Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian tại vƣờn quốc gia bidoup – núi bà, tỉnh lâm đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CAO CHIẾT NƯỚC CỦA MỘT SỐ LOẠI CÂY THUỐC DÂN GIAN TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP – NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Thảo MSSV: 1151110516 Lớp: 11DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng thực sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Phạm Thị Thảo i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường truyền đạt kiến thức thật quý báu cho suốt q trình học tập trường Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Đặc biệt xin chân thành cảm ơn thầy Thạc sĩ Phạm Minh Nhựt tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp Thầy bên, quan tâm, giúp đỡ việc gợi ý tưởng trình làm luận văn cung cấp tài liệu sách liên quan suốt q trình nghiên cứu Ngồi tơi xin cám ơn bạn sinh viên nhóm thầy Tâm, Hằng, Hồng Vân, Nhân, Vân Anh, Tuấn, Trí, Hiền tất bạn phòng thí nghiệm trường giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình hồn thành luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh, động viên lúc khó khăn, nản lòng suốt thời gian học tập, nghiên cứu sống Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Phạm Thị Thảo ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU PHẠM VI NGHIÊN CỨU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………… …………………… 1.1 Sơ lược số loại thuốc dân gian có khả trị tiêu chảy vườn quốc gia Bidoup 1.1.1 Cây Podocarpus sp 1.1.2 Cây Polygala sp 1.1.3 Cây Medinilla sp 1.1.4 Cây Elephantopus sp 1.1.5 Cây Eupatorium sp 1.2 Đại cương số nhóm chất hữu có cao chiết nước 1.2.1 Carbohydrate 1.2.2 Flavonoid 1.2.3 Tannin 10 1.2.4 Alkaloid 11 1.2.5 Saponin 12 Đồ án tốt nghiệp 1.2.6 1.3 Anthraglycoside 13 Tổng quan chế kháng khuẩn hợp chất thực vật 15 1.3.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn thực vật 15 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn chung hợp chất từ thực vật 16 1.4 Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy .17 1.4.1 Đại cương họ vi khuẩn đường ruột 17 1.4.2 Một số vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy 18 1.4.3 Nhóm vi khuẩn gây bệnh da 23 CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.2 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 25 2.2.2 Vi sinh vật thị 25 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất .26 2.3.1 Thiết bị dụng cụ 26 2.3.2 Hóa chất 26 2.4 Phương pháp nghiên cứu .27 2.4.1 Phương pháp tách chiết cao nước thuốc 27 2.4.2 Phương pháp nuôi cấy bảo quản vi sinh vật thị 27 2.4.3 vật Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước thực .29 2.4.4 Phương pháp xử lí số liệu .29 2.5 Bố trí thí nghiệm 29 2.5.1 thuốc Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước loại .30 2.5.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước số loại thuốc 32 2.5.3 Thí nghiệm 3: Định tính thành phần hóa học cao chiết nước số loại thuốc dân gian .33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước số loại thuốc dân gian .38 Đồ án tốt nghiệp 3.1.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước số loại thuốc dân gian 39 3.2 Kết định tính thành phần hóa học cao chiết nước số loại thuốc .50 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 4.1 Kết luận 54 4.2 Đề nghị 54 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl sulfoxide pABA: p – aminobenzoic acid mRNA: RNA thông tin tRNA: RNA vận chuyển DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao nước số loại thuốc số chủng vi sinh vật 48 Bảng 3.2 Kết định tính thành phần hóa học cao chiết nước số loại thuốc 51 vii Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1 Cây Podocarpus imbricartus Hình 1.2 Cây Polygala paniculata Hình 1.3 Cây Medinilla septentrionalis Hình 1.4 Cây Elephantopus mollis Hình 1.5 Cây Eupatorium odoratum Hình 1.6 Các điểm tác động PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm nấm 16 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm 30 Hình 2.2 Sơ đồ chung đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước số thuốc dân gian 31 Hình 2.3 Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước số loại thuốc dân gian 32 Hình 2.4 Định tính sơ thành phần hóa học cao chiết nước loại thuốc Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi cao nước số loại thuốc dân gian 38 Hình 3.2 Màu sắc dịch lọc cao chiết nước Elephantopus sp qua lần ngâm mẫu 38 Hình 3.3 Khả kháng khuẩn cao chiết nước Podocarpus sp 39 Hình 3.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước Polygala sp 41 Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước Medinilla sp 43 Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước Eupatorium sp 45 Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước Elephantopus sp 47 Hình 3.8 Kết kháng khuẩn cao nước Medinilla sp chủng SD (A1) ShB (A2), Polygala sp VH (B1) EC (B2), Eupatorium Đồ án tốt nghiệp sp chủng VH (C1) LM (C2), Podocarpus sp với chủng ST (D1) cạy Elephantopus sp chủng ShF (D2) 49 A.2 Kết khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn cao chiết nƣớc Polygala sp 20 chủng vi sinh vật thị Polygal a sp S T 1 1 17 81 92 [100 [200] ] lầ l lầ lầ lầ lầ n ầ n n n n E - - - - - c E - - - - - s E8 8 8 s E.c- - - - - oliLi - - - - - st L - - - - - i S - - - - - a S - - - - - a S - - - - - a S - - - - - al Sh - - - - - ige S - - - - - hi Sh - - - - - ig V - - - 9 i V - - - 1 br 0 V 8 8 8 bri V - - - - - i P - - - 91 Ss - - - - - tE 1 1 1 n 0 A.3 Kết khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn cao chiết nƣớc Medinilla sp 20 chủng vi sinh vật thị STT Chủng Medinilla sp (Cao nƣớc) [10 1 1 l l ầ ầ E 10 s Es ch Esc her E n Liste ria L is Sal m Sa l 12 Sal m S a Shigel la 13 11 Shig ella Shige lla V rio V o V h V i 10 Pseu St ap En ter l ầ 1 1 1 1 1 A.4 Kết khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn cao chiết nƣớc Eupatorium sp 20 chủng vi sinh vật thị STT Chủng Eupatorium sp (Cao nƣớc) [10 E s E sc Es l l l ầ ầ ầ Ech n Liste ria L iSal m S al Sa 01 lS aShige 11 21 lla Shig ella Shig 31 41 ella V bri V 51 61 oV 13 1 oV 71 81 iPse10 udo S 92 tE nt 1 A.5 Kết khảo sát hoạt tínhh kháng khuẩn cao chiết nƣớc Elephantopus sp 20 chủng vi sinh vật thị S T T E s Elep hant [10 l l l ầ ầ ầ E sc Es Ech n Liste ria L iSal m S al Sa 01 lS aShige 11 21 lla Shig12 1 ella Shig 2 31 41 ella V bri V 51 61 oV oV 71 81 iPse udo S 92 tE nt A.6 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kháng sinh Ciprofloxacin nhóm vi sinh vật thị C i [1 [ 00 S Chl l lầ l l l T E ủnầ0 ầ0 n ầ1 ầ1 ầ1 1s 3 cE 0 1 2s 2 0 1 E 3 s Đồ án tốt nghiệp E 4n 0 0 0 5L isL 0 i Sal 0 m oS 0 S 0 9a l S 0 a 0 0 S h 0 S h 1 1 S 5 h 116 i 6 114 V 3 i 17 1 V 88 Vi 11 11 i b P 0 s e 0 Sta p 9E h 0 n t 1 2 3 1 1 2 1 1 1 2 2 1 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 2 8 2 111 2.5 1 2 111 2.5 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH KHÁNG KHUẨN CAO CHIẾT NƢỚC CỦA MỘT SỐ MẪU CÂY THUỐC B.1 Hình ảnh kháng khuẩn cao chiết nƣớc mẫu Polygala sp số chủng vi sinh vật gây bệnh B.2 Hình ảnh kháng khuẩn cao chiết nƣớc mẫu Eupatorium sp số chủng vi sinh vật gây bệnh Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XỬ LÍ SỐ LIỆU BẰNG PHẦN MÊM STATGRAPHIC C.1 Kết sử lí thống kê mẫu cao nƣớc Medinilla sp số chủng vi sinh vật thị Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur 7.0 m 7.0 ea 42 Ra 0.0 Va Be tw 0.6 41 0.1 41 25 02 Wi thi 7.7 66 66 To tal 08 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C C M Ho ol 3ou 11 ea X mo E col 13 X Ci pr 16 Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur 16 m 16 ea 10 Ra 0.0 Va Be tw 0.6 66 0.1 66 0.0 00 Wi thi 17 66 66 To tal 33 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD B C M Ho C 3ou 8.6 ea X mo Li s.i 12 66 X Ci pr Đồ án tốt nghiệp Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur Be m 2.6 ea 2.6 Ra 4.5 Va 0.0 tw 66 66 99 Wi 2.3 0.5 thi To 33 5.0 83 tal Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C C M Ho C S ou ea 10 mo X du 83 Ci 12 X pr 16 Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur Be m 0.3 ea 0.3 Ra 1.5 Va 0.2 tw 75 75 87 Wi 1.0 0.2 thi To 1.3 5 tal 75 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C C M Ho C S.t ou ea 12 mo X yp 12 X Ci pr Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur Be m 5.0 ea 5.0 Ra 30 Va 0.0 tw 41 41 25 05 Wi 0.6 0.1 thi To 66 5.7 66 tal 08 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD A C M Ho C 3ou 10 ea X mo 02 08 12 X Ci pr 33 Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur Be m 15 ea 15 Ra 36 Va 0.0 tw 04 04 1.0 00 Wi 0.1 0.0 thi To 66 15 41 tal 20 Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests for A.Col_2 by A.Col_1 Method: 95.0 percent Tukey HSD A C M Ho C 3ou 10 ea X mo 01 57 Ci 13 X pr 16 Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur 19 m 19 ea 46 Ra 0.0 Va Be tw 0.1 2.6 0.0 2.6 24 00 Wi thi 19 66 41 To tal 2.8 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D C M Ho C Ci ou ea 0.0 mo X pr Sh 11 X i.b 33 Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur 0.0 m 0.0 ea 0.2 Ra 0.6 Va Be tw 0.8 41 0.2 41 77 Wi thi 0.8 33 08 To tal 75 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D C M Ho C Ci ou ea 13 mo X pr 16 Sh 13 X i.fl 33 Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur 97 m 97 ea 19 Ra 0.0 Va Be tw 2.0 5.3 0.5 5.3 50 00 Wi thi To 97 tal 7.3 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D C M Ho C Sh ou ea 7.5 mo X i.s Ci 33 X pr Bảng One way ANOVA 10 Đồ án tốt nghiệp So Su Df M F- Pur Be m 13 ea 13 Ra 29 Va 0.0 tw 5 45 05 Wi 1.8 0.4 thi 15 33 58 To tal 33 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD E C M Ho C 3ou 9.1 ea X mo Ps eu 12 66 X Ci pr 16 Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur Be m 2.0 ea 2.0 Ra 49 Va 0.0 tw 41 41 00 02 Wi 0.1 0.0 thi 2.2 66 41 To tal 08 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD E C M Ho C 3ou 11 ea X mo S.a ur 12 X Ci pr 16 Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur Be m 2.0 ea 2.0 Ra 12 Va 0.0 tw 0.6 41 0.1 41 25 24 Wi thi 2.7 66 66 To tal 08 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD E C M Ho C 3ou 10 ea X mo E.f ea 12 83 X Ci pr B.2 Kết xử lí thống kê với mẫu Podocarpus sp số chủng vi sinh vật thị Bảng One – Way ANOVA So Su Df M F- Pur 10 m 10 ea 64 Ra 0.0 Va Be tw 0.6 66 0.1 66 00 01 Wi thi 66 To 11 66 tal 33 11 Đồ án tốt nghiệp Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD B C M Ho C S.t ou ea 9.8 mo X yp 12 33 X Ci pr Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur Be m 70 ea 70 Ra 42 Va 0.0 tw 4.1 4.1 25 00 Wi 0.6 0.1 thi To 66 70 66 tal 4.8 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD B C M Ho C 3ou 11 ea X mo Sh i.s 33 33 X Ci pr Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur Be m 45 ea 45 Ra 18 Va 0.0 tw 9.3 9.3 37 00 Wi 1.0 0.2 thi 46 5 To tal 0.3 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C C M Ho C 3ou 15 ea X mo V 33 X Ci pr Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur Be m 9.3 ea 9.3 Ra 45 Va 0.0 tw 0.8 75 0.2 75 00 02 Wi thi 10 33 08 To tal 20 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD D C M Ho C 3ou 9.6 ea X mo S.a ur 12 66 X Ci pr 16 12 Đồ án tốt nghiệp B.3 Kết xử lí thống kê hiệu suất thu hồi cao nƣớc số mẫu cao nƣớc thuốc Bảng One way ANOVA So Su Df M F- Pur Be m 32 ea 81 Ra 56 Va 0.0 tw 6.4 62 73 00 Wi 14 10 1.4 thi To 38 34 14 38 tal 0.8 Bảng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD C C M Ho ol 3ou 11 ea X mo po 15 99 X ele ph 20 15 X me di po 18 20 X ly eu 52 25 X pat 46 13 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: CÁC THUỐC THỬ DÙNG TRONG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC D.1 Thử nghiệm carbohydrate Thuốc thử Molisch: Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% pha loãng thành 100 ml Thuốc thử Fehling: o Fehling A: Hòa tan 34,6g CuSO4.5H2O vào 500 ml nước cất o Fehling B: Hòa tan 125g KOH 173g KaliNatritartrate.7H2O vào 500 ml nước cất Thuốc thử Barfoed: Thêm 10 ml acid acetic glacial vào 1000 ml nước cất Cân 66,5g copper (II) acetate monohydrate, đổ hỗn hợp vào đem đun, khuấy tan hoàn toàn D.2 Thử nghiệm alkaloid Thuốc thử Mayer : Hòa tan 1,358g HgCl2 60 ml nước, sau đổ vào dung dịch 5g KI pha 10 ml nước Định mức hỗn hợp lên 100 ml Thuốc thử Dragendorff: Gồm dung dịch o Dung dịch A: Hòa tan 0,5g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) 20 ml acid acetic 20% o Dung dịch B: Dung dịch KI 40% pha nước cất o Khi sử dụng trộn 20 ml dung dịch A với ml dung dịch B 70ml nước Thuốc thử Hager: Hòa tan 1g acid picric vào 100 ml nước cất Thuốc thử Wagner: Hòa tan 2g Iodine 6g KI vào 100 ml nước cất D.3 Thử nghiệm cardiac glycosides 14 Đồ án tốt nghiệp 15 Đồ án tốt nghiệp Thu ốc c thử ất Na nitr o pru ssid e: 1g Na nitr ofer ricy ani de bổ sun g 10 ml nướ c 16 ... chiết nước số loại thuốc Nội dung nghiên cứu Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước số loại thuốc dân gian Bước đầu định tính thành phần hóa học cao chiết nước số loại thuốc dân gian Phạm... tài "Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nƣớc số loại thuốc dân gian Vƣờn Quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng" Đề tài Đồ án tốt nghiệp thực Phòng Thí nghiệm Khoa Cơng nghệ Sinh học – Thực... thu hồi cao nước số loại thuốc dân gian .38 Đồ án tốt nghiệp 3.1.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước số loại thuốc dân gian 39 3.2 Kết định tính thành