CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1
Hợp chất 1 phân lập được dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng.
Trên phổ 1H-NMR của hợp chất này cho thấy tín hiệu proton của bảy nhóm nhóm methyl tại δH 0.77, 0.83, 0.93, 0.95, 0.97, 0.99, 1.18 (mỗi tín hiệu 3H, singlet); một proton olefin tại δH 5.27 (1H, br s); một proton anome tại δH 5.40 (1H, d, J = 8.0 Hz), gợi ý hợp chất này có một đơn vị đường. Các tín hiệu proton của phần đường, tín hiệu proton dạng singlet của bảy nhóm methyl thuộc phần aglycone và sự xuất hiện một số lượng lớn các tín hiệu proton ở vùng trường cao (δH 0.76 ~ 2.06) cho phép dự đoán đây là một hợp chất saponin có cấu trúc khung aglycone dạng olean
Hình 4.1.a: Phổ proton 1H của hợp chất 1
Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT của 1 nhận thấy xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 36 nguyên tử carbon bao gồm: một nhóm carbonyl (δC
(CH), 10 nhóm methylene (CH2), và 7 methyl (CH3). Sự xuất hiện tín hiệu của một proton olefin và hai carbon olefin (δC 123.8 và 144.8) trên phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 1 cho thấy sự có mặt của một liên kết đôi C=C đã bị thế ba proton trong cấu trúc của 1.
Hình 4.1.b : Phổ cacbon 13C của hợp chất 1
Vị trí các nhóm thế và qui kết các giá trị phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 1 được thực hiện bằng phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC và HMBC. Tương tác HMBC từ H-24 (δH 0.77) tới C-3 (δC 79.7)/ C- 4 (δC 39.9)/ C-5 (δC 56.8)/ C-23 (δC 28.7) và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-3 cho phép xác định một liên kết C-O tại C-3. Đồng thời các tương tác trực tiếp HSQC gồm H-3/C-3, H-24/C-24, H-23/C-23 cho phép qui kết các giá trị phổ 1H-, 13C- tại các vị trí này. Tương tác HMBC từ H-25 (δH 0.97) tới C-1 (δC 39.8)/ C-5 (δC 56.8)/ C-9 (δC 49.0)/ C-10 (δC 38.1) và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-1/C-1, H-9/C-9, H-25/C-25) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-1, C-9, C-10, và C-25. Tương tác HMBC từ H-26 (δH 0.83) tới C-7 (δC 33.1)/ C-8 (δC 40.7)/ C-9 (δC 49.0)/ C-14 (δC 42.9) và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-7/C-7, H-26/C-26) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-7, C-8, C-14, và C-26. Tương tác HMBC từ H-27 (δH 1.18) tới C-8 (δC 40.7)/ C-13 (δC 144.8)/ C-14 (δC 42.9)/ C-15 (δC 28.9) và tín hiệu carbon không liên kết với hydro ở vùng Csp2 của C-13 cho thấy vị trí
liên kết đôi C=C tại C-12/C-13 kết hợp với tương tác trực tiếp trên phổ
tại C-12, C-13, C-15, và C-27. Các tương tác HMBC từ H-29 (δH 0.95) và H- 30 (δH 0.93) tới C-19 (δC 47.2), C-20 (31.5), C-21 (33.9) và các tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-29/C-29, H-30/C-30, H-19/C-19, H-21/C-21) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-18, C-19, C-20, C-21, C-29, và C-30.
Các tương tác COSY giữa H-3/H-2, H-5/H-6, H-12/H-11, H-15/H-16, H- 18/H-19, H-21/H-22 cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-2, C-6, C-11, C- 16, C-18, và C-22. Hai tín hiệu carbon còn lại δC 48.0 và 178.1 lần lượt qui kết cho giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-17 và C-28. Giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-28 đặc trưng cho nhóm chức carboxylic đã bị ester tại C- 28 của cácj hợp chất triterpen dạng olean-28-oic acid. Tiếp đó, số liệu phổ của các đơn vị đường trong hợp chất 1 cũng được qui kết bằng phân tích phổ hai chiều HSQC, HMBC. Tương tác HMBC giữa H-1ʹ (δH 5.40) với aglyone C-28 (δC 178.1). Các số liệu phổ carbon của hợp phần đường tại δC 95.7, 73.9, 78.3, 71.1, 78.7, và 62.4 cho thấy sự có mặt của một đơn vị đường glucose liên kết với alycon tại C-28.
Hình 4.1.d : Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 1
Như vậy, cấu trúc hóa học của hợp chất 1 đã được xác định là 28-O- β-D-glucopyranosyl ester oleanolic acid, với công thức phân tử C36H58O8 và số khối M=618.
Hình 4.1.f: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của 1
C #δC
1
δC a,b δH a,c (J, Hz)
1 38.4 39.8 1.01 (m)/ 1.64 (m)
2 27.3 27.9 1.58 (m)/ 1.64 (m)
3 78.6 79.7 3.16 (dd, 4.0, 11.0)
4 38.3 39.9 -
5 55.0 56.8 0.76 (m)
6 18.0 19.5 1.42 (m)/1.58 (m)
7 31.7 33.1 1.62 (m)/ 1.73 (m)
8 38.4 40.7 -
9 47.4 49.0 3.32 (m)
10 36.7 38.1 -
11 22.7 24.5 1.92 (m)/ 2.06 (m)
12 122.4 123.8 5.27 (br s)
13 143.1 144.8 -
14 41.0 42.9 -
15 27.7 28.9 1.10 (m)/ 1.82 (m)
16 22.7 24.0 1.92 (m)
17 45.6 48.0 -
18 41.5 42.6 2.87 (m)
19 46.7 47.2 1.17 (m)/ 1.72 (m)
20 30.3 31.5 -
21 33.6 33.9 1.33 (m)/ 1.49 (m)
22 32.7 34.9 1.22 (m)/ 1.41 (m)
23 29.4 28.7 0.99 (s)
24 15.2 16.3 0.77 (s)
25 15.0 15.9 0.97 (s)
26 16.5 17.7 0.83 (s)
27 26.5 26.3 1.18 (s)
28 176.9 178.1 -
29 23.1 23.9 0.95 (s)
30 32.5 33.4 0.93 (s)
28-O-ò-D-glucopyranosyl
1′ 94.0 95.7 5.40 (d, 8.0)
2′ 72.2 73.9 3.35 (m)
3′ 76.5 78.3 3.41 (m)
4′ 69.6 71.1 3.37 (m)
5′ 76.5 78.7 3.36 (m)
6′ 61.3 62.4 3.68 (m)/ 3.81 (m)
aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, #C 28-O-β-D-glucopyranosyl ester oleanolic acid [13].
Hợp chất 2 phân lập được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất này cho thấy tín hiệu proton của bảy nhóm nhóm methyl tại δH 0.72, 0.83, 0.93, 0.96, 0.99, 1.19 (mỗi tín hiệu 3H, singlet); và 1.28 (3H, d, J = 6.0 Hz); một proton olefin tại δH 5.26 (1H, br s); ba proton anome tại δH 4.52 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.54 (1H, d, J = 7.5 Hz), 5.18 (1H, br s) gợi ý hợp chất này có ba đơn vị đường. Các tín hiệu proton của phần đường, tín hiệu proton dạng singlet của sáu nhóm methyl thuộc phần aglycone và sự xuất hiện một số lượng lớn các tín hiệu proton ở vùng trường cao (δH 0.72 2.02) cho phép dự đoán đây là một hợp chất saponin có cấu
trúc khung aglycone dạng oleane tương tự 1.
Hình 4.2.a: Phổ proton 1H của hợp chất 2
Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT của 2 nhận thấy xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 47 nguyên tử carbon bao gồm: một nhóm carboxyl (δC 181.9) và sáu carbon khác không liên kết với hydro (C), 22 nhóm methine (CH), 11 nhóm methylene (CH2), và 7 methyl (CH3). Sự xuất hiện tín hiệu
của một proton olefin và hai carbon olefin (δC 123.5 và 145.2) trên phổ H- và 13C-NMR của hợp chất 2 cho thấy sự có mặt của một liên kết đôi C=C đã bị thế ba proton
Hình 4.2.b: Phổ cacbon 13C của hợp chất 2
Hình 4.2.c: Phổ cacbon 13C và DEPT của hợp chất 2
Vị trí các nhóm thế và qui kết các giá trị phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 2 được thực hiện bằng phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, HMBC, và COSY. Tương tác HMBC từ H-24 (δH 0.72) tới C-3 (δC
hóa học của C-3 và C-23 cho phép xác định một liên kết C-O tại C-3 và một nhóm hydroxy tự do tại C-23. Đồng thời các tương tác trực tiếp HSQC gồm H-3/C-3, H-24/C-24, H-23/C-23 cho phép qui kết các giá trị phổ 1H-, 13C- tại các vị trí này. Tương tác HMBC từ H-25 (δH 0.99) tới C-1 (δC 39.6)/ C-5/
C-9 (δC 48.9)/ C-10 (δC 37.6) và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-1/C- 1, H-9/C-9, H-25/C-25) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-1, C-9, C-10, và C-25. Tương tác HMBC từ H-26 (δH 0.83) tới C-7 (δC 33.4)/ C-8 (δC 40.4)/ C-9 / C-14 (δC 42.9) và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-7/C-7, H-26/C-26) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-7, C-8, C-14, và C-26.
Tương tác HMBC từ H-27 (δH 1.19) tới C-8 / C-13 (δC 145.2)/ C-14/ C-15 (δC 28.8) và tín hiệu carbon không liên kết với hydro ở vùng Csp2 của C-13 cho thấy vị trí liên kết đôi C=C tại C-12/C-13 kết hợp với tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-27/C-27, H-15/C-15, H-12/C-12) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-12, C-13, C-15, và C-27. Các tương tác HMBC từ H-29 (δH 0.93) và H-30 (δH 0.96) tới C-19 (δC 47.2), C-20 (31.6), C-21 (34.9) và các tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-29/C-29, H-30/C-30, H-19/C-19, H- 21/C-21) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-18, C-19, C-20, C-21, C-29, và C-30. Các tương tác COSY giữa H-3/H-2, H-5/H-6, H-12/H-11, H-15/H- 16, H-18/H-19, H-21/H-22 cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-2, C-6, C- 11, C-16, C-18, và C-22. Hai tín hiệu carbon còn lại δC 47.6 và 181.9 lần lượt qui kết cho giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-17 và C-28. Giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-28 đặc trưng cho nhóm chức carboxylic tự do tại C-28 của các hợp chất triterpen dạng olean-28-oic acid. Tiếp đó, số liệu phổ của các đơn vị đường trong hợp chất 2 cũng được qui kết bằng phân tích phổ hai chiều COSY, HSQC, HMBC. Tương tác HMBC giữa H-1ʹ (δH 4.52) với aglyone C-3 (δC 82.4), chuỗi tương tác quan sát được trên phổ COSY gồm
của các proton này cho phép qui kết các giá trị phổ của đơn vị đường arabinose và liên kết O-glycoside của đường này với aglycone tại C-3.
Tương tác HMBC giữa Hʺ-1 (δH 5.18) và C-2ʹ (δC 76.9), cùng với chuỗi các tương tác COSY H-1ʺ/ H-2ʺ/ H-3ʺ/ H-4ʺ/ H-5ʺ/ H-6ʺ cho phép qui kết các giá trị phổ của đơn vị đường rhamnose, và liên kết (1→2) giữa đơn vị đường rhamnose với đơn vị đường arabinose. Các số liệu phổ carbon còn lại của hợp phần đường tại δC 105.7, 75.3, 77.7, 71.2, 77.7, 62.4 và tương tác HMBC giữa H-1‴ (δH 4.54) với C-3ʺ (δC 82.7) cho thấy sự có mặt của một đơn vị đường glucose tự do ở cuối chuỗi mạch trisaccharide và liên kết với đơn vị rhamose bởi liên kết (1→3) O-glycoside. Hóa lập thể của khung aglycone của hợp chất 2 tiếp đó được minh chứng dựa trên phân tích phổ tương tác không gian ROESY. Các tương tác ROESY giữa H-25/H-26, H- 18/H-30 cho thấy các proton này gần nhau trong không gian và cùng định hướng beta như sinh tổng hợp của các hợp chất thứ cấp khung oleane. Tương tự như vậy, tương tác ROESY giữa H-5/H-9/H-27 cũng minh chứng cho sự định hướng alpha của các proton này. Ngoài ra trên phổ ROESY của 2 còn quan sát thấy tương tác giữa H-25 (δH 0.99) và H-24 (δH 0.72) cho thấy nhóm methyl C-24 cũng định hướng beta, tức là nhóm hydroxymethyl C-23 định hướng alpha. Tương tác ROESY giữa H-3 (δH 3.64) và H-5 (δH 1.29) cho phép xác định proton H-3 định hướng alpha giống H-5, hay nhóm oxygen thế ở C-3 định hướng beta.
.
Hình 4.1.e: Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 2
Như vậy, cấu trúc hóa học của hợp chất 2 đã được xác định là
hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L- rhamnopyranosyl- (1→2)-α-L-arabinopyranoside , ứng với công thức phân tử C47H76O17, M=92
Hình 4.1.g: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC của hợp chất 2
C δ C 2 δC a,b
δH a,c
(J, Hz)
1 39.2 39.6 0.99 (m)/1.63 (m)
2 26.5 26.5 1.75 (m)/1.90 (m)
3 81.4 82.4 3.64 (m)
4 43.8 43.9 -
5 47.8 48.0 1.29 (m)
6 18.3 18.8 1.38 (m)/1.52 (m)
7 33.0 33.4 1.29 (m)/1.64 (m)
8 39.9 40.4 -
9 48.4 48.9 1.65 (m)
10 37.1 37.6 -
11 24.0 24.5 1.91 (m)
12 122.6 123.5 5.26 (br s)
13 145.3 145.2 -
14 42.4 42.9 -
15 28.6 28.8 1.10 (m)/1.80 (m)
16 24.0 24.0 1.61 (m)/2.02 (m)
17 46.9 47.6 -
18 42.3 42.7 2.86 (br d, 10.5)
19 46.8 47.2 1.16 (m)/1.71 (m)
20 31.1 31.6 -
21 34.4 34.9 1.22 (m)/1.40 (m)
22 30.1 33.8 1.56 (m)/1.77 (m)
23 64.3 64.5 3.35 (d, 11.5)/3.58 (d, 11.5)
24 14.3 13.7 0.72 (s)
25 16.3 16.4 0.99 (s)
26 17.7 17.8 0.83 (s)
27 26.4 26.5 1.19 (s)
28 181.1 181.9 -
29 33.5 33.6 0.93 (s)
30 24.0 24.0 0.96 (s)
3-O-α-L-arabinopyranosyl
1′ 104.8 104.9 4.52 (d, 5.5)
2′ 75.6 76.9 3.67 (m)
3′ 74.8 73.9 3.68 (m)
4′ 69.6 69.6 3.80 (m)
5′ 66.2 65.6 3.53 (dd, 3.5, 11.0)
3.86 (br d, 11.0)
6′ - - -
2′- O-α-L-rhamnopyranosyl
1′′ 101.4 101.7 5.18 (br s)
2′′ 71.6 71.0 4.26 (br s)
4′′ 72.8 72.5 3.59 (m)
5′′ 69.7 70.1 3.93 (m)
6′′ 18.4 18.1 1.28 (d, 6.0)
3′-O-ò-D-glucopyranosyl
1′′′ 106.5 105.7 4.54 (d, 7.5)
2′′′ 75.6 75.3 3.33 (m)
3′′′ 78.4 77.7 3.41 (dd, 8.5, 9.0)
4′′′ 71.6 71.2 3.34 (m)
5′′′ 78.3 77.7 3.34 (m)
62.5 62.4 3.89*/3.71 (dd, 4.5, 11.5)
aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, @ δC hederagenin-3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside [16].
Bằng các phương pháp chiết và sắc kí kết hợp như sắc kí cột nhồi silica gel pha thường, sắc kí cột nhồi silicagel pha đảo, sắc kí lớp mỏng điều chế đã phân lập được hai hợp chất tritecpen saponin, kết quả thu được như sau:
1) Hợp chất (1): 28-O-β-D-glucopyranosyl ester oleanolic acid
2) Hợp chất (2): hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside
Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1 và hợp chất 2 được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại bao gồm phổ cộng hưởng hạt nhân một chiều và hai chiều.
Tiếng Việt
[1] Nguyễn Tiến Bân (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật.
[2] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
[3] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, quyển 2, nxb.Trẻ, thành phố Hồ Chí Minh.
[4] Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phương Anh (2013), Bước đầu xây dựng khóa định loại các chi trong họ Ngũ Gia Bì (Araliaceae) ở Việt Nam.
Tiếng Anh.
[5] Committee E.(2007), Flora of China.13, 436-438.
[6] De Tommasi,Nunziatuna, Autore Giuseppina, Bellino Aurora, Pinto Aldo, Pizza Cosima, Sorrentino Raffaella,63 (3), 308-314.
[7] Jebb, Matthew HP (1998), A reviesion of the genus Trevesia (Araliaeae). Glasra.3(2), 85-113.
[8] Kannika banyaphu, Panee Sirisa – ard, Preeyaws Na Ubol, Surapol Nathaka Karnkitkul, Sunee Chansakaou, Tran Van On (2012), Phytochemical, an tioxidant and antibacterial activities of medicinal plants used in Northern Thailand as postpartum herbal bath recipes by the Mien (Yac) community, Phytopharmacology.2(1), 92-105.
[9] Sripanidkulchai B, Wongpanich V, Laupattarakasem P, Suwansaksri J, Jirakulsomchok D, (2001), Diuretic effetic of selected Thai indigenous medicinal plants in rats. J Ethnopharmacol. May; 75 (2-3):185-90.
[10] Duc Do Khac, Sung Tran An, Angela Martha Campos, Jean – Yves Lallemand and Marcel Fetizon, Ellagic acid compounds from Diplopanax stachy anthus, Phytochemical, Vol.29(1), pp25 – 256 (1990).
[11]. Peter J.Houghton and Lu Minh Lian, Triterpenes from Desfontainiaspinosa, Phytochemical, Vol.25 (8) , pp 1939 – 1944 (1986).
[12] Liang Guang – Yi, Alexander I.Gray amh Peter G.Waterman, Pentacylic triterpenes from the fruits of Rosa sterilis, Journal of Natural Products, Vol.52, pp 162 -167 (1989).