát 8.5 phút cho PA, 11.7 phút cho AO, 16.1 phút cho RB SIM (hình 3.6B C) sắc ký đồ HPLC-PDA (Hình 3.6E F) dung dịch chuẩn dung dịch mẫu chuẩn bị từ bột súp tăng mạnh với màu Như thể hình 3.6B, C, E F, peak bị nhiễm phát trường hợp RB trước peak RT, bao gồm sắc ký đồ SIM HPLC-PDA dung dịch mẫu dung dịch chuẩn Các peak nhiễm tìm thấy từ RB Tương tự vậy, peak cho PA, AO, RB phát sắc ký đồ SIM HPLC-PDA dung dịch mẫu chuẩn bị từ loại thực phẩm chế biến khác (ví dụ, tương ớt, bột cà ri nhão, gochujang, gà tandoori, bột tôm) Trên sắc ký đồ SIM mẫu trắng (Hình 3.6A), nhiều peak phát vào khoảng 16 phút (m/z 288 cho PA) Tuy nhiên, RT peak khác từ dung dịch chuẩn PA, từ peak xuất sắc ký đồ mẫu trắng dung dịch mẫu chuẩn bị từ loại thực phẩm khác, chúng tơi cho có lẽ tìm thấy tạp chất từ thực phẩm Hình 3.6 Sắc ký đồ LC/MS SIM mẫu từ mẫu bột súp thêm chuẩn PA, AO RB (mỗi mẫu thêm 0.5µg/g chuẩn) sắc ký đồ PDA 450 550nm Ký hiệu “*” tượng trưng cho phổ giả từ thực phẩm qua chế biến “**” tượng trưng cho phổ giả từ RB[4] GVHD: Phan Thị Xuân 20 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP KẾT LUẬN Chúng phát triển phương pháp HPLC để xác định chất màu trái phép thực phẩm chế biến Hiệu suất thu hồi đạt quy trình dao động từ 70,2% đến 102,8% Các phương pháp HPLC cung cấp cách để giảm nhiễu mẫu thực phẩm giàu chất béo (bột cà ri nhão gà tandoori), chất hòa tan nước (màu ớt gochujang tương ớt), sản phẩm giàu protein (bột tôm súp bột) Nghiên cứu cho thấy phương pháp đơn giản đáng tin cậy Mục đích phương pháp phân tích LC/MS định tính, khơng phải định lượng Vì vậy, việc có thêm phương pháp LC/MS dùng cho định tính định lượng điều cần thiết Chúng tin phương pháp hữu ích cho việc kiểm tra chất màu trái phép trung tâm kiểm tra phòng thí nghiệm kiểm dịch nhiều nước GVHD: Phan Thị Xuân 21 Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP TÀI LIỆU KHAM KHẢO [1] https://vi.wikipedia.org/wiki/Auramine_O [2] https://vi.wikipedia.org/wiki/Rhodamin_B [3] https://en.wikipedia.org/wiki/Pararosaniline [4] Chiye Tatebe, Xining Zhong, Takashi Ohtsuki, Hiroki Kubota, Kyoko Sato, Hiroshi Akiyama (2014), “A simple and rapid chromatographic method to determine unauthorized basic colorants (rhodamine B, auramine O and pararosaniline) in processed foods”, Food Science & Nutrition GVHD: Phan Thị Xuân 22 ... ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM – Khoa CNTP LỜI MỞ ĐẦU Màu thực phẩm tổng hợp sử dụng toàn giới để tránh màu sắc ban đầu thực phẩm sau chế biến, đồng thời làm cho sản phẩm thực phẩm hấp dẫn mắt... vào loại thực phẩm khác khơng có phương pháp xác định đồng thời PA, AO RB Vì phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng detector photodiode array (HPLC-PDA) hữu dụng việc xác định phát PA, AO, RB... 0.5 µg/g) nhiều loại thực phẩm Ngồi ra, cịn đề cập đến hai phương pháp khác phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) phương pháp sắc ký lỏng ghép detector khối phổ (LC/MS), phương pháp TLC có ưu điểm