15.34 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN TOÀN PHẦN TRONG VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Protein có vắc xin sinh phẩm xác định theo nhiều phương pháp khác nhau, tùy theo loại vắc xin sinh phẩm Phương pháp Lowry Nguyên lý Protein có mẫu vắc xin thử bị tủa với acid tricloracetic nóng Xác định lượng tủa để tính lượng protein có vắc xin, sinh phẩm Phương pháp tiến hành Pha loãng mẫu thử (nếu cần thiết) để chỉnh hàm lượng protein mẫu thử khoảng 20 - 120 µg/ml Thêm ml dung dịch acid tricloracetic 10% vào ống nghiệm có chứa ml mẫu thử Đun nóng 80OC nồi cách thủy 15 phút Làm nguội nhiệt độ phòng Ly tâm tốc độ 3.500 vòng/phút 30 phút, loại bỏ nước Thêm vào phần lắng cặn ml dung dịch acid tricloracetic 5% Lắc kỹ máy lắc ly tâm lại lần tốc độ 3.500 vòng/phút 30 phút, loại bỏ nước Thêm 2,5 ml dung dịch Alkalin vào ống nghiệm nêu ủ nhiệt độ phòng (thời gian ủ tùy loại mẫu thử) để hòa tan phần lắng cặn Thêm 2,5 ml nước cất 0,5 ml thuốc thử Forlin (pha loãng 1/2), ủ 37 OC 30 phút Ly tâm với tốc độ 3.500 - 6.000 vòng/phút 30 phút (với chế phẩm chứa chất hấp phụ nhôm) Đo mật độ quang học bước sóng 750 nm quang phổ kế Song song tiến hành thử nghiệm với mẫu trắng: thay vào ml mẫu thử ml nước cất Dựng đường chuẩn: Dựng đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn (dung dịch albumin chuẩn nồng độ 25 µg/ml; 50 µg/ml; 100 µg/ml; 150 µg/ml) Dựa vào hàm lượng protein tìm đường chuẩn tính hàm lượng protein có mẫu thử Cách pha dung dịch Alkalin: (pha trước dùng) - Dung dịch đồng sulfat pentahydra 2%t: hòa tan g đồng sulfat pentahydrat vào vừa đủ 100 ml nước cất - Dung dịch natri tartrat 4%: hòa tan g natri tartrat vào vừa đủ 100 ml nước cất - Trộn lẫn dung dịch dung dịch A - Hòa 0,8 g natri hydroxyd g natri carbonat vào vừa đủ 100 ml nước cất dung dịch B - Trộn 50 ml dung dịch B ml dung dịch A dung dịch Alkalin Đo độ hấp thụ thực protein bước sóng 280 nm Nguyên lý Protein dung dịch hấp thụ tia tử ngoại bước sóng 280 nm, có mặt amino acid dãy thơm, chủ yếu tyrosine tryptophan cấu trúc protein Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu thử: Pha loãng mẫu thử đến hàm lượng protein khoảng 0,2 mg/ml đến mg/ml, dung dịch đệm thích hợp Chuẩn bị mẫu chuẩn: Pha loãng mẫu chuẩn dung dịch đệm với mẫu thử có hàm lượng protein tương ứng với mẫu thử Giữ dung dịch mẫu thử mẫu chuẩn nhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ dung dịch cóng thạch anh bước sóng 280 nm, dùng nước cất làm mẫu trắng Hàm lượng protein mẫu thử (CU) tính cơng thức: CU = CS (AU/AS) Trong đó: CS : Hàm lượng protein dung dịch chuẩn AU: Độ hấp thụ mẫu thử AS: Độ hấp thử dung dịch chuẩn Phương pháp Bradford Nguyên lý Dựa kết hợp thuốc nhuộm Coomasie với protein môi trường acid Phương pháp tiến hành Pha loãng mẫu thử nước cất đến hàm lượng thích hợp khoảng đường chuẩn Chuẩn bị dung dịch chuẩn BSA (bovin serum albumin) có hàm lượng khoảng 0,1mg/ml đến 1mg/ml Dùng nước cất làm mẫu trắng Thêm 2,5 ml thuốc nhuộm Coomasie 20% vào 0,05 ml mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thử, lắc Để yên 10 phút nhiệt độ phòng Đo mật độ quang (Phụ lục 4.1) bước sóng 595 nm (khơng dùng cóng thạch anh bị thuốc nhuộm gắn vào) Hàm lượng protein mẫu thử tính tốn dựa vào đường chuẩn Phương pháp đồng/bicinchoninic acid Nguyên lý Dựa vào khử ion Cu2+ thành Cu1+ protein, dùng acid bicinchoninic (BCA) để xác định Cu1+ Phương pháp tiến hành Pha loãng mẫu thử nước cất đến hàm lượng thích hợp khoảng đường chuẩn Pha dung dịch chuẩn nước cất (không nồng độ) có hàm lượng khoảng 10 g/ml đến 1200 g/ml Dùng nước cất làm mẫu trắng Thêm ml thuốc thử đồng-BCA vào 0,1ml mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thử, lắc Ủ nồi cách thuỷ 37 OC 30 phút Làm nguội nhiệt độ phòng 60 phút, đo mật độ quang (Phụ lục 4.1) bước sóng 562 nm, dùng cóng thạch anh Dựa vào đường chuẩn tính hàm lượng protein có mẫu thử Pha thuốc thử BCA: Hòa tan 10 g dinatri bicinchoninat, 20 g natri carbonat monohydrat, 1,6 g natri tatrat, g natri hydroxide 9,5g natri hydrogen carbonate vào nước cất Điều chỉnh pH 11,25 cần dung dịch natri hydroyd dung dịch natri hydrogen carbonate Thêm nước cất vừa đủ 1000 ml, lắc Pha thuốc thử đồng-BCA: Trộn 1ml dung dịch đồng sulfat 40 g/l với 50 ml thuốc thử BCA Phương pháp biuret Nguyên lý Dựa vào tương tác ion Cu2+ với protein dung dịch alkalin, sản phẩm thu có độ hấp thụ cực đại bước sóng 545 nm Phương pháp tiến hành Pha loãng mẫu thử dung dịch nước muối sinh lý đến hàm lượng thích hợp khoảng đường chuẩn Pha dung dịch chuẩn dung dịch nước muối sinh lý (khơng nồng độ) có hàm lượng khoảng từ 0,5 mg/ml đến 10 mg/ml Dùng dung dịch nước muối sinh lý làm mẫu trắng Lấy thể tích dung dịch mẫu thử, thêm đồng lượng dung dịch natri hydroxyid 60 g/l, lắc Ngay cho thuốc thử biuret với lượng 0,4 lần thể tích dung dịch mẫu thử lắc nhanh Để yên nhiệt độ phòng 15 phút Trong vòng 90 phút sau cho thuốc thử biuret, đo mật độ quang (Phụ lục 4.1) mẫu thử bước sóng 545 nm Song song tiến hành với mẫu trắng mẫu chuẩn Dựa vào đường chuẩn tính hàm lượng protein có mẫu thử Pha thuốc thử biuret: Hòa tan 3,46 g đồng sulfat(TT) 10 ml nước cất nóng, để nguội (dung dịch A) Hòa tan 34,6 g natri citrat 20 g natri carbonat khan vào 80 ml nước cất nóng, để nguội (dung dịch B) Trộn dung dịch A B, thêm nước cất vừa đủ 200 ml Dùng tháng, không dùng thấy vẩn đục có tủa Phương pháp quang phổ huỳnh quang Nguyên lý Dựa vào dẫn xuất protein với o-phthalaldehyd chất phản ứng với amin protein (N-terminal amino acid nhóm -amino lysin tồn dư) Phương pháp tiến hành Pha loãng mẫu thử dung dịch nước muối sinh lý đến hàm lượng thích hợp khoảng đường chuẩn Điều chỉnh pH từ đến 10,5 trước thêm thuốc thử phthaldehyd Pha dung dịch chuẩn dung dịch nước muối sinh lý (không nồng độ) có hàm lượng khoảng từ 10 g/ml đến 200 g/ml Điều chỉnh pH pH từ đến 10,5 trước thêm thuốc thử phthaldehyd Dùng dung dịch nước muối sinh lý làm mẫu trắng Trộn 10 l dung dịch mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng với 0,1ml thuốc thử phthaldehyde, để yên nhiệt độ phòng 15 phút Thêm 3ml dung dịch natri hydroxyd 0,5M lắc Đo cường độ huỳnh quang dung dịch mẫu chuẩn mẫu thử bước sóng kích thích 340 nm bước sóng phát xạ 440 445 nm Dựa vào đường chuẩn tính hàm lượng protein có mẫu thử Pha dung dịch đệm borate: Hòa tan 61,83g acid boric nước cất điều chỉnh pH 10,4 dung dịch kali hydroxyd, thêm nước cất vừa đủ 1000ml, lắc Pha dung dịch gốc phthaldehyd: Hòa tan 1,20 g phthalaldehyde 1,5ml methanolm (TT), thêm 100 ml dung dịch đệm borate, lắc Thêm 0,6 ml dung dịch macrogol 23 lauryl ether lắc Bảo quản nhiệt độ phòng sử dung tuần Pha thuốc thử phthaldehyd: Thêm 15 l 2-mercaptoethanol vào 5ml dung dịch gốc phthaldehyd Chuẩn bị dung dung dịch trước dùng 30 phút Sử dụng vòng 24 Tiêu chuẩn chấp thuận Mỗi loại vacxin, sinh phẩm có tiêu chuẩn khác hàm lượng protein toàn phần (dựa vào tiêu chuẩn WHO tiêu chuẩn Việt Nam cho vắc xin hay sinh phẩm đó) ... đục có tủa Phương pháp quang phổ huỳnh quang Nguyên lý Dựa vào dẫn xuất protein với o-phthalaldehyd chất phản ứng với amin protein (N-terminal amino acid nhóm -amino lysin tồn dư) Phương pháp... 0,1ml thuốc thử phthaldehyde, để yên nhiệt độ phòng 15 phút Thêm 3ml dung dịch natri hydroxyd 0,5M lắc Đo cường độ huỳnh quang dung dịch mẫu chuẩn mẫu thử bước sóng kích thích 340 nm bước sóng... bị thuốc nhuộm gắn vào) Hàm lượng protein mẫu thử tính tốn dựa vào đường chuẩn Phương pháp đồng/bicinchoninic acid Nguyên lý Dựa vào khử ion Cu2+ thành Cu1+ protein, dùng acid bicinchoninic (BCA)