XÂY DỰNG MÔ HÌNH PHÂN LOẠI VÀ DỰ ĐOÁN CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC P-GLYCOPROTEIN, NORA VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SÀNG LỌC CÁC CHALCON

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀ NH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGÔ TRIỀU DỦ XÂY DỰNG MƠ HÌNH PHÂN LOẠI VÀ DỰ ĐOÁN CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC P-GLYCOPROTEIN, NORA VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SÀNG LỌC CÁC CHALCON CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BƠM NORA CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐA ĐỀ KHÁNG THUỐC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀ NH PHỐ HỜ CHÍ MINH NGƠ TRIỀU DỦ XÂY DỰNG MƠ HÌNH PHÂN LOẠI VÀ DỰ ĐOÁN CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NGƯỢC P-GLYCOPROTEIN, NORA VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SÀNG LỌC CÁC CHALCON CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ BƠM NORA CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐA ĐỀ KHÁNG THUỐC NGÀNH: HÓA DƯỢC MÃ SỐ: 62720403 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS THÁI KHẮC MINH PGS TS TRẦN THÀNH ĐẠO TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận án Ngô Triều Dủ MỤC LỤC Trang Danh mục chữ viết tắt, thuật ngữ i Danh mục bảng ii Danh mục hình, đồ thị iv MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bơm ngược nghiên cứu 1.2 Các chất ức chế bơm ngược đề kháng đa thuốc 1.3 Đề kháng kháng sinh 12 1.4 Các nghiên cứu trước có liên quan 14 1.5 Các thuật toán học máy Clementine 12.0 14 1.6 Các công cụ máy tính khác 15 1.7 Thử nghiệm tác dụng ức chế bơm ngược chủng vi khuẩn đề kháng 18 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu in silico 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu in vitro 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ 46 3.1 Các mơ hình máy tính dựa phối tử 46 3.2 Các mơ hình máy tính dựa cấu trúc (mơ hình tương đồng P-gp) 70 3.3 Sàng lọc in silico P-gp 73 3.4 Sàng lọc in silico thử nghiệm in vitro đánh giá tác dụng ức chế bơm ngược NorA S aureus số chalcon nội 88 CHƯƠNG BÀN LUẬN 99 4.1 Các mơ hình máy tính dựa phối tử 99 4.2 Mơ hình tương đồng P-gp 110 4.3 Sàng lọc in silico 111 4.4 Thử nghiệm in vitro 112 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 115 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, THUẬT NGỮ Chữ viết tắt ABC ADMET Ci EPI GA-PLS Chữ viết đầy đủ ATP Binding Cassette Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion and Toxicity Ciprofloxacin Efflux Pump Inhibitor Efflux Pump Inhibition Genetic Algorithm-Partial Least Square in silico MDR MFS MIC MRSA Multidrug Resistance Major Facilitator Superfamily Minimum Inhibitory Concentration Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus NorA QZ59-RRR RF Phenyl-arginin-betanaphthylamid P-glycoprotein Quantitative Structure-Activity Relationship Cyclic-tris-(R)-valineselenazol Reversal Fold RMSD Root Mean Square Deviation SAR SMI S aureus 2D 3D Structure-Activity Relationship Small Molecule Inhibitor Staphylococcus aureus Two-Dimension Three-Dimension PaβN P-gp QSAR Nghĩa tiếng Việt/Định nghĩa Họ protein chuyên chở phụ thuộc ATP Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ độc tính Chất ức chế bơm ngược Sự ức chế bơm ngược Bình phương tối thiểu-thuật toán di truyền Thực máy tính thơng qua mơ máy tính Đề kháng đa thuốc Liên họ trợ giúp Nồng độ ức chế tối thiểu Staphylococcus aureus đề kháng methicillin Bơm ngược MFS Staphylococcus aureus Mối quan hệ định lượng cấu trúc - tác dụng Số lần đảo ngược Căn bậc hai độ lệch bình phương trung bình Mối quan hệ cấu trúc - tác dụng Chất ức chế phân tử nhỏ Hai chiều Ba chiều ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Kết dự đoán tập huấn luyện tập đánh giá nội với phân chia đa dạng 48 Bảng 3.2 Kết dự đoán tập huấn luyện tập đánh giá nội với phân chia ngẫu nhiên 49 Bảng 3.3 Kết đánh giá chéo 10 lần y ngẫu nhiên tập huấn luyện đa dạng 52 Bảng 3.4 Kết dự đoán tập đánh giá ngoại mơ hình tạo từ tập huấn luyện đa dạng 53 Bảng 3.5 Sáu mơ hình đơn lẻ tạo với giá trị R2 chúng tập huấn luyện tập đánh giá nội, theo hai kiểu phân chia liệu đa dạng ngẫu nhiên 55 Bảng 3.6 Kết đánh giá nội mơ hình dự đốn tạo từ tập huấn luyện đa dạng 57 Bảng 3.7 Kết đánh giá mơ hình dự đốn tập đánh giá nội 57 Bảng 3.8 Kết đánh giá truyền thống mơ hình dự đốn tập đánh giá ngoại 58 Bảng 3.9 Kết đánh giá mơ hình dự đốn tập đánh giá ngoại, sử dụng điều kiện dựa MAE áp dụng cho 95 % liệu 59 Bảng 3.10 Các giá trị thống kê trình chia tỷ lệ, sử dụng kỹ thuật đo lường đa hướng (MDS ALSCAL) 62 Bảng 3.11 Giá trị phương sai hướng, dấu vân tay lớp hoạt tính q trình giảm hướng, sử dụng kỹ thuật phân tích tương hợp (CA) 62 iii Bảng 3.12 Ba giả thuyết pharmacophore tốt cho chất ức chế P-gp mạnh chất ức chế chọn lọc NorA với giá trị thống kê chúng 65 Bảng 3.13 Bốn mơ hình tương đồng tốt P-gp dự đốn I-TASSER với thơng tin đĩa thơng số ước tính 70 Bảng 3.14 Tóm tắt kết sàng lọc in silico 95 chalcon nội 75 Bảng 3.15 Tóm tắt kết sàng lọc in silico 47 chất từ Ngân hàng Thuốc với giá trị pIC50 P-gp dự đốn mơ hình kết hợp ≥ 80 Bảng 3.16 Kết dự đốn hoạt tính ức chế NorA mơ hình D docking vào mơ hình tương đồng protein chalcon “hit” 90 Bảng 3.17 Giá trị MIC (μg/mL) ciprofloxacin chủng S aureus SA-1199 SA-1199B vắng mặt có mặt chalcon nghiên cứu 92 Bảng 3.18 Giá trị MIC (μg/mL) ciprofloxacin chủng S aureus lâm sàng vắng mặt có mặt chất ức chế bơm PaβN 93 Bảng 3.19 Giá trị MIC (μg/mL) ciprofloxacin (Ci) chủng S aureus lâm sàng vắng mặt có mặt chalcon nghiên cứu 98 Bảng 4.1 Tóm tắt mơ hình phân loại chất ức chế chất không ức chế P-gp công bố nghiên cứu trước nghiên cứu 99 Bảng 4.2 Tóm tắt mơ hình QSAR hai chiều dự đốn hoạt tính ức chế P-gp (biến liên tục) công bố nghiên cứu trước nghiên cứu 104 iv DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu trúc P-gp chuột: (A) mặt trước (B) mặt sau Các domain xuyên màng domain gắn kết nucleotid đánh dấu từ TM 1-12 NBD 1-2 Nửa N tận nửa C tận tô màu vàng xanh Các TM 4-5 TM 10-11 tạo thành giao diện xoắn vào giúp ổn định hình thể hưởng vào Các ngang đại diện cho vị trí xấp xỉ lớp lipid kép “Nguồn: Aller S G., Yu J., Ward A., et al., 2009” [4] Hình 1.2 Giản đồ cấu trúc họ protein bơm ngược đề kháng đa thuốc MFS tạo phần mềm UCSF Chimera 1.10 từ lactose permease E coli (LacY) “Nguồn: Schindler B D., Kaatz G W., 2016” [161] Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu đề tài 22 Hình 2.2 Bố trí thử nghiệm in vitro xác định MIC ciprofloxacin (Ci) chủng S aureus SA-1199 SA-1199B vắng mặt có mặt chất thử nghiệm X nồng độ khác (A, B μg/mL), qua đánh giá khả ức chế bơm ngược NorA SA chất thử nghiệm Trong hàng ngang đĩa, tất giếng chứa kháng sinh (trừ giếng số 11) cho lượng loại vi khuẩn giếng kiểm soát C (chứa vi khuẩn khơng có kháng sinh) 43 Hình 2.3 Bố trí thử nghiệm in vitro xác định MIC ciprofloxacin (Ci) chủng S aureus phân lập từ lâm sàng vắng mặt có mặt chất ức chế bơm biết PaβN nồng độ C = 20 μg/mL, qua chọn lọc chủng SA lâm sàng có biểu lộ mức bơm ngược Trong hàng ngang đĩa, tất giếng chứa kháng sinh (trừ giếng số 11) cho lượng loại vi khuẩn giếng kiểm soát C (chứa vi khuẩn khơng có kháng sinh) 44 v Hình 2.4 Bố trí thử nghiệm in vitro xác định MIC ciprofloxacin (Ci) chủng S aureus phân lập từ lâm sàng có biểu lộ mức bơm ngược, vắng mặt có mặt chất thử nghiệm X1, X2, …, Xn nồng độ C = 20 μg/mL, qua đánh giá khả ức chế bơm ngược SA lâm sàng chất thử nghiệm Trong hàng ngang đĩa, tất giếng chứa kháng sinh (trừ giếng số 11) cho lượng loại vi khuẩn giếng kiểm soát C (chứa vi khuẩn khơng có kháng sinh) 45 Hình 3.1 Đồ thị phân tán mơ hình kết hợp tập liệu: (A) Trên tập huấn luyện tập đánh giá nội; (B) Trên tập đánh giá ngoại 60 Hình 3.2 Bản đồ nhận thức đo lường đa hướng (MDS) lớp hoạt tính thông số mô tả P: Chất ức chế P-gp; A: Chất ức chế NorA; D: Chất ức chế P-gp NorA; N: Chất không ức chế P-gp NorA; dia: diameter; BP2: BCUT_PEOE_2; GP2: GCUT_PEOE_2; bJ: balabanJ; QVF: Q_VSA_FNEG; A2m: ATSC2m; A4m: ATSC4m; A1s: ATSC1s; AA6v: AATSC6v; AA4s: AATSC4s; M4s: MATS4s; SpM: SpMAD_DzZ; ASP3: ASP-3; AVP6: AVP-6; nHCs: nHCsatu; minHCs: minHCsatu; EBPnsd: ETA_BetaP_ns_d; MDEO22: MDEO-22 63 Hình 3.3 Bản đồ nhận thức phân tích tương hợp (CA) lớp hoạt tính dấu vân tay P: Chất ức chế P-gp; A: Chất ức chế NorA; D: Chất ức chế P-gp NorA; N: Chất không ức chế P-gp NorA; MFP128: MACCSFP128; MFP144: MACCSFP144; PFP2: PubchemFP2 64 Hình 3.4 Mơ hình pharmacophore chất ức chế P-gp mạnh (F1, F2, F3: Nhóm kỵ nước; F4: Nhóm nhận liên kết hydro; V: Giới hạn thể tích): (A) Các khoảng cách góc; (B) Với diện chất có hoạt tính (aripiprazol, ebastin, tariquidar elacridar) 67 59 Bảng 3.9 Kết đánh giá mơ hình dự đốn tập đánh giá ngoại, sử dụng điều kiện dựa MAE áp dụng cho 95 % liệu Thông số CHAID C&R Tree Hồi quy SVM MAE MAE+3*SD Chất lượng dự đoán 0,37 1,19 0,38 1,10 0,33 0,98 0,29 0,90 Mạng nơron 0,36 1,11 Trung bình Trung bình Tốt Tốt Trung bình Ensemble 0,31 0,96 Tốt Bằng phân tích định lượng, Gramatica Chirico [27] nhấn mạnh tầm quan trọng việc đánh giá đồ thị phân tán liệu thực nghiệm liệu dự đoán, giúp phát mơ hình QSAR khơng thể chấp nhận với giá trị thống kê tốt Các đồ thị hồi quy giá trị pIC50 dự đoán giá trị pIC50 quan sát bơm ngược P-gp biểu diễn cho mơ hình kết hợp trường hợp tập huấn luyện tập đánh giá nội (Hình 3.1A) tập đánh giá ngoại (Hình 3.1B) Các điểm liệu nằm dọc theo đường hồi quy cho thấy tương quan tốt giá trị thực nghiệm dự đoán tất tập liệu Nói cách khác, mơ hình kết hợp tạo phù hợp tốt với liệu 60 A B Hình 3.1 Đồ thị phân tán mơ hình kết hợp tập liệu: (A) Trên tập huấn luyện tập đánh giá nội; (B) Trên tập đánh giá ngoại 3.1.3 Bản đồ nhận thức ức chế bơm ngược qua trung gian P-gp NorA Trước đó, Carosati cộng [17] Vishwakarma cộng [77] xem xét hỗn tạp phối tử bơm ngược P-gp người NorA S aureus tiết lộ có chồng phủ chất ức chế hai loại bơm ngược Do số lượng 61 hạn chế chất thu thập từ tài liệu mà sẵn có thơng tin hoạt tính hai protein [17], [60], [77], [79], [82], [86], [94], [114], [120], [162], đồ nhận thức phát triển thay cho mơ hình phân loại đa lớp xây dựng trước [180] để làm rõ tính chất cần thiết cho ức chế số hai protein chun chở Q trình tính tốn lựa chọn thuộc tính mơ tả áp dụng cho tập liệu nhỏ 54 chất Sự lựa chọn biến không bao gồm kỹ thuật tối ưu hóa thuật tốn di truyền thu 18 thơng số mơ tả lý hóa dấu vân tay từ 2977 thông số mô tả dấu vân tay tính tốn ban đầu Trong số đó, thơng số mơ tả MOE biểu thị tính chất ma trận gần kề cách xa (4 thông số) điện tích phần (1 thơng số), 13 thông số mô tả PaDEL biểu thị tính chất tự tương quan (6 thơng số), ma trận Barysz (1 thông số), đường chi (2 thông số), trạng thái điện tử topo loại nguyên tử (2 thông số), ngun tử hóa học topo mở rộng (1 thơng số) đường biên khoảng cách phân tử (1 thông số) chất tập liệu Cả hai loại thông số mô tả chia tỷ lệ khoảng [0, 1] trước xây dựng đồ Trong dấu vân tay chọn, có chuỗi MACCS, chuỗi Pubchem khơng có chuỗi cấu trúc Tất thuộc tính cách viết tắt chúng liệt kê trình bày Phụ lục Tiếp theo, kỹ thuật đo lường đa hướng MDS ALSCAL sử dụng trường hợp thông số mô tả (thang đo khoảng) kỹ thuật phân tích tương hợp CA sử dụng trường hợp dấu vân tay nhị phân (thang đo danh nghĩa) để thực lập đồ nhận thức Với điều kiện độ hội tụ S-stress 0,001; giá trị Stress tối thiểu 0,005 số vòng lặp tối đa 30, trình MDS dừng lại vòng lặp thứ trường hợp thơng số mơ tả vòng lặp thứ trường hợp lớp hoạt tính, mức độ cải thiện S-stress nhỏ 0,001 Các giá trị Stress nhỏ 0,1 giá trị hệ số tương quan bình phương (squared correlation - RSQ) lớn 0,9 (Bảng 3.10) cho thấy mối tương quan mạnh khác biệt khoảng cách Tất giá trị phương sai trình giảm hướng CA liệt kê Bảng 3.11 Phương sai tổng cộng 0,125 phản ánh 62 12,5 % khác biệt giải thích hai hướng ba dấu vân tay bốn lớp hoạt tính Bảng 3.10 Các giá trị thống kê trình chia tỷ lệ, sử dụng kỹ thuật đo lường đa hướng (MDS ALSCAL) Lịch sử vòng lặp Giữa biến (các thông số mô tả) Giữa trường hợp (các lớp hoạt tính) Vòng lặp S-stressa 0,09731 0,07076 0,06776 0,06747 0,05764 0,05516 0,05513 Sự cải thiện 0,02656 0,00300 0,00029 0,00248 0,00003 Stress tương quan bình phương (RSQ) khoảng cách cho ma trận Stressb RSQc 0,06562 0,98219 0,09656 0,94377 Công thức S-stress Young sử dụng Các giá trị Stress công thức stress Kruskal C Các giá trị RSQ (squared correlation) tỷ lệ phương sai liệu chia tỷ lệ (các khác biệt) phân chia (hàng, ma trận, tồn liệu), giải thích khoảng cách tương ứng chúng a b Bảng 3.11 Giá trị phương sai hướng, dấu vân tay lớp hoạt tính trình giảm hướng, sử dụng kỹ thuật phân tích tương hợp (CA) Hướng Tổng Phương sai 0,073 0,051 0,125 Dấu vân tay MACCSFP128 MACCSFP144 PubchemFP2 Tổng Phương sai 0,057 0,033 0,035 0,125 Hoạt tính A D N P Tổng Phương sai 0,041 0,036 0,014 0,034 0,125 Các đồ nhận thức MDS CA bốn trường hợp đại diện cho lớp hoạt tính (P, A, D, N) 21 biến chọn đại diện cho thông số mô tả dấu vân tay thể Hình 3.2 Hình 3.3 Trong đồ MDS, điểm đại diện cho trường hợp định vị bốn góc phần tư khác điểm đại diện cho biến phân tán xung quanh điểm giao hai trục Trong đồ CA, điểm trường hợp biến phân bố theo cách tương tự để trống góc phần tư phía bên trái Hai điểm A N nằm gần 63 hai đồ ngụ ý chất ức chế NorA không ức chế P-gp chất không ức chế hai protein giống tính chất xem xét Hình 3.2 Bản đồ nhận thức đo lường đa hướng (MDS) lớp hoạt tính thơng số mơ tả P: Chất ức chế P-gp; A: Chất ức chế NorA; D: Chất ức chế P-gp NorA; N: Chất không ức chế P-gp NorA; dia: diameter; BP2: BCUT_PEOE_2; GP2: GCUT_PEOE_2; bJ: balabanJ; QVF: Q_VSA_FNEG; A2m: ATSC2m; A4m: ATSC4m; A1s: ATSC1s; AA6v: AATSC6v; AA4s: AATSC4s; M4s: MATS4s; SpM: SpMAD_DzZ; ASP3: ASP-3; AVP6: AVP-6; nHCs: nHCsatu; minHCs: minHCsatu; EBPnsd: ETA_BetaP_ns_d; MDEO22: MDEO-22 64 Hình 3.3 Bản đồ nhận thức phân tích tương hợp (CA) lớp hoạt tính dấu vân tay P: Chất ức chế P-gp; A: Chất ức chế NorA; D: Chất ức chế Pgp NorA; N: Chất không ức chế P-gp NorA; MFP128: MACCSFP128; MFP144: MACCSFP144; PFP2: PubchemFP2 3.1.4 Các mơ hình pharmacophore Trước chạy ứng dụng Pharmacophore Elucidation MOE, hình thể ba chiều (3D) chất nghiên cứu tạo sử dụng ứng dụng khác MOE Conformation Import [111] Các thiết lập mặc định giữ ngun xây dựng mơ hình pharmacophore, cụ thể hình thể đầu vào phân cụm để loại bỏ hình thể trùng; kế hoạch thích “thống nhất/unified” sử dụng để xác định yếu tố pharmacophore phân tử; không thiết lập ràng buộc tần số xuất biểu lộ truy vấn pharmacophore tạo ra; bán kính biểu lộ yếu tố truy vấn thiết lập 1,4 Å; số lượng phân tử mà 65 truy vấn tạo phải phù hợp thiết lập 0,9; số lượng yếu tố giới hạn không cho phép lựa chọn gióng hàng Từ pharmacophore xây dựng được, phân tử “hit” dễ dàng xác định thông qua hình thể “hit” trình tìm kiếm pharmacophore 3.1.4.1 Các mơ hình pharmacophore cho hoạt tính ức chế P-gp mạnh Từ sở liệu đầu vào chứa bốn phân tử hoạt tính aripiprazol, ebastin, tariquidar elacridar, tổng cộng 39 truy vấn pharmacophore tạo sử dụng công cụ Pharmacophore Elucidation Ba truy vấn tốt với thông số đánh giá chúng trình bày Bảng 3.12 theo thứ tự điểm số chồng phủ giảm dần Các truy vấn có số lượng loại yếu tố, bao gồm ba nhóm kỵ nước (H) nhóm nhận liên kết hydro (a) Santos cộng [54] cơng bố mơ hình pharmacophore bốn điểm giống với nghiên cứu này, dựa diterpen vòng lớn Tầm quan trọng tính kỵ nước nhóm nhận điện tử yếu tố cần thiết cho ức chế P-gp hiệu nhấn mạnh nhiều nghiên cứu trước [17], [20], [32], [48], [49], [54], [56], [89], [95], [131], [132], [133], [134], [135], [149], [219] Bảng 3.12 Ba giả thuyết pharmacophore tốt cho chất ức chế P-gp mạnh chất ức chế chọn lọc NorA với giá trị thống kê chúng Chất ức chế P-gp mạnh Chất ức chế chọn lọc NorA STT Ph4 HHHa HHHa HHHaV HHHa RRHa RHHa RRHd RRHdV 3 Độ bao phủ 4 4 3 3 Độ chồng phủ 2,60 2,59 2,59 2,58 2,27 2,21 2,21 2,21 Tìm kiếm Ph4 Độ 1 1 1 1 P A D N 5/19 0/19 0/19 0/19 1/19 7/19 2/19 2/19 4/7 0/7 0/7 0/7 5/7 6/7 6/7 6/7 13/19 10/19 10/19 9/19 6/19 12/19 1/19 0/19 3/9 0/9 0/9 0/9 4/9 6/9 3/9 3/9 *Ph4: Pharmacophore; H: Yếu tố kỵ nước; a: Nhóm nhận liên kết hydro; R: Yếu tố vòng thơm/vòng Pi; d: Nhóm cho liên kết hydro; V: Thể tích bên ngồi Khi áp dụng để tìm kiếm cho tập liệu 54 chất sử dụng để xây dựng đồ nhận thức trên, truy vấn số cho thấy kết tìm kiếm tốt so với hai truy vấn lại nhận dạng 10/38 chất có hoạt tính (các chất D), 66 có chất sử dụng để mơ hình hóa khơng nhận dạng chất khơng có hoạt tính (Bảng 3.12) Việc khơng có chất P (hầu hết chất ức chế P-gp mạnh) thỏa truy vấn số chứng minh mơ hình gắn kết phù hợp chất có hoạt tính mạnh thụ thể Mặc dù nhận dạng nhiều chất có hoạt tính (18/38 chất P D), truy vấn số nhận dạng khơng chọn lọc chất khơng có hoạt tính (các chất A N) Trong không nhận dạng chất khơng có hoạt tính truy vấn số 2, truy vấn số lại nhận dạng chất có hoạt tính (9/38 chất D, trừ astemizol) Các khoảng cách góc khơng gian tạo thành từ điểm truy vấn số biểu diễn Hình 3.4A Trên truy vấn số 2, ràng buộc thể tích (V) bao gồm số khối cầu có tâm đặt nguyên tử nặng thêm vào Loại thể tích thiết lập “bên ngồi/exterior” bán kính điều chỉnh 6,5 Å Truy vấn số chặt chẽ (HHHaV) cho kết nhận dạng tương tự 10/38 chất D sử dụng để lặp lại việc tìm kiếm tập 54 chất nói Hình ảnh truy vấn hình thể tốt (có RMSD thấp nhất) bốn phân tử sử dụng để mơ hình hóa pharmacophore biểu diễn Hình 3.4B Trong trình đánh giá tiếp theo, mơ hình pharmacophore xây dựng (HHHaV) áp dụng để tìm kiếm hai tập liệu hình thể thu từ 2134 chất 22 chalcon mà sử dụng để phát triển mơ hình phân loại chất ức chế chất không ức chế P-gp Trong số 1028 chất tính hình thể (thuộc tập 2134 chất) bao gồm 485 chất ức chế 543 chất khơng ức chế, có 38 chất thỏa mãn mơ hình pharmacophore bao gồm 34 chất ức chế chất không ức chế (tập tin TLBS.xlsx, Sheet8) Trong số 22 chalcon, mơ hình pharmacophore nhận dạng thành cơng chất có hoạt tính mạnh chất 12, 13, 20, 21, 22 23 Ba chalcon 18, 19 24 không ức chế P-gp (IC50 > 15 μM) không thỏa truy vấn Các kết thu giúp chứng minh mơ hình pharmacophore cho hoạt tính ức chế P-gp mạnh sử dụng để sàng lọc ảo nhằm tìm kiếm chất ức chế P-gp hiệu 67 A B Hình 3.4 Mơ hình pharmacophore chất ức chế P-gp mạnh (F1, F2, F3: Nhóm kỵ nước; F4: Nhóm nhận liên kết hydro; V: Giới hạn thể tích): (A) Các khoảng cách góc; (B) Với diện chất có hoạt tính (aripiprazol, ebastin, tariquidar elacridar) 68 3.1.4.2 Các mơ hình pharmacophore cho hoạt tính ức chế NorA không ức chế P-gp (sự ức chế chọn lọc NorA) Từ sở liệu đầu vào chứa ba phân tử hoạt tính chất 22, 23 32 [17], tổng cộng 18 truy vấn pharmacophore tạo sử dụng công cụ Pharmacophore Elucidation Ba truy vấn tốt với thông số đánh giá chúng trình bày Bảng 3.12 theo thứ tự điểm số chồng phủ giảm dần Các truy vấn có số lượng yếu tố khác loại yếu tố: Truy vấn số chứa hai vòng thơm, nhóm kỵ nước nhóm nhận liên kết hydro (RRHa); truy vấn số chứa vòng thơm, hai nhóm kỵ nước nhóm nhận liên kết hydro (RHHa) truy vấn số chứa hai vòng thơm, nhóm kỵ nước nhóm cho liên kết hydro (RRHd) Sự diện yếu tố vòng thơm, kỵ nước nhóm nhận liên kết hydro giả thuyết pharmacophore phù hợp với nghiên cứu Dupree [46] Carosati cộng [17] Khi áp dụng để tìm kiếm cho tập liệu 54 chất pharmacophore cho hoạt tính ức chế P-gp mạnh, truy vấn số cho thấy kết tìm kiếm tốt so với hai truy vấn lại nhận dạng 6/7 chất có hoạt tính (các chất A), có chất sử dụng để mơ hình hóa chất khơng có hoạt tính (các chất P, D N) (Bảng 3.12) Các truy vấn số không nhận dạng số chất có hoạt tính truy vấn số mà nhận dạng khơng chọn lọc nhiều chất khơng có hoạt tính (lần lượt 11 25 chất khơng có hoạt tính thuộc lớp P, D N) Các khoảng cách góc khơng gian tạo thành từ điểm truy vấn số biểu diễn Hình 3.5A Trên truy vấn số 3, ràng buộc thể tích (V) bao gồm số khối cầu có tâm đặt nguyên tử nặng thêm vào Loại thể tích thiết lập “bên ngồi/exterior” bán kính điều chỉnh Å Truy vấn số chặt chẽ (RRHdV) cho kết nhận dạng tốt với số chất có hoạt tính thỏa mãn truy vấn giữ nguyên số chất khơng có hoạt tính phù hợp với truy vấn giảm xuống năm chất (trừ astemizol) sử dụng để lặp lại việc tìm kiếm tập 54 chất nói Hình ảnh truy vấn hình thể tốt (có RMSD 69 thấp nhất) ba phân tử sử dụng để mơ hình hóa pharmacophore biểu diễn Hình 3.5B A B Hình 3.5 Mơ hình pharmacophore chất ức chế NorA khơng ức chế P-gp (F1, F2: Yếu tố vòng thơm/vòng Pi; F3: Nhóm kỵ nước; F4: Nhóm cho liên kết hydro; V: Giới hạn thể tích): (A) Các khoảng cách góc; (B) Với diện chất có hoạt tính (20, 21, 30) 70 Sau đó, mơ hình pharmacophore xây dựng (RRHdV) áp dụng để lặp lại việc tìm kiếm thực trước hai tập liệu hình thể 1028/2134 chất 22 chalcon Trong trường hợp sở liệu lớn hơn, 81/485 chất ức chế 75/543 chất khơng ức chế P-gp thỏa mãn mơ hình pharmacophore (tập tin TLBS.xlsx, Sheet8) Trong trường hợp sở liệu nhỏ hơn, tất chalcon bao gồm 19 chất ức chế P-gp mạnh (IC50 ≤ 15 μM) không thỏa truy vấn Các kết thu giúp chứng minh mơ hình pharmacophore cho hoạt tính ức chế NorA khơng ức chế P-gp sử dụng để sàng lọc ảo nhằm tìm kiếm chất ức chế NorA an toàn 3.2 Các mơ hình máy tính dựa cấu trúc (mơ hình tương đồng P-gp) Kết mơ hình hóa phân tử server tự động I-TASSER thu bốn mô hình tương đồng P-gp cho mục đích docking phân tử bước tiếp theo; với chuỗi A bốn protein có mã số định danh ngân hàng liệu protein 3g61 [4], 4m1m [97], 4f4c [75] 3g5u [4] chọn làm đĩa cấu trúc theo thứ tự Các thơng số ước tính chất lượng mơ hình trình bày Bảng 3.13, mơ hình (mơ hình 1) có giá trị TM-score RMSD dự đốn Bởi tương quan C-score chất lượng mô hình xếp hạng thấp yếu nhiều so với mơ hình đầu tiên, chất lượng tuyệt đối (TM-score RMSD) mơ hình khơng thể ước tính cách có ý nghĩa Tuy nhiên, chất lượng tương đối mơ hình xếp hạng thấp dự đốn dựa thứ hạng tương đối thông tin C-score chúng [151] Bảng 3.13 Bốn mơ hình tương đồng tốt P-gp dự đốn I-TASSER với thơng tin đĩa thơng số ước tính Mơ hình Đĩa sử dụng C-score TM-score RMSD 3g61A 4m1mA 4f4cA 3g5uA 0,58 0,96 0,38 -2,11 0,79 ± 0,09 - 8,1 ± 4,4 Å - Số lượng decoy 1850 1200 1212 84 Mật độ đám 0,17 0,24 0,14 0,01 Với chất lượng đánh giá tốt theo số I-TASSER (Cscore = 0,58; TM-score = 0,79; RMSD = 8,1; số lượng decoy = 1850 mật độ đám 71 = 0,17), mơ hình dự đốn từ chuỗi A P-gp chuột với mã 3g61 [4] tiếp tục sử dụng để tạo đồ thị Ramachandran Trong đồ thị (Hình 3.6), vùng ưa thích có màu đỏ vùng ưa thích có màu sáng dần Theo thông số thống kê, vùng ưu thích [A,B,L]; vùng cho phép bổ sung [a,b,l,p]; vùng cho phép hào phóng [~a,~b,~l,~p] vùng không cho phép [XX] chứa 905 acid amin (78,7 %); 189 acid amin (16,4 %); 35 acid amin (3,0 %) 21 acid amin (1,8 %) tổng số 1150 acid amin glycin prolin Dưới 90 % acid amin phát vùng lõi giải thích độ phân giải chưa cao cấu trúc đĩa dùng để xây dựng mơ hình tương đồng (4,35 Å) Túi gắn kết mơ hình dự đốn server cho mục đích docking q trình sàng lọc ảo, dựa phức hợp chuỗi B protein đĩa sử dụng với phối tử QZ59-RRR (cyclic-tris-(R)-valineselenazol) (Hình 3.7) Kết q trình mơ hình hóa tương đồng hồn tồn phù hợp với thơng tin cấu trúc Chang cộng [4] tiết lộ khoang nội phân tử có kích thước lớn P-gp chịu trách nhiệm cho khả gắn kết thuốc đa dạng 72 Hình 3.6 Đồ thị Ramachandran mơ hình tương đồng P-gp tốt nhất, vùng ưa thích (the most favoured regions), vùng cho phép thêm (the additional allowed regions), vùng cho phép rộng rãi (the generously allowed regions) vùng không cho phép (the disallowed regions) ký hiệu [A,B,L]; [a,b,l,p]; [~a,~b,~l,~p] [XX] Khu vực màu đậm tượng trưng cho kết hợp phi-psi ưa thích Hình 3.7 Mơ hình tương đồng tốt P-gp với vị trí gắn kết phối tử QZ59-RRR (cyclic-tris-(R)-valineselenazol) dự đoán I-TASSER 73 3.3 Sàng lọc in silico P-gp Các mô hình học máy (phân loại, dự đốn) pharmacophore sau xây dựng ứng dụng cho hai tập liệu bao gồm 95 chalcon nội 6874 hợp chất Ngân hàng Thuốc để sàng lọc chất ức chế mạnh an toàn bơm ngược MDR P-gp NorA, nhằm khơi phục hoạt tính kháng khối u và/hoặc kháng khuẩn trị liệu có sẵn Ngồi ra, mơ hình tương đồng P-gp tạo sử dụng cho nghiên cứu docking chalcon nội hợp chất Ngân hàng Thuốc chọn 3.3.1 Phân loại chất ức chế chất không ức chế P-gp Dựa 24 thông số mô tả dấu vân tay trình bày Phụ lục 2, chất có đầy đủ giá trị thuộc tính với 2109 chất toàn tập liệu 22 chalcon tập đánh giá ngoại dùng cho mục đích phân loại kiểm tra nhanh hạch “Anomaly Detection” Clementine để phát chất bất thường Tỷ lệ chất bất thường thiết lập mức % Ngồi ra, phân tích thành phần (PCA) tất chất thực với số lượng tối đa năm thành phần Sau trình sàng lọc sơ bộ, 79 chất bất thường phát từ 6755 hợp chất Ngân hàng Thuốc không bị thiếu thông số mô tả (tập tin TLBS.xlsx, Sheet9) Sự phân bố chất thuộc sở liệu khác theo hai thành phần thể Hình 3.8 Đồ thị phân tán (Hình 3.8A) cho thấy tính hợp lý việc loại bỏ chất bất thường chất có phần tách biệt khỏi chất khác khơng gian hai chiều chọn Trong đó, hai đồ thị khác (Hình 3.8B Hình 3.8C) lại cho thấy phân tán 95 chalcon nội 6676 hợp chất Ngân hàng Thuốc lại nằm khơng gian hóa học sở liệu 2109 chất sử dụng để phân loại chất ức chế chất khơng ức chế Pgp Nói cách khác, mơ hình phân loại có nhiều khả dự đốn hoạt tính sinh học chất quan tâm