15.29 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG THIMEROSAL TRONG VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Có phương pháp để xác định hàm lượng thimerosal vắc xin sinh phẩm Tùy theo khả có thiết bị hóa chất sở để chọn phương pháp thử nghiệm sau đây: phương pháp đo quang phổ, hóa học phương pháp vi sinh vật Phương pháp hóa lý Nguyên lý Dựa vào phản ứng giải phóng ion thủy ngân tự từ thimerosal, kết hợp với dithizon thành dithizon-thủy ngân, xác định cách so màu Cách tiến hành Làm song song mẫu (mẫu vắc xin thử mẫu chứng nước cất), lấy 0,2 ml mẫu cho vào bình nút mài riêng biệt có dung tích 100 ml Cho vào bình 1,2 ml acid sulfuric đậm đặc (TT), pha lỗng lần tính theo thể tích đun nhẹ bình số (chứa mẫu vắc xin thử) cách thủy tan hết Thêm vào mối bình ml dung dịch kali permanganat 5% (TT), lắc để yên Loại bỏ kali permanganat thừa cách thêm 1,5 ml dung dịch hydroxylamin clorid 10% (TT), thêm 35ml nước cất lần, ml dung dịch acid acetic M (TT) trộn Dùng buret thêm xác vào bình 10 ml dung dịch dithizon 0,001% lắc 30 giây Chuyển toàn dung dịch thử bình vào bình lắng gạn riêng biệt, tách lớp cloroform qua lớp hấp sấy khô vào ống nghiệm Đo mật độ quang ( Phụ lục 4.1) bước sóng 580 ± 10 nm (kính lọc màu da cam) bước sóng 597 ± 10 nm (kính lọc màu đỏ) Hàm lượng thimerosal (μg/ml) có vacxin thử tính theo cơng thức: a x 100 X= = a x 10,1 0,2 x 49,55 Trong đó: a : lượng thủy ngân (μg) xác định theo đường chuẩn 0,2 : số ml dung dịch vắc xin thử 49,55 : hàm lượng thủy ngân có 100 phần thimerosal Cách dựng đường chuẩn Cân xác 0,5 g thủy ngân, hòa vào 15 ml acid nitric đậm đặc (TT) thêm nước cất vừa đủ 500 ml, dung dịch thủy ngân có hàm lượng mg/ml (DD*) Xác định hàm lượng thủy ngân sau: Lấy 10 ml DD*, cho thêm 10 giọt dung dịch phèn sắt amoni 10% chuẩn độ từ từ với dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (CĐ) xuất màu da cam ml dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (CĐ) tương đương với 0,001- 0,003 g thủy ngân Lấy bình nút mài có dung tích 100 ml để tiến hành song song thí nghiệm với mẫu: 0,4 ml, 0,6 ml, 0,8 ml, 1,0 ml, 1,2 ml dung dịch thủy ngân chuẩn Thêm vào bình 1,2 ml acid sulfuric đậm đặc (TT) pha loãng lần ml nước cất lần Nếu khơng có nước cất lần sử dụng nước xử lý dithizon sau: Cho vào bình gạn 10 ml dung dịch dithizon (TT) (0,01 g ditizon/1 lít nước), sau tách phần cloroform Nếu màu dithizon thay đổi làm làm lại vài lần màu dithizon không thay đổi Thêm ml dung dịch natri clorid 0,9% (TT) ml dung dịch acid acetic M (TT) tiến hành tiếp tục mẫu kiểm tra ghi phần Các kết thu cho phép lập đường chuẩn thủy ngân Cách pha dung dịch dithizon 0,001% - Cân xác 10 mg dithizon hòa tan vào cloroform (TT) thêm vừa đủ 100 ml với dung môi - Bảo quản dung dịch chỗ tối – oC vòng tháng Trước dùng pha loãng 10 lần Phương pháp vi sinh vật Nguyên lý Phương pháp thực dựa hình thành vòng ức chế kháng khuẩn tạo dung dịch thimerosal chuẩn thimerosal có mẫu thử; so sánh đường kính vòng ức chế kháng khuẩn Cách tiến hành Pha thạch thường, đun nóng chảy hồn tồn đổ thạch dày mm lên phiến kính hình chữ nhật phẳng Để thạch nguội hoàn toàn, đục lỗ thạch (đường kính mm) cho khoảng cách lỗ thạch 30 mm Cấy chủng Staphylococcus aureus thạch nghiêng, ủ 37 oC/18 - 24 Gặt pha vi khuẩn nước muối sinh lý vô khuẩn thành huyền dịch 109 vi khuẩn/ml Láng huyền dịch vi khuẩn (0,5 ml/đĩa thạch) đĩa thạch đục lỗ Nhỏ vào lỗ 100 µl dung dịch thimerosal chuẩn chứa g thimerosal/1lít độ pha loãng 1/2,5, 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 Ủ 37 oC/24 Đọc kết Đo đường kính vùng ức chế vi khuẩn mọc đậm độ thimerosal chuẩn, xây dựng đường chuẩn Dựa vào đường chuẩn đường kính vùng ức chế vắc xin mẫu thử để tính hàm lượng thimerosal có vắc xin mẫu thử Tiêu chẩu chấp thuận Hàm lượng thimerosal vacxin sinh phẩm khác tùy theo yêu cầu cụ thể, không thấp hàm lượng cho thấy có khả kháng khuẩn không cao 115% hàm lượng thimerosal ghi nhãn.Yêu cầu chung cho hàm lượng thimerosal vắc xin sinh phẩm có sử dụng thimerosal làm chất bảo quản không vượt 0,02 g% ... 100 µl dung dịch thimerosal chuẩn chứa g thimerosal/ 1lít độ pha loãng 1/2,5, 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 Ủ 37 oC/24 Đọc kết Đo đường kính vùng ức chế vi khuẩn mọc đậm độ thimerosal chuẩn,... lượng thimerosal có vắc xin mẫu thử Tiêu chẩu chấp thuận Hàm lượng thimerosal vacxin sinh phẩm khác tùy theo yêu cầu cụ thể, không thấp hàm lượng cho thấy có khả kháng khuẩn không cao 115% hàm... cho thấy có khả kháng khuẩn không cao 115% hàm lượng thimerosal ghi nhãn.Yêu cầu chung cho hàm lượng thimerosal vắc xin sinh phẩm có sử dụng thimerosal làm chất bảo quản không vượt 0,02 g%