15.28 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHENOL TRONG VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Phương pháp 1: Nguyên lý Phương pháp dựa vào phản ứng tạo màu thuốc thử Folin với phenol Phương pháp tiến hành Vắc xin mẫu thử ly tâm với vận tốc 3000 vòng/phút 15 phút Bỏ cặn, lấy ml nước cất phía cho vào bình định mức 100 ml cho nước cất vừa đủ 100 ml, lắc Lấy 0,5 ml dung dịch trên, thêm ml nước cất, 0,5 ml thuốc thử Folin (TT) pha loãng lần, ml dung dịch natri carbonat 20% (TT) Lắc Đun cách thủy cho sôi phút Làm nguội nhiệt độ phòng Song song tiến hành xây dựng đường chuẩn: Cách dựng đường chuẩn: Hút dung dịch phenol chuẩn 1: 1000 (TT) vào ống nghiệm với lượng sau: 0,1 ml; 0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml; 0,5 ml; 0,6 ml, 0,7 ml; 0,8 ml; 0,9 ml; 1,0 ml Thêm vào ống nghiệm ống lượng nước cất vừa đủ 9,5 ml; 0,5 ml thuốc thử Folin pha loãng lần; ml dung dịch natri carbonat 20% (TT) Lắc Đun cách thủy cho sôi phút Làm nguội nhiệt độ phòng Song song tiến hành làm mẫu trắng (dùng nước cất thay cho mẫu vắc xin thử nghiệm) Đem so màu máy quang phổ với bước sóng 310 nm (cả với mẫu thử mẫu chuẩn) Cách tính kết quả: a x x 100 x 100 X = ( %) 1.000.000 Trong đó: X : Hàm lượng phenol có mẫu thử (%) ax2 : Hàm lượng phenol có ml mẫu pha lỗng tìm đường chuẩn 100 : Độ pha loãng mẫu thử 100/1.000.000 : Đổi % Tiêu chuẩn chấp thuận Mỗi loại vắc xin, sinh phẩm có tiêu chuẩn khác hàm lượng phenol (dựa vào tiêu chuẩn WHO tiêu chuẩn Việt Nam cho vắc xin hay sinh phẩm đó) Hàm lượng phenol vắc xin thành phẩm nói chung khơng vượt q 0,12 g/lít Trừ quy định cụ thể khác Theo nguyên tắc chung, hàm lượng phenol vắc xin thành phẩm không thấp so với hàm lượng cho thấy có khả kháng khuẩn không cao 115% hàm lượng đăng ký nhãn Pha dung dịch phenol chuẩn: Cân xác 1g phenol (TT) hoà tan vừa đủ 100 ml nước cất Trước dùng pha loãng 1000 lần nước cất Pha dung dịch natri carbonat 20%: Cân 20g natri carbonat (TT) hoà tan vừa đủ 100 ml nước cất Lọc vào chai đựng Phương pháp Mẫu thử trộn để làm thử nghiệm Pha loãng mẫu thử nước cất (nếu cần thiết) để có nồng độ phenol khoảng 15 g/ml Chuẩn bị mẫu phenol chuẩn theo nồng độ g; 10 g; 15 g; 20 g 30 g /ml Lấy ml dung dịch mẫu thử mẫu chuẩn vào ống nghiệm, thêm ml dung dịch đệm borat pH 9,0 ; 5ml dung dịch aminopyrazolon ml dung dịch kali fericyanid Lắc đều, để yên 10 phút, đo quang phổ (Phụ lục 4.1) bước sóng 546 nm Dựa vào đường chuẩn để tính hàm lượng phenol có mẫu thử Cách pha dung dịch đệm borat pH 9,0: Dung dịch A: Hoà tan 6,18g acid boric (TT) vừa đủ 1000 ml dung dịch kali cloride 0,1M Dung dich B: Natri hydroxyd 0,1 M (TT) Trộn 1000 ml dung dịch A với 420 ml dung dịch B thu dung dịch đệm pH 9,0 Cách pha dung dịch aminopyrazolon: Dung dịch 4-aminophenazon 1% dung dịch đệm borat pH 9,0