TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU VỀ enzyme

Phần 1: Mở Đầu Từ năm 1953 người ta phát thấy rằng, đưa DNA nòi vi khuẩn E.coli vào tế bào thuộc nòi khác thường DNA ( gọi DNA ngoại lai hay DNA lạ ) hẳn hoạt tính di truyền bị phân cắt thành đoạn ngắn Chỉ số trường hợp khơng bị phân cắt tái tế bào chủ Điều chứng tỏ DNA lạ sửa đổi cách kiểm sốt tế bào chủ Năm 1969 Daniel Nathan Hamilton Smith xác nhận tế bào vi khuẩn hệ thống chứa enzyme sửa đổi enzyme cắt giới hạn Các nghiên cứu di truyền vi sinh vật enzyme cắt giới hạn plasmid việc sử dụng chúng để tạo phân tử DNA tái tổ hợp ống nghiệm ( in vitro ) năm đầu thập niên 1970 tạo bước ngoặt quan trong q trình phát triển Kỹ thuật di truyền Có thể thấy enzyme cắt giới hạn công cụ thiết yếu kĩ thuật di truyền có nhiều ứng dụng cơng nghê DNA Phần II Nội Dung I Enzyme cắt giới hạn Khái niệm: Enzyme cắt giới hạn ( Restriction endonuclease ) hay gọi tắt enzyme giới hạn nuclease có khả nhận biết cắ sợi dài DNA vị trí đặc thù thành đoạn ngắn Những enzyme phân hủy liên kết phosphodieste khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases Hiện tượng giới hạn Thuật ngữ giới hạn xuất phát từ việc enzyme khám phá từ chủng E.coli mà hạn chế phát triển thực khuẩn thể Vì enzyme giới hạn cho chế vi khuẩn nhằm ngăn chặn công virut giúp loại bỏ trình tự virut Enzyme giới hạn đóng vai trò vơ hiệu hóa hoạt tính DNA lạ cách phân cắt vị trí đặc thù để chúng không kịp tái sinh tổng hợp nên hạt phage DNA vi khuẩn không bị phân giải base nitogene trình tự nhận biết bị methyl hóa nên enzyme khơng nhận vị trí cắt Những enzyme phân giải gọi enzyme hạn chế Phân loại: Đã có 1200 enzyme hạn chế khác Các nhà sinh hóa chia enzyme cắt giới hạn nói chung thành ba loại : loại I, loại II, loại III Loại I: enzyme giới hạn loại I có trình tự nhận biết đặc hiệu vị trí cắt enzyme loại nằm ngồi trình tự nhận biết khoảng cách không định, dao động từ 1.000 đến 5.000 nucleotide Do khơng có tính đặc hiệu cắt đoạn nên sản phẩm không đồng không phát điện di gel Phân tử lượng vào khoảng 300.000D Loại II: bao gồm enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu Khi nhận biết trình tự đó, chúng cắt nagy vị trí nhận biết Phân tử lượng thấp loại I khoảng từ 20.000 đến 100.000D Loại III: Bao gồm enzyme sau nhận biết trình tự DNA đặc hiệu cắt vị trí cách 20 nucleotide tạo số đầu cắt khác Tuy vị trí điểm cắt gần trình tự nhận biết chúng khó đốn trước điểm cắt Vì mà RE loại III RE loại I không sử dụng rộng rãi công nghê di truyền Đối với loại I loại III hoạt tính phân giải acid nucleic hay phân giải nhóm methyl thực chung phức hợp enzyme lớn, enzyme thuộc nhóm nhận biết trình tự DNA đặc hiệu , vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết có tới trăm base Chúng cần ATP để hoạt động Với enzyme giới hạn loại II chức phân giải khơng liên quan tới chức methyl hóa hay phân giải nhóm methyl, vị trí cắt nằm bên hay kế bên vị trí nhận biết Ngày người ta biết nhiều loại enzyme khác nhauloaij chúng công cụ sinh học phân tử thiết yếu, đặc biệt thường gặp ứng dụng dòng hóa gene hay phân tích DNA Trình tự nhận biết tính chất đặc trưng RE Enzyme giới hạn cắt trình tự lặp đối xứng độc theo chiều 5’-3’ mạch DNA gọi trình tự nhận biết Vị trí điểm cắt enzyme giới hạn nằm ngồi trình tự nhận biết Hầu hết enzyme tạo vết cắt chéo ( hình chữ chi ) tạo “đầu dính”.Một số enzyme tạo vết cắt mạch đối diện hình thành đoạn DNA “đầu bằng” Ví dụ: 5’… …GGCC…… 3’ 3’… …CCGG…… 5’ 5’……GG 3’……CC CC……3’ GG… 5’ a Cắt tạo đầu ( HaeIII ) 5’… GAATTG…….3’ 3’.… CTTAAC…….5’ 5’… G 3’… CTTAA AATTG… 3’ C….5’ b Cắt tạo dầu sole ( EcoRI ) Tính chất đặc trưng RE: Các enzyme giới hạn phát vi khuẩn mà sinh vật nhân thật Vì tên goisk enzyme giới hạn biểu thị ba bốn chữ viết tắt vi khuẩn mà từ enzyme chiết xuất Chữ đầu viết hoa để chi ( genus ) hai chữ viết thường để loài ( species ) cần thêm chữ thứ tư để nòi chủng Ngồi để phân biệt enzyme nòi dùng thêm số La Mã kèm theo sau Ví dụ: EcoRI - - - Tính đặc hiệu vị trí: chúng nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt vị trí xác định Tùy theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia hai loại chính: loại I bao gồm enzyme cắt bên phạm vi đoạn nhận biết loại II bao gồm enzyme cawtss đặc hiệu bên đoạn nhận biết Enzyme giới hạn phân hủy DNA ngoại lai xâm nhập vào tế bào vi khuẩn Các enzyme giới hạn có đặc tính cắt DNA khơng đặc hiệu lồi nghĩa RE tách chiết từ vi khuẩn cắt DNA tế bào động vật, thực vật vi khuẩn khác vị trí giới hạn hay điểm giới hạn Số lượng kích thước đoạn cắt dài hay ngắn tùy thuộc vào số lượng điểm giới hạn phân tử DNA Các RE nhận biết DNA mạch kép trình tự điểm nhận biết cắt DNA điểm hay điểm kế cận Các trình tự nhận biết thường có trình tự 4-6 cặp nu II Ứng dụng enzyme giới hạn Việc sử dụng RE có ý nghĩa định phát triển sinh học phân tử sinh vật nhân chuẩn, chúng cho phép cắt nhỏ nhiễm sắc thể khổng lồ sinh vật nhân chuẩn Các RE chủ yếu sử dụng việc tạo dòng với mục đích tạo số lượng lớn trình tự DNA xác định RE ứng dụng để lập đồ cắt giới hạn vào việc phân tích so sánh gene lồi khác thông qua kỹ thuật RFLP Sau ta tìm hiểu hai ứng dụng lớn enzyme cắt giới hạn: 1.Enzyme giới hạn phân tích DNA: Hầu hết phân tử DNA tự nhiên lớn nhiều so với kích thước thao tác phân tích cách thuận lợi phòng thí nghiệm Trong tế bào phần lớn nhiễm thể thường phân tử DNA dài chứa hàng trăm chí hàng nghìn gene khác Vì để phân lập phân tích gên người ta phải cắt phân tử DNA kích thước lớn thành phân đoạn nhỏ Công việc thực nhóm enzyme đặc biệt gọi enzyme giới hạn Về nguyên tắc gene phức tạp bị cắt thành nhiều phân đoạn mà từ người ta phân lập đoạn gene đặc hiệu cách điện di gel Những điện di DNA đặc hiệu thử nghiệm cho gene định nghiên cứu cách lai hóa với phóng xạ gene tinh chế từ tế bào biện pháp thích hợp Gene tồn phần thu phân đoạn nhỏ cách cắt đoạn liên tiếp với RE khác Từ phân lập gene mong muốn Trình tự DNA cần nghiên cứu cắt với nhiều RE, theo tổ hợp cắt đơn, cắt phối hợp Các sản phẩm cắt sau phân tích điện di xử lí với phần mềm máy tính để xây dựng đồ cắt giới hạn Tất enzym giới hạn có hai đặc tính: 1) nhận biết trình tự đặc hiệu phân tử ADN (gọi trình tự giới hạn); 2) cắt bên phân tử ADN vị trí đặc hiệu (hoặc vị trí giới hạn nhóm enzym giới hạn loại ; cách vị trí giới hạn số nucleotit định nhóm enzym giới hạn thuộc nhóm ) Trong nhóm enzym giới hạn, nhóm thường dùng nghiên cứu di truyền phân tử kỹ nghệ gen nhóm nhờ vị trí trình tự cắt chúng xác định rõ Vì đề cập đến việc ứng dụng nhóm enzym giới hạn Các trình tự giới hạn enzym nhóm thường gồm – bp, thơng thường có tính đối xứng vị trí cắt thường nằm trình tự giới hạn Ví dụ enzym giới hạn coR tìm thấy vi khuẩn E coli có trình tự giới hạn 5’-GAATTC- 3’ với vị trí cắt G A Tên enzym gồm ký tự đầu tên lồi vi khuẩn mà từ enzym tìm thấy (Eco = Escherichia coli), ký tự sau tên chủng vi khuẩn số thứ tự enzym tìm thấy lồi vi khuẩn (EcoRI enzym giới hạn tìm thấy E coli) Một enzym giới hạn có trình tự giới hạn gồm bp giống EcoRI thông thường trông đợi có trung bình vị trí cắt đoạn trình tự có kích thước khoảng kb (bởi theo nguyên tắc xác suất vị trí định xác suất để có loại nucleotit định 1/4, xác suất để có trình tự định gồm bp 1/46 = 1/4096) Giả sử có phân tử ADN mạch thẳng có vị trí cắt enzym EcoRI Việc cắt phân tử ADN EcoRI cho phân đoạn ADN khác Do đó, điện di gel sản phẩm cắt, phân đoạn ADN phân tách chúng khác khối lượng (vì chúng khác thành phần trình tự nucleotit) Như vậy, phân đoạn ADN tương ứng với vùng phân tử ADN ban đầu Việc sử dụng enzym giới hạn khác, chẳng hạn HindIII có trình tự giới hạn gồm bp, có trình tự giới hạn thay đổi (5’-AAGCTT- 3’) cho sản phẩm cắt khác với sử dụng EcoRI (với phân tử ADN ban đầu) Như vậy, việc sử dụng đồng thời nhiều enzym giới hạn tạo kiểu hình phổ điện di phân đoạn cắt giới hạn đặc thù gen phân tích Đối với số enzym giới hạn khác, chẳng hạn Sau3A1 (tìm thấy vi khuẩn Staphylococcus aureus) có trình tự giới hạn ngắn (5’-GATC-3’), nên tần số cắt chúng thường cao enzym có trình tự giới hạn dài Theo xác suất, Sau3A1 có trung bình vị trí cắt đoạn trình tự khoảng 250 bp (1/44 = 1/256) Ngược lại, enzym NotI có trình tự giới hạn dài (5’-GCGGCCGC-3’) trung bình đoạn trình tự dài khoảng 65 kb, có vị trí cắt (1/48 = 1/65536) Các enzym giới hạn không khác trình tự giới hạn độ dài đoạn trình tự giới hạn đặc trưng chúng, mà chúng khác cách “cắt” phân tử ADN Chẳng hạn enzym HpaI tạo phân tử ADN dạng đầu (đầu tù), enzym RcoRI, HindIII PsIt cắt phân tử ADN tạo phân đoạn có đầu dính Sở dĩ gọi “đầu dính” phần trình tự hai đầu sau enzym cắt bổ trợ với theo nguyên tắc Chargaff chúng có xu hướng “dính” trở lại với nhau, với phân tử ADN cắt loại enzym giới hạn Tính chất ứng dụng rộng rãi công nghệ ADN tái tổ hợp kỹ thuật tách dòng phân tử Tạo DNA tái tổ hợp: i + (/ a (je0 /( =L: $L ( ' = ; =J '( )% ? *b " (/ L R L I / 5% 32 + A B 32 / $I % $' ? > *b V M:i( L /( ? G H ? 5% F N; W ! a: ( $' (/ ' " = ' X B $- I ( [ %P H ? = ,$2 3T S g : % ' : H ? ' G ? /( ( > * ) ? %g % L( " Y% + \ %P - ' \ %P H ? @ " G H ? * ( g " G A *C ' = (X L % $ƒ - ' $L ( , B C $' " (/ %g %: ja A B ? =G 3T B /( H ? A B ? $' > / $I % %g %: _ /( 3# A \ ' " (/ , " L L $'( " $L ( /( 3# = % A X $'( " ) *'( => , * ) / B %) / L L T S%: M+ L R ]M L I G / a (je /( % ? *b c " 5% 32 *H =% % Mục đích việc tạo dòng thu số lượng lớn đoạn DNA xác định Về nguyên tắc quy trình kỹ thuật DNA tái tổ hợp gồm bước sau:  Tách DNA plasmid khỏi tế bào, chọn lọc xử lí DNA thuộc nguồn khác  Kiến tạo phân tử DNA tái tổ họp ống nghiệm  Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ  Phát dòng DNA tái tổ hợp đặc hiệu Kỹ thuật nghiên cứu đa hình trình tự DNA ( RFLP AFLP ) Các kỹ thuật nghiên cứu đa hình trình tự DNA sử dụng enzyme cắt giới hạn RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) phương pháp dùng để so sánh DNA cá thể khác sau cắt mẫu DNA enzyme giới hạn Nếu trình tự DNA hai cá thể lồi giống hồn tồn sau cắt DNA enzyme cắt giới hạ loại thấy băng DNA hồn tốn giống số lượng kích thước Ngược lại có khác trình tự DNA có khác băng DNA AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism) phương pháp nghiên cứu đa hình chiều dài đoạn khuếch đại Nguyên lí phương pháp là:  Cắt DNA genome enzyme giới hạn  Gắn adapter có trình tự nhận biết RE  Sử dụng cặp mồi nhân lên  Điện di phát Phần 3: Kết Luận Việc phát enzyme giới hạn góp phần làm thúc đẩy phát triển ngành sinh học nói chung di truyền học phân tử nói riêng Giúp nhà khoa học dễ dàng nghiên cứu tìm hiểu gene Nhờ có enzyme giới hạn mà người dần bước hiểu rõ DNA chế hoạt động chúng, enzyme giúp điều hòa chế hoạt động DNA thể sống Các enzyme cắt giới hạn sử dụng rộng rãi kĩ thuật di truyền RFLP, AFLP, Southern blot,…và trở thành phần thiếu kĩ thuật di truyền ngày Mục Lục Phần 1: Mở đầu Phần 2: Nội dung I II Enzyme cắt giới hạn Khái niệm Hiện tượng giới hạn Phân loại Trình tự nhận biết tính chất đặc trưng enzyme giới hạn Ứng dụng enzyme giới hạn Enzyme giới hạn phân tích DNA DNA tái tổ hợp Kỹ thuật nghiên cứu đa hình trình tự DNA Phần 3: Kết luận Tài liệu tham khảo Giáo trình Di truyền học, NXB giáo dục, PGS.TS Chu Hoàng Mậu Sinh học phân tử,NXB Đai học quốc gia Hà Nội, Võ Tương Lan Di truyền học vi sinh vật ứng dụng, NXB đại học Huế, Hoàng Trọng Phán Trang web: http://congnghesinhhoc24h.com  ... nhận biết bị methyl hóa nên enzyme khơng nhận vị trí cắt Những enzyme phân giải gọi enzyme hạn chế Phân loại: Đã có 1200 enzyme hạn chế khác Các nhà sinh hóa chia enzyme cắt giới hạn nói chung... I Enzyme cắt giới hạn Khái niệm: Enzyme cắt giới hạn ( Restriction endonuclease ) hay gọi tắt enzyme giới hạn nuclease có khả nhận biết cắ sợi dài DNA vị trí đặc thù thành đoạn ngắn Những enzyme. .. loại I bao gồm enzyme cắt bên phạm vi đoạn nhận biết loại II bao gồm enzyme cawtss đặc hiệu bên đoạn nhận biết Enzyme giới hạn phân hủy DNA ngoại lai xâm nhập vào tế bào vi khuẩn Các enzyme giới