Xây dựng mô hình phân loại và dự đoán các chất ức chế bơm ngược pglycoprotein, nora và ứng dụng trong việc sàng lọc các chalcon có khả năng ức chế bơm nora của staphylococcus aureus đa đề kháng thuốc tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGƠ TRIỀU DỦ XÂY DỰNG MƠ HÌNH PHÂN LOẠI VÀ DỰ ĐOÁN CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC P-GLYCOPROTEIN, NORA VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SÀNG LỌC CÁC CHALCON CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BƠM NORA CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐA ĐỀ KHÁNG THUỐC Ngành: Hóa Dược Mã số: 62720403 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2019 Cơng trình hồn thành tại: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: PGS TS THÁI KHẮC MINH PGS TS TRẦN THÀNH ĐẠO Phản biện 1: ……………………………………………… Phản biện ……………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP HCM DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Thai K M., Ngo T D., Tran T D (2013), Molecular modelling on Staphyloccous aureus Nor-a efflux pump inhibitors, Proceeding of The Eighth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh City, Vietnam, ISBN 604660159-2, PO-PC-06, pp 134-139 Thai K M., Ngo T D., Phan T V., Tran T D., Nguyen N V., Nguyen T H., Le M T (2015), “Virtual Screening for Novel Staphylococcus Aureus NorA Efflux Pump Inhibitors From Natural Products”, Medicinal Chemistry, 11(2), pp 135-155 Ngo T D., Tran T D., Le M T., Thai K M (2016), “Computational predictive models for P-glycoprotein inhibition of in-house chalcone derivatives and drugbank compounds”, Molecular Diversity, 20(4), pp 945-961 Ngo T D., Tran T D., Le M T., Thai K M (2016), “Machine learning-, rule- and pharmacophore-based classification on the inhibition of P-glycoprotein and NorA”, SAR and QSAR in Environmental Research, 27(9), pp 747-780 Ngô Triều Dủ, Trần Thành Đạo, Nguyễn Thị Thu Hà, Lê Minh Trí, Thái Khắc Minh (2016), “Dự đốn hoạt tính ức chế p-glycoprotein phương pháp máy học docking”, Y học Thành Phố Hồ Chí Minh, 20(2), tr 131-138 1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN a Đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu Đề kháng đa thuốc (MDR) vấn đề thách thức việc điều trị bệnh ung thư bệnh nhiễm trùng Các khối u vi khuẩn tự bảo vệ khỏi cơng thuốc hóa trị nhiều chế khác nhau, bao gồm đề kháng qua trung gian bơm ngược Trong đó, P-glycoprotein người (Pgp) NorA Staphylococcus aureus hai mục tiêu thuốc chọn đề tài, vai trò chúng việc chuyên chở thuốc tế bào, dẫn đến đề kháng với thuốc kháng ung thư kháng sinh Nhiều nghiên cứu báo cáo chất ức chế P-gp NorA verapamil, reserpin, piperin, capsaicin, osthol, curcumin, … Với chi phí thấp, phương pháp thiết kế thuốc với trợ giúp máy tính (CADD) lựa chọn phù hợp khả thi để tiếp tục nghiên cứu, tìm kiếm chất ức chế bơm ngược nhằm khôi phục hiệu liệu pháp hóa trị tế bào ung thư vi khuẩn đề kháng Đề tài nghiên cứu thực với mục tiêu xây dựng mơ hình phân loa ̣i dự đoán các chấ t ức chế bơm ngươ ̣c Pglycoprotein, NorA ứng du ̣ng viê ̣c sàng lọc các chalcon có khả ức chế bơm NorA S aureus đa đề kháng thuốc Bao gồm bốn nội dung: Xây dựng mơ hình máy tính dựa phối tử, bao gồm: • Các mơ hình học máy đơn lẻ kết hợp giúp phân loại tốt chất ức chế, chất không ức chế P-gp; dự đốn tốt hoạt tính ức chế bơm ngược (IC50) • Các đồ nhận thức chồng phủ phối tử Pgp NorA, qua xác định tính chất lý hóa, dấu vân tay cần thiết để ức chế hai bơm ngược • Mơ hình pharmacophore cho chất ức chế P-gp mạnh điều trị ung thư mơ hình pharmacophore cho chất ức chế NorA không ức chế P-gp điều trị nhiễm trùng Xây dựng mơ hình máy tính dựa cấu trúc (mơ hình tương đồng P-gp) thực docking phân tử nhằm xác định tương tác gắn kết, lực gắn kết phức hợp phối tử-protein Sàng lọc chất “hit” ứng viên ức chế P-gp, NorA hiệu từ hai thư viện nội Ngân hàng Thuốc cơng cụ máy tính thu Đánh giá in vitro khả ức chế bơm ngược NorA chalcon “hit” nội bộ, qua làm giảm đề kháng với ciprofloxacin phối hợp chủng S aureus SA-1199B (biểu lộ mức NorA) số chủng SA lâm sàng b Tính cấp thiết đề tài Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu chưa có thuốc sẵn có cho mục đích chẹn P-gp lâm sàng Mặt khác, chưa có chất ức chế NorA đưa vào thử nghiệm người Trong nỗ lực nghiên cứu tiếp theo, bao gồm nghiên cứu máy tính, khung flavonoid xem xét cho hoạt tính ức chế hai loại bơm ngược Các kết khả quan thu góp phần định hướng cho đề tài thực sàng lọc, thử nghiệm hoạt tính ức chế NorA tập liệu gần 100 chalcon nội với đa dạng nhóm c Những đóng góp luận án Đề tài góp phần xây dựng mơ hình phân loại dự đốn máy tính giúp giải vấn đề nhìn nhận từ nghiên cứu in silico cơng bố trước đó, bao gồm nghi vấn khả ngoại suy (do phát triển từ tập liệu tương đối nhỏ, không đảm bảo tính đa dạng, đồng nhất) hạn chế mơ hình học máy đơn lẻ báo cáo nghiên cứu Ngồi đánh giá thơng kê, khả ứng dụng cơng cụ máy tính thu được kiểm chứng thử nghiệm in vitro chủng vi khuẩn chuẩn biểu lộ mức bơm ngược chủng đề kháng phân lập từ lâm sàng Đồng thời qua đó, ứng viên ức chế bơm ngược tiềm khám phá d Bố cục luận án Luận án gồm 117 trang: mở đầu trang, tổng quan 18 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 24 trang, kết 53 trang, bàn luận 16 trang, kết luận kiến nghị trang Luận án có 21 bảng, 20 hình, 220 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng việt 219 tài liệu tiếng anh, phụ lục thể kết thông tin TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Các bơm ngược nghiên cứu - P-glycoprotein người (P-gp/ABCB1/MDR1): liên họ ABC - NorA S aureus: liên họ MFS 2.2 Các chất ức chế bơm ngược - Các chất ức chế P-gp: hệ I, II, III IV - Các chất ức chế NorA: tự nhiên tổng hợp - Flavonoid, bao gồm chalcon - Các thư viện hóa học sẵn có Zinc, PubChem, ChemSpider, ChEMBL, NuBBE DB, ChemBank, eMolecules, DrugBank, Binding DB, … 2.3 Đề kháng kháng sinh - Sự phát triển đề kháng S aureus kháng thuốc nằm danh sách vi khuẩn đề kháng cần ưu tiên cho nghiên cứu phát triển WHO năm 2017 - Chiến lược đồng sử dụng kháng sinh với chất ức chế bơm 2.4 Các nghiên cứu trước có liên quan Phần lớn nghiên cứu công bố dựa vào phối tử - Các mơ hình phân loại chất ức chế chất không ức chế P-gp (biến nhị phân): nhiều mơ hình trước phát triển từ tập liệu tương đối nhỏ hầu hết mơ hình học máy đơn lẻ, mơ hình kết hợp xây dựng - Các mơ hình dự đốn hoạt tính ức chế P-gp (biến liên tục): khả ứng dụng mơ hình phải bàn cãi chúng tạo từ số lượng phân tử nghiên cứu hạn chế 2.5 Các thuật toán học máy Clementine 12.0 Hạch Binary Classifier sử dụng cho mục đích phân loại (biến nhị phân), cho phép ước tính tối đa mười mơ hình học máy đơn lẻ mạng nơron; C5.0; phân loại hồi quy (C&R Tree); thống kê hiệu quả, không thiên vị, nhanh (QUEST); máy dò tương tác tự động chi bình phương (CHAID); hồi quy logistic; mặt nghiêng định; mạng Bayesian; phân tích phân biệt máy vector hỗ trợ (SVM) Hạch Numeric Predictor sử dụng cho mục đích dự đốn (biến liên tục), cho phép ước tính tối đa sáu mơ hình học máy đơn lẻ mạng nơron; phân loại hồi quy (C&R Tree); máy dò tương tác tự động chi bình phương (CHAID); hồi quy; tuyến tính suy rộng máy vector hỗ trợ (SVM) Hạch Ensemble đưa vào để kết hợp dự đốn từ mơ hình 2.6 Các cơng cụ máy tính khác - Bản đồ nhận thức, pharmacophore: dựa phối tử - Mơ hình hóa tương đồng, docking: dựa cấu trúc protein 2.7 Thử nghiệm tác dụng ức chế bơm ngược chủng vi khuẩn đề kháng Sự tồn chất ức chế chung P-gp NorA gợi ý cho đề tài thực đánh giá tác dụng ức chế bơm ngược chủng vi khuẩn đề kháng Nguyên tắc chất có khả ức chế bơm ngược, làm giảm đề kháng chủng vi khuẩn MDR hệ thống bơm ngược biểu lộ mức với kháng sinh bị đề kháng làm cho trở nên nhạy cảm với kháng sinh chủng tự nhiên Do đó, hiệu ức chế bơm ngược chất thử nghiệm xác định thông qua thử nghiệm đánh giá khả làm giảm giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) kháng sinh chất chủng vi khuẩn đề kháng cách tăng biểu lộ bơm ngược có diện chất thử nghiệm nồng độ cụ thể nhỏ MIC (kiểm tra mẫu chứng khơng có kháng sinh) Trong nghiên cứu này, thử nghiệm MIC kháng sinh thực phương pháp vi pha lỗng mơi trường lỏng ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu đề tài 3.1 Phương pháp nghiên cứu in silico - Các tập liệu chứa 2156, 499 54 chất chọn để xây dựng mô hình phân loại, dự đốn đồ nhận thức - chất ức chế P-gp mạnh chất ức chế chọn lọc NorA chọn để xây dựng pharmacophore tương ứng - 95 chalcon nội (Bộ mơn Hóa Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh) 6874 hợp chất Ngân hàng Thuốc sử dụng cho mục đích sàng lọc 3.2 Phương pháp nghiên cứu in vitro Các thử nghiệm in vitro thực chủng vi khuẩn: S aureus SA-1199 - Tự nhiên, phân lập từ máu bệnh nhân nhiễm trùng huyết - Nhạy cảm với ciprofloxacin S aureus SA-1199B - Đột biến, phân lập từ thỏ với thử nghiệm viêm màng tim - Đề kháng ciprofloxacin biểu lộ mức NorA S aureus lâm sàng - 156 chủng - Phân lập từ mẫu bệnh phẩm Hình 2.2 Xác định MIC ciprofloxacin (Ci) chủng S aureus SA1199 SA-1199B vắng mặt có mặt chất thử nghiệm X nồng độ khác (A = 50 μg/mL, B = 100 μg/mL), qua đánh giá khả ức chế bơm ngược NorA SA chất thử nghiệm 10 4.1.2 Các mơ hình dự đốn hoạt tính ức chế P-gp Đầu tiên, mơ hình học máy đơn lẻ kết hợp xây dựng cho mục đích dự đốn (IC50) từ 34 thơng số mơ tả (PaDEL, MOE) có liên quan chọn Các kết thống kê từ trình đánh giá nội đánh giá ngoại chặt chẽ chứng minh mơ hình kết hợp mơ hình mạnh, giúp khắc phục hạn chế mô hình đơn lẻ dự đốn xác hoạt tính ức chế P-gp cho tập liệu khác điều kiện chung mà không cần sâu lựa chọn tối ưu thông số mơ hình đơn lẻ Bảng 3.6, 3.7, 3.8 3.9 Kết đánh giá nội đánh giá ngoại mơ hình dự đốn kết hợp Thơng số R2 Q2LOO |R2 − Q2LOO | rm r′2m ̅r̅̅2̅ m ∆rm R2r R2p Q2F1 Q2F2 Q2F3 CCC MAE MAE+3*SD Chất lượng dự đoán Tập huấn luyện đa dạng 0,84 0,70 0,14 0,80 0,64 0,72 0,16 0,29 0,62 - Tập đánh giá nội 0,80 0,64 0,72 0,16 0,83 0,83 0,81 0,90 - Tập đánh giá ngoại 0,82 0,67 0,74 0,16 0,83 0,82 0,83 0,90 0,31 0,96 - - Tốt 11 A B Hình 3.1 Đồ thị phân tán mơ hình kết hợp tập liệu: (A) Trên tập huấn luyện tập đánh giá nội; (B) Trên tập đánh giá ngoại 4.1.3 Bản đồ nhận thức ức chế bơm ngược qua trung gian P-gp NorA Từ tập liệu nhỏ 54 chất mà sẵn có thơng tin hoạt tính hai protein P-gp NorA, đồ nhận thức tạo dựa 21 thuộc tính (thơng số mơ tả, dấu vân tay) chọn, sử dụng kỹ thuật đo lường đa hướng MDS ALSCAL trường hợp biến thông số mô tả (thang đo khoảng) kỹ thuật phân tích tương hợp CA trường hợp biến dấu vân tay nhị phân (thang đo danh nghĩa) 12 Hình 3.2 Bản đồ nhận thức đo lường đa hướng (MDS) lớp hoạt tính thơng số mơ tả Hình 3.3 Bản đồ nhận thức phân tích tương hợp (CA) lớp hoạt tính dấu vân tay 4.1.4 Các mơ hình pharmacophore cho hoạt tính ức chế Pgp mạnh cho ức chế chọn lọc NorA Trong trường hợp, truy vấn pharmacophore tạo từ chất có hoạt tính chọn Tiếp theo, ba truy vấn tốt 13 áp dụng để tìm kiếm cho tập liệu 54 chất sử dụng cho mục đích xây dựng đồ nhận thức để tìm truy vấn có kết tìm kiếm tốt Sau đó, truy vấn bổ sung ràng buộc thể tích để chặt chẽ nhằm tăng nhận dạng chất có hoạt tính giảm nhận dạng chất khơng có hoạt tính Truy vấn thu sau áp dụng để tìm kiếm hai tập liệu hình thể 1028/2134 chất 22 chalcon mà sử dụng để phát triển mơ hình phân loại chất ức chế chất khơng ức chế P-gp để tiếp tục đánh giá A A B Hình 3.4 Pharmacophore chất ức chế P-gp mạnh HHHaV (F1, F2, F3: Nhóm kỵ nước; F4: Nhóm nhận liên kết hydro; V: Giới hạn thể tích): (A) Các khoảng cách góc; (B) Với chất có hoạt tính (aripiprazol, ebastin, tariquidar elacridar) B Hình 3.5 Pharmacophore chất ức chế NorA không ức chế P-gp RRHdV (F1, F2: Yếu tố vòng thơm/vòng Pi; F3: Nhóm kỵ nước; F4: Nhóm cho liên kết hydro; V: Giới hạn thể tích): (A) Các khoảng cách góc; (B) Với chất có hoạt tính (20, 21, 30) 14 Các kết đánh giá thu giúp chứng minh mơ hình pharmacophore cho hoạt tính ức chế P-gp mạnh mơ hình pharmacophore cho hoạt tính ức chế NorA khơng ức chế P-gp sử dụng để sàng lọc ảo nhằm tìm kiếm chất ức chế P-gp hiệu chất ức chế NorA an toàn 4.2 Các mơ hình máy tính dựa cấu trúc (mơ hình tương đồng P-gp) Trong bốn mơ hình tương đồng P-gp tạo server tự động I-TASSER, mơ hình có chất lượng đánh giá tốt Trong đồ thị Ramachandran mơ hình 1, 90 % acid amin phát vùng lõi giải thích độ phân giải chưa cao cấu trúc đĩa dùng để xây dựng mơ hình tương đồng (4,35 Å) Túi gắn kết mơ hình dự đốn server cho mục đích docking Bảng 3.13 Bốn mơ hình tương đồng tốt P-gp dự đoán ITASSER với thông tin đĩa thông số ước tính Mơ hình Đĩa sử dụng Cscore 3g61A 0,58 4m1mA 4f4cA 3g5uA 0,96 0,38 -2,11 TMscore RMSD 0,79 ± 0,09 - 8,1 ± 4,4 Å - Số lượng decoy Mật độ đám 1850 0,17 1200 1212 84 0,24 0,14 0,01 15 Hình 3.6 Đồ thị Ramachandran mơ hình tương đồng P-gp tốt Hình 3.7 Mơ hình tương đồng tốt P-gp với vị trí gắn kết phối tử QZ59RRR dự đốn I-TASSER 4.3 Sàng lọc in silico P-gp Các công cụ máy tính sau xây dựng ứng dụng cho hai tập liệu 95 chalcon nội 6874 hợp chất Ngân hàng Thuốc để sàng lọc chất ức chế P-gp, NorA mạnh an toàn 16 Trong trình phân loại chất ức chế chất không ức chế P-gp, 10 chalcon nội F7, F33, F36, F37, F59, F60, F89, F90, F91 F95 9/10 mơ hình (trừ mặt nghiêng định) xác định chất ức chế P-gp Tất mười mơ hình (bao gồm mặt nghiêng định) thống dự đoán 211 hợp chất Ngân hàng Thuốc chất dương tính khả ức chế P-gp Trong q trình dự đốn hoạt tính ức chế P-gp, mơ hình tốt mơ hình kết hợp dự đoán 27 chalcon nội (F4, F5, F6, F7, F11, F14, F16, F17, F18, F29, F30, F32, F33, F34, F35, F36, F37, F44, F45, F61, F63, F65, F88, F89, F90, F91, F95) 2373 hợp chất Ngân hàng Thuốc có giá trị IC50 thấp 15 µM (giá trị ngưỡng để xem chất ức chế P-gp) Trong số 47 hợp chất Ngân hàng Thuốc có giá trị pIC50 dự đoán ≥ 7, amiodaron, tacrolimus, indinavir, ritonavir, cyclosporin saquinavir chất ức chế P-gp biết, theo U.S FDA Trong trình sàng lọc pharmacophore, có chalcon nội F58, F59, F89, F90, F91 69 hợp chất Ngân hàng Thuốc thỏa mãn mơ hình pharmacophore chất ức chế P-gp mạnh (HHHaV); đồng thời có chalcon nội F88, F89, F90, F91 611 hợp chất Ngân hàng Thuốc thỏa mãn mơ hình pharmacophore chất ức chế chọn lọc NorA (RRHdV) Trong trình docking, 95 chalcon nội dock thành công vào túi gắn kết protein mục tiêu với điểm số docking nằm khoảng -23,85 đến -10,83 kJ/mol Ba chalcon có điểm số docking thấp F57, F53 F91 Trong số 47 hợp chất Ngân hàng Thuốc có giá trị IC50 dự đốn thấp nhất, 11 chất khơng 17 dock được, chất có điểm số docking dương 29 chất có điểm số docking âm (-20,06 đến -0,01 kJ/mol) Ba hợp chất Ngân hàng Thuốc có điểm số docking thấp DB04869 (olcegepant); DB01232 (saquinavir) DB02785 Các acid amin chịu trách nhiệm cho tương tác gắn kết phối tử - protein (liên kết hydro, aren-cation kỵ nước) xác định túi gắn kết thuốc đặt mặt phân giới TM3/TM11 tái khẳng định Hình 3.12 Hình ảnh docking vào mơ hình tương đồng P-gp chalcon F91 4.4 Sàng lọc in silico in vitro đánh giá tác dụng ức chế bơm ngược NorA S aureus số chalcon nội Bốn chalcon nội F29, F88, F90 F91 (có kết sàng lọc in silico P-gp tốt mẫu thử sẵn có) chọn để thực dự đốn máy tính mơ hình dự đốn IC50 tốt NorA (mơ hình D) mơ hình tương đồng bơm ngược tạo nghiên cứu khác chúng tôi, trước tiến hành thử nghiệm tác dụng ức chế bơm ngược vi khuẩn 18 Bảng 3.16 Kết dự đốn hoạt tính ức chế NorA mơ hình D docking vào mơ hình tương đồng protein chalcon “hit” Chất rings balabanJ logS pIC50 dự đoán F29 F88 F90 F91 4 1,85 1,26 1,25 1,21 -3,75 -6,92 -6,29 -6,12 4,05 5,42 5,28 5,30 IC50 dự đốn (µM) 88,27 3,84 5,24 5,07 Điểm số docking (kJ/mol) Khoang Walker trung B tâm -23,67 -26,69 -22,65 -29,06 -23,76 -30,33 -24,96 -27,78 Bảng 3.17 Giá trị MIC (μg/mL) ciprofloxacin chủng S aureus SA-1199 SA-1199B vắng mặt có mặt chalcon nghiên cứu MIC SA-1199 SA-1199B Ciprofloxacin < 0,125 µg/mL µg/mL Ciprofloxacin + F29a < 0,125 µg/mL µg/mL Ciprofloxacin + F29b < 0,125 µg/mL µg/mL Ciprofloxacin + F88a < 0,125 µg/mL µg/mL Ciprofloxacin + F88b < 0,125 µg/mL µg/mL Ciprofloxacin + F90a < 0,125 µg/mL µg/mL Ciprofloxacin + F90b < 0,125 µg/mL µg/mL Ciprofloxacin + F91a < 0,125 µg/mL µg/mL Ciprofloxacin + F91b < 0,125 µg/mL µg/mL a50 µg/mL; b100 µg/mL Bảng 3.18 Mười chủng S aureus lâm sàng chọn chất ức chế bơm PaβN C = 20 µg/mL để thử nghiệm tác dụng ức chế bơm ngược MIC MIC Chủng MRSA ciprofloxacin ciprofloxacin SA (µg/mL) (X) (µg/mL) + PaβN (Y) I16.1412 + 32 I16.1421 0,25 I16.1461 + 64 16 I16.1505 + 64 16 I16.1562 + 64 16 I16.1604 + 16 I16.1617 + 32 I16.1635 + 32 I16.1672 + 32 I16.1773 32 + Tỷ số X/Y 19 Bảng 3.19 Giá trị MIC (μg/mL) ciprofloxacin (Ci) chủng S aureus lâm sàng vắng mặt có mặt chalcon nghiên cứu C = 20 µg/mL MIC Ci MIC Ci MIC Ci MIC Ci Chủng MIC Ci (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) SA (µg/mL) + F29 + F88 + F90 + F91 I16.1412 16 16 16 16 16 I16.1421 0,5 0,5 0,125 0,125 0,125 I16.1461 32 32 32 32 32 I16.1505 32 32 32 32 16 I16.1562 32 32 32 32 16 I16.1604 16 16 16 16 16 I16.1617 16 16 16 16 16 I16.1635 32 32 16 16 16 I16.1672 32 16 16 16 16 I16.1773 16 16 16 16 16 BÀN LUẬN 5.1 Các mơ hình máy tính dựa phối tử 5.1.1 Các mơ hình phân loại chất ức chế chất khơng ức chế P-gp Trong nghiên cứu với cơng trình Cruciani cộng (2011), Hou cộng (2011), Ecker cộng (2012), (2014), Nantasenamat cộng (2015), Schyman cộng (2016), Worachartcheewan cộng (2017), Tseng cộng (2019) sử dụng tập liệu lớn với 1000 - 2000 phân tử, nghiên cứu lại dựa tập liệu tương đối nhỏ Hiện có mơ hình kết hợp xây dựng, mơ hình kết hợp mạng nơron nhân tạo SVM Éric cộng (2014), sử dụng phương pháp bầu chọn đơn giản (simple voting), áp dụng nguyên tắc số đông Nghiên cứu sử dụng phương pháp bầu chọn dựa trọng số độ tin cậy (confidence-weighted 20 voting), dự đốn với độ tin cậy cao chọn trường hợp Ngoài ra, vai trò tính cồng kềnh mặt cấu trúc, khả tích điện, ngun tử N, nhóm nhận cho hydro khẳng định việc xác định chất ức chế P-gp thông qua nghiên cứu 5.1.2 Các mơ hình dự đốn hoạt tính ức chế P-gp Trước đó, nhiều nghiên cứu dự đốn pIC50/pKd sử dụng phương pháp từ đơn giản đến phức tạp, thu kết thống kê tốt giúp xác định yếu tố cấu trúc cần thiết cho đảo ngược MDR qua trung gian P-gp Tuy nhiên, khả ứng dụng mô hình nói phải bàn cãi chúng tạo từ số lượng phân tử nghiên cứu hạn chế Các mơ hình nghiên cứu xây dựng từ tập liệu đủ lớn đa dạng, thơng tin hoạt tính sinh học so sánh với nhau; đồng thời thỏa mãn điều kiện đánh giá chặt chẽ qua giúp khắc phục vấn đề khả ngoại suy Nghiên cứu nhấn mạnh tính chất lý hóa cần thiết cho ức chế P-gp diện tích bề mặt, khả phân cực, liên kết hydro, tính thân dầu, trọng lượng phân tử, chuỗi béo dài khả tích điện dương đề cập nghiên cứu trước 5.1.3 Bản đồ nhận thức ức chế bơm ngược qua trung gian P-gp NorA Bảy quy tắc phân biệt lớp hoạt tính P-gp NorA: 21 Quy tắc để phân biệt (P, D) & (A, N) P, D: nHCsatu, minHCsatu, ETA_BetaP_ns_d, MDEO-22, MACCSFP144, Pubchem trội hơn; A, N: BCUT_PEOE_2, GCUT_PEOE_2 trội Quy tắc để phân biệt (P, A) & (D, N) P, A: ATSC2m trội hơn; D, N: AATSC6v trội Quy tắc để phân biệt P, D & (A, N) D: kích thước lớn; A/N: kích thước trung bình; P: kích thước nhỏ Quy tắc để phân biệt P & D P: ATSC4m trội hơn; D: SpMAD_DzZ, ASP-3, AVP-6 trội Quy tắc để phân biệt P & (A, D, N) P: balabanJ, AATSC4s, MATS4s trội Quy tắc để phân biệt A & (P, D, N) A: Q_VSA_FNEG trội Quy tắc để phân biệt D & (P, A, N) D: ATSC1s, MACCSFP128 trội 5.1.4 Các mơ hình pharmacophore cho hoạt tính ức chế Pgp mạnh cho ức chế chọn lọc NorA Bổ sung cho kết luận Carosati cộng (2012): - Ức chế hai bơm: tính kỵ nước (nhiều với P-gp) 01 nhóm nhận liên kết H - Ức chế NorA: vòng thơm 01 nhóm cho liên kết H Chất ức chế NorA không ức chế P-gp tránh tương tác thuốc nguy hiểm qua trung gian P-gp sử dụng phối hợp điều trị nhiễm trùng 22 5.2 Mơ hình tương đồng P-gp Để thu mơ hình tương đồng có chất lượng cao đòi hỏi protein đĩa vừa phải có độ phân giải cao, vừa phải có giống mức độ cao trình tự với protein mục tiêu Cấu trúc tia X P-gp chuột sử dụng nghiên cứu 3g61 có độ phân giải 4,35 Å; 87 % trình tự giống với P-gp người gần 100 % acid amin giống khoang gắn kết Trong cấu trúc này, diện phối tử tham khảo (QZ59-RRR) cần thiết để dự đốn vị trí gắn kết I-TASSER để xác định xác vùng khơng gian cho mục đích docking LeadIT 5.3 Sàng lọc in silico 5.3.1 Khả ức chế P-gp Sự đồng thuận phương pháp máy tính việc dự đoán ba chalcon nội F89, F90 F91 hứa hẹn cho hoạt tính ức chế P-gp NorA, F88 ứng viên tiềm để ức chế NorA Sự đồng thuận ghi nhận 17 hợp chất Ngân hàng Thuốc cho khả ức chế P-gp 5.3.2 Khả ức chế NorA Cả bốn chalcon nội F29, F88, F90 F91 gắn kết tốt vào khoang trung tâm Walker B mô hình tương đồng NorA Nhưng ba dẫn xuất F88, F90 F91 mơ hình D dự đốn có khả ức chế NorA hiệu chúng có tính tan nước (logS < -6,0) Theo 07 quy tắc rút từ 02 đồ nhận thức, chalcon F29 thiên ức chế P-gp NorA 23 5.4 Thử nghiệm in vitro Kết sàng lọc in silico thử nghiệm in vitro chứng minh chalcon F88 F90 ứng viên ức chế NorA tiềm năng, giúp điều hòa MDR bệnh nhiễm trùng (làm giảm MIC ciprofloxacin từ - lần chủng S aureus đề kháng SA-1199B số chủng lâm sàng) Khả áp dụng công cụ in silico cho việc dự đoán ức chế P-gp NorA khẳng định lại nghiên cứu thực nghiệm, bên cạnh đánh giá thống kê máy tính Đồng thời, số mối quan hệ cấu trúc - tác dụng (SAR) rút từ 04 chalcon thử nghiệm Các yếu tố cấu trúc ghi nhận liên quan đến độc tính mạnh chọn lọc tế bào ung thư chalcon dị vòng (F88, F90) thơng qua nghiên cứu khác KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thực mục tiêu đặt ban đầu với bốn nội dung Cụ thể: Trong phương pháp dựa vào phối tử, kết đạt là: mô hình học máy có khả phân loại tốt chất ức chế chất không ức chế P-gp; mô hình học máy có khả dự đốn tốt hoạt tính ức chế P-gp (IC50); hai đồ nhận thức bảy quy tắc chồng phủ phối tử Pgp NorA; yếu tố pharmacophore chất ức chế Pgp mạnh chất ức chế NorA không ức chế P-gp Trong phương pháp dựa vào cấu trúc protein, mơ hình tương đồng P-gp tạo cho docking phân tử 24 Các chất “hit” ứng viên ức chế P-gp, NorA nhận diện máy tính Các chalcon “lead” (F88, F90) có khả ức chế bơm ngược NorA S aureus xác định thông qua thử nghiệm in vitro Qua đó, số kiến nghị rút cho hướng nghiên cứu bơm ngược chất ức chế bơm: - Về phương diện máy tính, ứng dụng phần mềm, thuật toán giúp khắc phục hạn chế phương pháp có; sử dụng cấu trúc tinh thể phân giải protein màng (nếu có) để thay cho mơ hình tương đồng; phát triển tập liệu sinh học lớn, đa dạng đồng - Nghiên cứu riêng lẻ kết hợp số bơm ngược khác người vi khuẩn; xem xét khả tương tác thuốc hiệu ức chế bơm, độ an toàn độc tính chất nghiên cứu - Đối với chất “hit”, tiến hành tổng hợp thử nghiệm với nhiều mơ hình in vitro in vivo khác Đối với chất “lead”, nghiên cứu tối ưu hóa cấu trúc trước tiến hành bước thực nghiệm sâu - Có thể cân nhắc số chiến lược Hóa Dược khác phát triển chất hướng đặc hiệu đến tế bào đề kháng, chất làm giảm biểu lộ bơm ngược cách biến đổi đường tín hiệu tế bào, … ngồi phạm vi Hóa Dược sử dụng kỹ thuật nano (vi hạt, polymer) giúp chuyển giao thuốc liều cao đến mục tiêu điều trị ... ức chế bơm ngược chủng vi khuẩn đề kháng Sự tồn chất ức chế chung P-gp NorA gợi ý cho đề tài thực đánh giá tác dụng ức chế bơm ngược chủng vi khuẩn đề kháng Nguyên tắc chất có khả ức chế bơm ngược, ... - Các tập liệu chứa 2156, 499 54 chất chọn để xây dựng mơ hình phân loại, dự đốn đồ nhận thức - chất ức chế P-gp mạnh chất ức chế chọn lọc NorA chọn để xây dựng pharmacophore tương ứng - 95 chalcon. .. tính sau xây dựng ứng dụng cho hai tập liệu 95 chalcon nội 6874 hợp chất Ngân hàng Thuốc để sàng lọc chất ức chế P-gp, NorA mạnh an tồn 16 Trong q trình phân loại chất ức chế chất không ức chế P-gp,