Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài đu đủ rừng (trevesia palmata

Để thực hiện đề tài này, nội dung nghiên cứu bao gồm : - Xử lý mẫu, tạo dịch chiết; - Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được từ loài Đu đủ rừng... Người ta cho rằng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA HÓA HỌC -

NGUYỄN THỊ TÂM

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƯỚC CỦA LOÀI ĐU ĐỦ

RỪNG (TREVESIA PALMATA)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

HÀ NỘI – 2018

KHOA HÓA HỌC -

NGUYỄN THỊ TÂM

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƯỚC CỦA LOÀI ĐU ĐỦ

RỪNG (TREVESIA PALMATA)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

TS PHẠM HẢI YẾN

HÀ NỘI – 2018

biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.Phạm Hải Yến đã giao cho

em đề tài và đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em hoàn thành khóaluận này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS.Nguyễn Văn Bằng

cùng các thầy (cô) khoa Hóa học trường Đại học Sư Phạm Hà Nội đã giúp

đỡ em trong thời gian học tập, tu dưỡng tại trường

Em xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ phòng Nghiên cứu cấu trúc hóahọc Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong quá trình làm thực nghiệm để hoànthành khoa luận này

Bản thân em đã cố gắng để hoàn thành kháo luận, nhưng cũng khôngtránh khỏi thiếu xót Vì vậy, em kính mong sự đóng góp ý kiến của thầy (cô)

và các bạn đọc để khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn

Hà Nội, tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Tâm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Trevesia Vis 2

1.2 Tổng quan về loài Đu đủ rừng (Trevesia palmata) 3

1.2.1.Mô tả 3

1.2.2 Phân bố và sinh thái 3

1.2.3 Công dụng 4

1.2.4 Thành phần hóa học 4

1.2.5 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây đu đủ rừng 5

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 6

1.3.1 Chọn dung môi chiết 6

1.3.2 Qúa trình chiết 8

1.4 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ 9

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 10

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí 10

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc ký 11

1.5 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

18 1.5.1 Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR) 19

1.5.2 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 19

1.5.3 Phương pháp khối phổ (MS) 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

Khóa luận tốt

nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1 Mẫu thực vật 23

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 23

2.2.1 Sắc kí lớp mỏng ( TLC) 23

2.2.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế 23

2.2.3 Sắc kí cột 23

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 24

2.4 Dụng cụ 24

2.5 Hóa chất 24

CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25

3.1 Phân lập các hợp chất 25

3.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất 28

3.2.1.Hợp chất 1: 28-O-β-D-glucopyranosyl ester oleanolic acid 28

3.2.2 Hợp chất 2:Hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside 28

CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 29

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 29

4.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 35

KẾT LUẬN 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1 Sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết methanol của lá

Đu đu rừng

25

Sơ đồ 2 Sơ đồ phân lập phân đoạn nước từ lá Đu đủ rừng 27

Hình 4.1.c Phổ 13C và DEPT của hợp chất 1 31

Hình 4.1.g Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính

Khóa luận tốt

nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

Carbon-13 NuclearMagneticResonance Spectroscopy

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

1H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Corelation Spectroscopy

2D-NMR Phổcộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR

CC Sắc kí cột Column Chromatography

DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer

EI-MS Phổ khối lượng va chạm electronElectron Impact Mas

SpectroscopyFAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom

Bombardment Mas SpectrometryHMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivit

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High

Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

ME Nhóm metyl

MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography

MỞ ĐẦU

Họ Nhân sâm (Araliaceae) trong hệ thực vật Việt Nam khá phong phú

và đa dạng về đặc điểm hình thái cũng như thành phần hóa học Trên thếgiới, đặc biệt là ở các nước Đông Bắc Á đều đã sử dụng các loài trong họNhân sâm làm thuốc trong Y học cổ truyền

Trevesia Vis là một chi thuộc họ Nhân sâm, gồm khoảng hơn 10 loài ,

là những cây thuốc quý , có giá trị Các nhà khoa học đã xác định ở Việt

Nam chi Trevesia Vis gồm 6 loài phân bố rộng khắp cả nước, cây thường

mọc ở vùng rừng đệm, rừng xanh hay dọc bờ sông suối

Trevesia palmata ( Roxb.&Lindl.) Vis., tên thường gọi là Đu đủ rừng,

Thông thảo gai, Thầu dầu núi, là một loài thuộc chi Trevesia Vis., thường

mọc ở các sông, suối, ở thung lũng các rừng phục hồi [2] Đu đủ rừng đãđược sử dụng từ lâu theo kinh nhiệm dân gian và Y học cổ truyền TheoĐông Y, lõi thân có tác dung lợi tiểu, lợi phù, lợi sữa, dùng để chữa phùthũng, đái dắt, tê thấp, làm thuốc hạ nhiệt, và cũng được xem như một vịthuốc bổ, lá chữa gãy xương

Xuất phát từ ý nghĩa trên nên tôi đã chọn đề tài cho khóa luận tốtnghiệp là: “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước của loài Đu đủ

rừng (Trevesia palmata )” Để thực hiện đề tài này, nội dung nghiên cứu bao

gồm :

- Xử lý mẫu, tạo dịch chiết;

- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được từ loài

Đu đủ rừng

Khóa luận tốt

nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Trevesia Vis

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan được ghi trong cuốn

Flowering plants [17], cây Đu đu rừng (Trevesia palmata ( Roxb.& Lindl.) Vis.) thuộc chi Trevesia Vis., một chi nằm trong họ Nhân sâm ( Araliaceae).

Vị trí phân loại của chi Trevesia Vis trong hệ thống phân loại thực vật chínhthức được tóm tắt như sau:

Nghành: Ngọc lan Magnliophyta

Lớp: Ngọc lan Magnliopsida

Phân lớp: Sổ Dilleniidae

Liên bộ: Cornanae

Bộ Nhân sâm (Hoa tán) Apiales

Họ Nhân sâm khá đa dạng về đặc điểm hình thái Ở Việt Nam ghi

nhận được 18 chi thuộc họ này, trong đó có chi Trevesia Vis [4].

Chi Trevesia Vis là những cây bụi hay cây gỗ nhỏ thường xanh, hiếm

khi phân nhánh; thân có gai ( ở cây già những gai này bị tiêu biến) Lá lớn,mọc so le, có thùy chân vịt, có cuống, mép lá khía răng cưa; số thùy 5-13 Lákèm dính với cuống lá thành bẹ chìa có 2 thùy Cụm hoa tán nhiều hoa, hợplại thành chùy hoặc chùm; tổng số tán 1-25, mỗi tán mang 9-65 hoa Hoalưỡng tính Đài có mép dạng sóng hay có răng nhỏ Cánh hoa 6-16, xếp van,thường thì hợp thành thể dạng mũ rụng sớm Nhị bằng số cánh hoa Bầudưới, 6-16 ô, vòi nhụy hợp thành cột ngắn, mỗi ô có một noãn treo Quả hạchhình cầu – trứng [1 ], [5], [7]

Trên thế giới, chi Trevesia Vis có khoảng hơn 10 loài phân bố ở vùng

Đông Nam Á, Ấn Độ, Nepal, Bu-tan, Băng La Đét và Tây Nam Trung Quốc[5], [7]

1.2 Tổng quan về loài Đu đủ rừng (Trevesia palmata)

Độ cao phân bố thường từ 400m trở lên Hoa tháng 5-6 Quả tháng 7-9 [2].Cây sinh trưởng gần như quanh năm và ra quả 1-2 năm/lần

Hình 1.1: Lá cây Đu đủ rừng Hình 1.2: Hoa cây Đu đủ rừng

1.2.2 Phân bố và sinh thái

Đu đủ rừng được phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam

Đu đủ rừng là những cây ưa ẩm chịu bóng và cũng ưa sáng vì thế Đu

đủ rừng thường mọc ở những chỗ ẩm dọc theo các sông, suối, thung lũng ở

Khóa luận tốt

nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2

các rừng phục hồi [2], thuộc loại hình rừng kín xanh ảm trên núi đá vôi hoặctrên núi đất có nguồn gốc từ một vài loài đá mẹ khác nhau

Ở Việt Nam, loài này phân bố ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Ba Vì,Quảng Trị [3], Sơn La, Lào Cai, Tuyên Quang, Hà Tây, Kon Tum, Gia Lai,Đắc Lắc, Lâm Đồng [1]

1.2.3 Công dụng

Chi Trevesia Vis ở nước ta có 5 loài, trong đó loài T palmata đã được

sử dụng từ lâu theo kinh nghiệm dân gian và Y học cổ truyền Theo Đông Y,lõi thân có tác dụng lợi tiểu, lợi phù, lợi sữa, dùng để chữa phù thũng, đáidắt, tê thấp, làm thuốc hạ nhiệt, và cũng được xem như một vị thuốc bổ (20– 30 g lõi thân sắc riêng hoặc phối hợp với cây Mua đỏ); lá được dùng nấunước xông chưa tê liệt bại người và giã đắp chữa gãy xương [2]

1.2.4 Thành phần hóa học

Những nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành

phần hóa học của một số loài thuộc chi Trevesia Vis chủ yếu thuộc nhóm

chất saponin triterpen , đây là nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh học lý thú.Cho đến nay những nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi

Trevesia, kể cả trong nước và nước ngoài vẫn còn rất hạn chế.

Năm 2000, từ phân đoạn n-BuOH của dịch chiết EtOH lá loài T.

palmata, nhóm nghiên cứu này đã phân lập được 8 saponin triterpenoid,

trong đó có 6 chất mới Phần lớn các saponin này là các bisdesmoside, chỉ

có 3 saponin monodesmoside, nhưng tất cả đều có phần aglycon là acidoleanolic hoặc dẫn chất của acid này

1.2.5 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây đu đủ rừng

Hiện nay trên thế giới có rất ít nghiên cứu về tác dụng dược lý của Đu

đủ rừng (Trevesia palmata ( Roxb.& Lindl ) Vis.)

Năm 1999, Nunziatina De Tommasi và cộng sự (Ý) đã chứng minhdịch chiết saponin thô từ lá Đu đủ rừng và một số saponin phân lập được đềuthể hiện tác dụng chống tăng sinh tế bào trên các dòng tế bào J774, HEK-

293c , WEHI-164d [6]

Một nghiên cứu ở Thái Lan dã cho thấy dịch chiết ethanol phần trênmặt đất cây Đu đủ rừng có tác dụng chống oxi hóa rất yếu trên in vitro [8]

Năm 2001, Srianidkulchai và cộng sự nghiên cứu dịch chiết từ rễ đu

đủ có tác dụng lợi tiểu , cho chuột uống liều 10mg/kg, gây gia tăng khốilượng nước tiểu tổng xuất ra ngoài ( p<0,01), so sánh được vớihydrochlothiazid, và sự tống xuất các chất điện giải trong nước tiểu cũng có

Khóa luận tốt

nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2

các thông số tương tự Hoạt tính này được giải thích là do ở lượng muốikhoáng tương đối cao trong dung dịch chiết [9]

Năm 2014, Hasanur Rahman và cộng sự nghiên cứu tác dụng hạ

đường huyết và giảm đau của dịch chiết methanol lá loài T palmata Kết quả

cho thấy ở mức liều 100, 200 và 400 mg/kg thể trọng đã làm giảm đườnghuyết của động vật thực nghiệm 17,9, 28,1 và 47,4% so với đối chứng; Đốivới tác dụng giảm đau, ở mức liều 50, 100, 200 và 400 mg/kg thể trọng đãlàm giảm 17,9, 28,1 và 47,4% so với đối chứng [14] Một nghiên cứu khác

về tác dụng tan huyết khối và chống viêm khớp của dịch chiết methanol chiết

xuất từ lá loài T palmata cũng được Mohammed Aktar Sayeed và cộng sự công bố Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả này cho thấy dịch chiết n-

hexane và ethyl acetate có tác dụng tốt trên in vitro của hoạt tính tan huyếtkhối trong khi đó dịch chiết methanol có tác dụng mạnh đối với hoạt tính

kháng viêm [15].

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật.

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu,tùy thuộc vào đối tượngchất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, không phân cực, chất có độphân cực trung bình,…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấptrong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợpcho quá trình chiết, tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trìnhtạo thành chất mong muốn

Dung môi trong quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận Điềukiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hóa thứ cấpđang được nghiên cứu thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có

độ phân cực khác nhau Ngoài ra dung môi cần dễ dàng được loại bỏ, cótính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy khôngđộc Hiệu quả của quá trình chiết có thể bị ảnh hưởng nếu dung môi có lẫntạp chất Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu ở dạngsạch trước khi sử dụng Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi ởquá trình sản xuất hoặc khâu bảo quản (trong các thùng chứa hoặc nút đậybằng nhựa), ví dụ : các diakyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar, tributylphosphat.

Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phânlập trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thửnghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chlorofrom metylenclorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trìnhchiết sơ bộ một phần của cây như: lá thân rễ

[di-(2etylhexyl)-Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứngvới một vài hợp chất như các ancoloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩmkhác Tương tự như vậy sự phân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa vớicác hợp chất khác có thể sảy ra với sự có mặt của một lượng nhỏ axitclohidric (HCl) Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khilàm việc với chất này cần thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát vàphải đeo mặt nạ phòng độc Metylen cloritits độc hơn và dễ bay hơi hơnchlorofrom

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn cáchidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽthấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽthu được lượng lớn các thành phần trong tế bào.Trái lại khả năng phân cựccủa chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Cácancol

Khóa luận tốt

nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2

hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phâncực trung bình và thấp Vì vậy, các chất này cũng bị hóa tan đồng thời khichiết bằng ancol Thông thường dung môi cồn trong nước có đặc tính tốtnhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một số sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanoltrong suốt quá trình chiết [10] Ví dụ trechlonolide A thu được từtrechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trìnhphân hủy 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylumnovogranatense được chiết trong methanol nóng

Thường thì nước ít được sử dụng để thu dịch chiết thô từ cây mà thayvào đó là dùng dung dịch nước của methanol Dietyl ete hiếm khi đượcdùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rấtđộc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peoxit dễ nổ Peoxit của dietyl ete

dễ gây phản ứng oxi hóa với các hợp chất không có khả năng tạocholesterol như các carotenoid Axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Qúa trình chiết dưới điều kiệnaxit hoặc bazo thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng cókhi xử lý các dịch chiết bằng axit- bazơ có thể tạo thành những sản phẩmmong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-40oC, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

- Chiết sắc với dung môi nước.

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Một phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiếtthực vật là chiết ngâm bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian.Thiết bị được sử dụng là một bình thủy tinh với cái khóa ở dưới đáy để điềuchỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung môinóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Hiện nay máy chiết ngâm có thể dùngbình chiết thủy tinh mà không đòi hỏi phải làm bằng kim loại như trước đây.Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua ba lần dungmôi vì khi đó cặn chiết không còn chứa những chất giá trị nữa và quá trìnhchiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫuđược ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết sẽđược lấy ra Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cáchkhác nhau, chẳng hạn: khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần củadịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kếtthúc quá trình chiết

Như vậy, để đạt được hiệu quả cao, tùy thuộc vào mục đích cần thiếtlấy chất gì mà chúng ta cần lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiệnquá trình chiết hượp lý Ngoài ra, dựa vào mối quan hệ của dung môi vàchất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trongquá trình chiết

1.4 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ.[11,12]

Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến

và hữu hiệu nhất hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi trongviệc phân lập các chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nóiriêng

Khóa luận tốt

nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký .

Sắc ký là phương pháp tách, phân tách, phân tích, phân li các chấtdựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sụ phân bố khác nhau củachúng giữa hai pha: pha tĩnh và pha động

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan ) tương ứng với pha động và pha tĩnh

Tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiếtvới một pha tĩnh có sự khác nhau Nguyên nhân của sự khác nhau đó là dokhả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng trao đổikhác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh

Các chất khác nhau sẽ có ái lực với pha động và pha tĩnh khác nhau.Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnhnày đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấpphụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậmhơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này.Người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí nhờ vào đặc điểm trên

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí.

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữapha động và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ đơnphân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụlên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêngphần):

n  n  .b.C

n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp

phụ nào đó

b: hằng số.

C: nồng độ của chất hấp phụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc ký.

Trong phương pháp sắc kí: pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh thường là chất lỏng hoặc rắn

 Theo bản chất của hai pha sử dụng:

- Sắc kí trao đổi ion.

+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học

là polymer nên gọi là hạt nhựa Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hoá học

ở dạng ion Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation

+ Sắc kí ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột

có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị Một protein có ái lực vớinhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở

+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãitrong việc tinh sạch protein

- Sắc kí lỏng cao áp

Kỹ thuật sắc kí lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc kí cột

có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu tạocột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫnđến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệumịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảythích hợp

 Phân loại sắc kí theo cấu hình

+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc kí lớp mỏng là silicagel, là loạipha tĩnh với tính chất rất phân cực.

+ Pha động luôn luôn là chất lỏng

+ Pha động là dung môi liên tục được rót vào đầu cột

 Theo trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hainhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí

 Theo cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành những nhómnhỏ: sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng

1.4.3.1 Sắc ký cột

Sắc kí cột là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất Sắc kýcột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Chất hấp thụ là pha tĩnhgồm các loại silicagen những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150 µm),pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp thụ được nhồi vào cột(cột thủy tinh) Độ mịn của chất hấp thụ hết sức quan trọng, nó phản ánh sốđĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp thụ Độ hạt của chất hấp thụcàng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại.Tuy nhiên, nếu chất hấp thụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy cànggiảm Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây rahiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sửdụng áp suất, với áp suât trung bình (MPC), áp suất cao ( HPLC)

Trong sắc kí cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rấtquan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu

quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là

Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau của Rfnày mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chấthấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ

lệ này thấp ( từ 1/5 -1/10 ), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào

hệ số tách ( tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số nàytrong khoảng 1/20-1/30

Trong sắc kí cột, mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phíatrên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn),bình chứa dung môi giải ly được đặt phải trên cao Dung môi giải ly ra khỏicột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặ ngay ống dẫn ra củacột Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp

so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưu điểm làpha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫutương đối lớn

Các bước thực hiện sắc ký cột:

- Lựa chọn chất hấp thu: pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chấtkhông phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải lysau

- Lựa chọn dung môi: Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trongdung môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A) Chuẩn bị4-6 tấm bản mỏng 2,5x10cm Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng2-5µl dd(A) Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải lykhác nhau, kế đó phát hiện bằng đèn UV hay thuốc thử Với đơn dung môi sẽ

dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp Từ kết quả đó, cố gắng tìm mộthỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một dung môi kém

phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate.

- Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứngtrên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột.Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượngnhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột Khi lớp chất hấp thu đạt được chiềucao khoảng 2cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới để cột để cho dungmôi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi này dẽđược rót lại lên đầu cột Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấpthu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng nhất

- Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký Nếu mẫu

ở dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại dungmôi cho khởi đầu sắc ký

Thực hiện nạp mẫu lên cột như sau:

+ Mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trongcột xuống sao cho vừa sát với mặ thoáng của chất hấp thu trong cột

+ Đóng khoá lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột Muốn nạp mẫu, sửdụng một pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng củachất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dungdịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu

+ Mở khoá bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịchmẫu được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không chochất hấp thu đầu cột bị khô

+ Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thờidùng dung môi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột

+ Mở khoá cho dung môi chảy ra Lặp lại vài lần giúp cho dung dịchmẫu thấm sâu vào chất hấp thu, dung môi trong suốt không lây màu của chấtmẫu

thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt cột.

+ Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly trên cột

1.4.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography),dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗnhợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụnhư: silicagel hay oxid alumin) Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng,đều, phủ lên nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic Do chấthấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc

ký lớp mỏng

Bình sắc ký: Hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy.Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu(silicagel, alumin, ) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấmnhôm, hay tấm plastic Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinhbột hay một lọai polymer hữu cơ

Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cựckhác nhau Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%,nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trêncao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình

Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậmdọc theo tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyểncàng cao nhờ tính mao quản Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốckhác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộcvào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lạipha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi

Ưu điểm:

- Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích.

- Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùngđiều kiện phân tích

- Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấmsắc ký lớp mỏng

- Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫulên bản mỏng, còn mẫu làdung dịch quá sễt, có thể pha loãng mẫu Với mẫu

là chất rắn phải hòa tan trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5%.Nhờ một vi quản để dung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng một cáchthận trọng, tránh không cho làm lũng bề mặt của lớp mỏng Mỗi vết chấmtrên bản không chứa nhiều hơn 12ug (10ug là tối ưu) mẫu chất

- Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dungdịch giải ly

- Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau khi bình đã bão hòadung môi, người ta đặt tấm mỏng vào bình khai triển để cho các vết chấmmẫu ở bờ cạnh phía dưới đáy bình Cạnh đáy của tấm lớp mỏng nậgp trongdung môi giải ly khoảng 0.5-1cm Các vết mẫu không được ngập trong dungmôi giải ly, vì như thế dung môi sẽ khuếch tán vào trong dung môi

- Hiện hình các vết sau khi giải ly: Các hợp chất có màu sẽ được nhìn

nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát hiệnbằng tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này nhận ra các hợpchất có thể hấp thu tia UV, các hợp chất có màu tối sẫm trên nền sáng; đènchiếu tia UV 366nm ánh sàng này phát hiện nhữgn hợp chất có phát hùynhquang, các vết sẫm của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu)hay dùng phương pháp hóa học (Bằng cách dùng thuốc thử hiện hình như hơiiod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát hiệnaminoacid hay amin, 2,4- dinitrophenylhydrazin phát hiện aldehyde haycaton, clorur antimony phát hiện steroid hay vitamin hay carotenoid,…)

- Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số

di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử vàkhoảng dịch chuyển của dung môi:

Rf = a/bTrong đó:

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm)

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùngđường đi của vết (cm)

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l

1.5 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phươngpháp phổ kết hợp Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người

ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phốihợp với các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp để xácđịnh chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào cácphương pháp bổ xung khác như chuyển hóa hóa học, các phương pháp sắc

kí so sánh

1.5.1 Phương pháp quang phổ hồng ngoại (IR)

Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trongvùng từ 4000 đến 400 cm–1 và biến thành năng lượng của dao động phân tử

Sự hấp thu ấy có định lượng nhưng phổ hồng ngoại không biểu hiện thànhđường thẳng mà là các dải hấp thụ với cường độ khác nhau, bởi vì sự biến đổinăng lượng dao động luôn đi kèm với sự biến đổi của năng lượng quay Nhưvậy, phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của 2 dạng năng lượng trong phân tử:năng lượng dao động và năng lượng quay Dựa vào sự hấp thụ này, có thểchia phổ hồng ngoại thành 3 vùng:

-Vùng sóng ngắn (4000-1300 cm-1 ) gọi là vùng các nhóm chức vì cácbăng hấp thụ của các nhóm chức hữu cơ như OH, NH, CO đều xuất hiện ởđây

-Vùng sóng dài (900-400 cm-1 ) đặc trưng cho các hấp thụ của dao độngbiến dạng của vòng thơm và các hấp thụ biến dạng của CH ngoài mặt phẳng

-Vùng sóng trung bình (1300-900 cm-1 ) được gọi là vùng chỉ vân tay vì

nó được dùng để so sánh hình dạng các băng hấp thụ của các mẫu xem cóđồng nhất hay không về phương diện hóa học Phương pháp phân tích nàycho ta xác định các nhóm chức, vòng benzen có trong phân tử

1.5.2 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Khi chúng ta đặt một chất có chứa nguyên tử 1H và 13C vào một từtrường rất mạnh và đồng thời chiếu xạ nó với một năng lượng điện từ, nhữnghạt nhân của các nguyên tử đó có thể hấp thu năng lượng qua một quá trìnhgọi là cộng hưởng từ, sự hấp thụ này được lượng tử hóa và cho ra một phổđặc trưng của hợp chất Trong phân tử, các hạt nhân hydro ở trong nhữngvùng có mật độ điện tử khác nhau nên hấp thụ năng lượng ở từ trường cócường độ hơi khác nhau Điều này dẫn đến các tín hiệu ứng với các proton đó

tương tác của từ trường của proton lân cận nhau gây ra sự chẻ tín hiệu, vì vậykhi quan sát tín hiệu có các trường hợp chùm đôi 1:1 (doublet), chùm ba 1:2:1(triplet), chùm bốn 1:3:3:1 (quartlet), Với phổ 13C-NMR, mỗi carbon trongmột phân tử hữu cơ bình thường chỉ cho một pic không có hiện tượng chẻ tínhiệu thành nhiều pic Khi nghiên cứu các kết quả phân tích của phổ này, cùngvới các kỹ thuật DEPT, COSY, HMBC, HSQC có thể xác định được số lượngproton và carbon và vị trí của chúng trong phân tử.

1.5.2.2 Phổ 13 C-NMR

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộnghưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo củaphổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230 ppm

1.5.2.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer):

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau Trênphổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc 4 biến mất Tín hiệu của CH và CH3nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT135 Trên phổDEPT90 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH

1.5.2.4 Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác củacác hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủyếu thường được sử dụng như sau: