NGHIÊN cứu tần SUẤT, đặc điểm THALASSEMIA và các BỆNH HEMOGLOBIN TRONG CỘNG ĐỒNG dân tộc KHMER ở ĐỒNG BẰNG SÔNG cửu LONG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ THỊ HOÀNG MY Nghiªn cøu tÇn suÊt, ®Æc ®iÓm thalassemia vµ c¸c bÖnh hemoglobin trong céng ®ång d©n téc Khmer ë ®ång b»ng s«ng Cöu Long LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ THỊ HOÀNG MY Nghiªn cøu tÇn suÊt, ®Æc ®iÓm thalassemia vµ c¸c bÖnh hemoglobin trong céng ®ång d©n téc Khmer ë ®ång b»ng s«ng Cöu Long Chuyên ngành : Huyết học và Truyền máu Mã sô : 62720151 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS TS Phạm Quang Vinh PGS TS Huỳnh Nghĩa HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn và lời cảm ơn chân thành nhất tới: - Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Huyết học và Truyền máu - Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án Tiến sĩ - Đảng ủy, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, đã ủng hộ và tạo mọi điều kiện tôt nhất cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn của mình tới: - GS.TS Phạm Quang Vinh – Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học và Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội; - PGS.TS Huỳnh Nghĩa – Phó chủ nhiệm Bộ môn Huyết học, Đại học Y Dược Thành phô Hồ Chí Minh; - TS Dương Bá Trực – Nguyên Trưởng khoa Huyết học lâm sàng, Bệnh viện Nhi Trung Ương; - Prof Suthat Fucharoen – Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện Nghiên cứu Sinh học phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; - những người Thầy đã luôn dành hết tâm sức hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô cùng quý giá; động viên và tạo điều kiện tôt nhất cho tôi trong suôt quá trình thực hiện luận án Xin cho tôi được gửi lời tri ân đến Thầy – Cố PGS.TS Bùi Văn Viên, người Thầy đã luôn nhiệt tâm hướng dẫn, động viên tôi trong quá trình thực hiện luận án…, ngay cả khi Thầy nằm trên giường bệnh Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Trung tâm Chẩn đoán Y khoa Medic, thành phô Hồ Chí Minh; tập thể Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện nghiên cứu Sinh học Phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; đơn vị dịch vụ Thalassemia, Trường Đại học Khon Khaen, Thái Lan; Sở Khoa học và công nghệ tỉnh Sóc Trăng, Sở Y tế, trung tâm Y tế, các trạm y tế xã, phường các tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh, Bạc Liêu, Hậu Giang… đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thu thập sô liệu và thực hiện nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị em đồng nghiệp tại Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, và bạn bè đã luôn dành cho tôi những tình cảm quý mến, những lời động viên, chia sẻ, giúp tôi có thêm động lực để hoàn thành luận án này Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Lê Thị Hoàng Mỹ LỜI CAM ĐOAN Tôi là Lê Thị Hoàng Mỹ, nghiên cứu sinh khóa 29 trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Huyết học và Truyền máu, xin cam đoan: 1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Phạm Quang Vinh và PGS.TS Huỳnh Nghĩa 2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bô tại Việt Nam 3 Các sô liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Người viết Lê Thị Hoàng Mỹ CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN Viết tắt -α3.7 Ý nghĩa đột biến xóa đoạn 3,7 kb α+-thalassemia -α4.2 đột biến xóa đoạn 4,2 kb α+-thalassemia SEA đột biến xóa đoạn α0-thalassemia South East Asia THAI đột biến xóa đoạn α0-thalassemia Thailand /α α0-thalassemia -/ αCSα αTα, ααT α+-thal α0-thal AEBart’s α+-thalassemia ARMS đột biến điểm gen globin-α2 tạo Hb Constant Spring đột biến điểm gen globin-α2, globin-α1 α-thal do các đột biến gây mất một gen globin-α α-thal do các đột biến gây mất hai gen globin-α Bệnh lý hemoglobin E dị hợp tử kết hợp đột biến gây tổn thương 3 gen globin-α do xóa đoạn hoặc không xóa đoạn amplification refractory mutation system, hệ thông khuếch đại đột βthal biến có tính chất trơ Allele specific oligonucleotide, mẫu dò đặc hiệu alen gen globin-β, alen gen globin-β bình thường đột biến gen β0-thalassemia không tổng hợp chuỗi globin-β đột biến gen β+-thalassemia giảm tổng hợp chuỗi globin-β đột biến gen globin-β tạo HbE (codon 26 GAG>AAG) Bệnh lý hemoglobin E dị hợp tử, hemoglobin E đồng hợp tử đột biến β-thalassemia giảm hoặc không tổng hợp chuỗi globin β, (δβ)thal CE ĐB ĐBSCL DCIP ddNTP DGGE DHT ĐHT ĐLC DNA dNTP GTLN GTNN không bao gồm đột biến βE đột biến xóa đoạn DNA chứa gen β và δ Capillary Electrophoresis, điện di mao quản đột biến Đồng bằng sông Cửu Long Dichlorophenolindophenol dioxynucleotide triphosphat Denaturing gradient gel electrophoresis, Điện di gradient biến tính Dị hợp tử Đồng hợp tử Độ lệch chuẩn Deoxynucleotide acid Deoxynucleotide triphosphate Giá trị lớn nhất Giá trị nhỏ nhất ASO β β0 β+ βE βE/β, βE/βE Hb HbCS HC HCT HGB HPFH HPLC HRM IVS MAS-PCR MCH MCHC Hemoglobin, huyết sắc tô Hemoglobin Constant Spring Hồng cầu Hematocrit, thể tích khôi hồng cầu Nồng độ hemoglobin Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin, tồn lưu hemoglobin bào thai High Performance Liquid Chromatography, sắc ký lỏng hiệu năng cao High resolution melting, đường cong nóng chảy có độ phân giải cao Intervening sequence: trình tự đoạn chèn hay intron Multiplex allele specific Polymerase chain reaction Mean Corpuscular Hemoglobin, lượng Hb trung bình trong hồng cầu Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ Hb trung bình MCV MLPA trong hồng cầu Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu multiplex ligation-dependent probe amplification, khuếch đại đa đoạn dò phụ thuộc phản ứng nôi OF test osmotic fragility, xét nghiệm sức bền thẩm thấu cải tiến 1 nồng độ PCR polymerase chain reaction, phản ứng chuỗi trùng hợp RDB Reverse dot blot, kỹ thuật lai điểm ngược RDW Red cell distribution width, dải phân bô kích thước hồng cầu RE Ristriction enzyme, enzym giới hạn RT-PCR Realtime PCR, phản ứng chuỗi trùng hợp ở thời gian thực SLHC Red Blood cell count, sô lượng hồng cầu TB Giá trị trung bình TPTTBMNV Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi γ, ζ, ε gen globin gamma, zeta, epsilon δ gen globin-delta δβ alen gen globin-delta beta bình thường MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Đại cương về cấu trúc và chức năng của hemoglobin 3 1.2 Phân loại bệnh hemoglobin và cơ chế bệnh sinh 4 1.2.1 Phân loại bệnh hemoglobin .4 1.2.2 Cơ chế bệnh sinh .6 1.3 Đặc điểm bệnh hemoglobin 9 1.3.1 -thalassemia 9 1.3.2 Alpha thalassemia 11 1.3.3 Bệnh lý hemoglobin E 14 1.4 Các kỹ thuật sàng lọc và chẩn đoán 15 1.4.1 Các chỉ sô hồng cầu 15 1.4.2 Khảo sát hình thái hồng cầu trên tiêu bản máu ngoại vi .16 1.4.3 Khảo sát sức bền thẩm thấu hồng cầu cải tiến một nồng độ 17 1.4.4 Xét nghiệm Dichlorophenolindophenol 17 1.4.5 Phân tích thành phần hemoglobin 18 1.4.6 Chẩn đoán phân tử 20 1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh thalassemia và hemoglobin HbE trong và ngoài nước 29 1.5.1 Tại Việt Nam 29 1.5.2 Trên thế giới 32 1.6 Vài nét tổng quan về dân tộc Khmer 34 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Đôi tượng nghiên cứu 36 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đôi tượng 36 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 36 2.2 Phương pháp nghiên cứu .36 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang 36 2.2.2 Cỡ mẫu 36 2.2.3 Phương pháp chọn mẫu 37 2.2.4 Nội dung nghiên cứu .39 2.2.5 Phương pháp thu thập sô liệu 44 2.2.6 Phương pháp hạn chế các sai sô hệ thông .59 2.2.7 Phương pháp xử lý sô liệu 60 2.3 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu .60 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 62 3.1 Đặc điểm chung của đôi tượng nghiên cứu 62 3.2 Tần suất các thể thalassemia và bệnh Hb, tỉ lệ các kiểu đột biến gen globin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở ĐBSCL 63 3.2.1 Tỉ lệ các thể thalassemia và bệnh Hb 63 3.2.2 Tỉ lệ mang gen thalassemia và HbE theo nơi cư trú .65 3.2.3 Tỉ lệ các kiểu ĐB gen globin trong cộng đồng dân tộc Khmer ĐBSCL 66 3.3 Đặc điểm lâm sàng và huyết học các thể thalassemia và bệnh Hb trong cộng đồng dân tộc Khmer ở ĐBSCL 70 3.3.1 Đặc điểm lâm sàng của các thể thalassemia và bệnh hemoglobin .70 3.3.2 Đặc điểm huyết học của các thể thalassemia và bệnh hemoglobin 71 Chương 4: BÀN LUẬN .90 4.1 Đặc điểm chung của đôi tượng nghiên cứu 90 4.1.1 Tuổi .90 4.1.2 Giới tính 90 4.1.3 Nghề nghiệp 91 PHỤ LỤC 3 QUI TRÌNH ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR CỦA PHẢN ỨNG GAP-PCR 1 Dụng cụ - Máy điện di nằm ngang (Gibthai Co., Ltd.) - Khay đổ gel, lược - Micropipette (Gilson®) loại 2 – 20 L - Lò vi sóng - Camera đèn cực tím đọc gel (DNR Bio-Imaging Systems UV camera) Hình 3.1 Camera đèn cực tím đọc gel DNR 2 Hóa chất - Agarose (Sigma Aldrich®) - Đệm TAE - Nước cất - Dung dịch Ethidium Bromide (Sigma Aldrich®) - Chất đệm tải nồng độ 6X (Thermo Fisher Specific®) - Thang chuẩn 100 kb plus (Thermo Fisher Scientific®) 3 Các bước tiến hành (1) Nồng độ gel agarose được sử dụng cho sản phẩm PCR là 1,5% (2) Làm tan hoàn gel agarose trong lò vi sóng (gel lỏng trong suôt) (3) Đúc gel: cài lược vào khay đổ khuôn, đổ gel lỏng vào khay, đổ gel vào khoảng ¾ chiều cao lược (4) Chờ đến khi gel đặc lại, khoảng 25 – 30 phút (5) Nhẹ nhàng rút lược ra khỏi khôi gel (6) Lấy bản gel ra khỏi khay (7) Đặt bản gel vào buồng điện di (8) Trộn 1 µL chất đệm tải và 5 µL sản phẩm PCR (9) Tải hỗn hợp vào giếng, chất đệm tải (Thermo Fisher Scientific Loading dye) có màu xanh giúp nhìn thấy gel chạy đến đâu Ngoài ra, chất đệm tải chứa glycerol nồng độ cao, glycerol với tỉ trọng nặng hơn nước, sẽ kéo mẫu xuông đáy giếng, ngăn cản chúng bị khuếch tán vào dung dịch đệm (10) Tải 4 mẫu chứng dương -α 3.7, -α4.2, SEA và THAI vào các giếng và mẫu chứng âm (mẫu nội chuẩn) vào 1 giếng (11) Cuôi cùng tải 1 µL thang chuẩn (DNA ladder) 100 kb plus vào giếng cuôi cùng (hoặc giếng đầu tiên) (12) Đậy nắp buồng điện di lại sau khi tải xong các mẫu (13) Gắn điện cực, cắm điện (14) Bật máy, chỉnh điện áp 100V, 400 mA, thời gian 50 - 60 phút (15) Để gel chạy đến khi màu xanh của chất đệm tải khoảng ¾ bản gel (16) Tắt máy và rút điện (17) Mở nắp, nhấc bản gel ra khỏi buồng điện di (18) Cho bản gel vào dung dịch Ethedium bromide khoảng 5 phút Lưu ý, ethidium bromide là một chất gây ung thư, bỏ găng tay sau khi cho bản gel vào dung dịch ethium bromide (19) Rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất khoảng 15 phút (20) Đọc gel bằng máy Gel Doc: đặt bản gel vào máy, dưới máy chụp ảnh đèn cực tím, được kết nôi với máy tính Các băng DNA được nhuộm ethidium bromide sẽ sáng lên dưới đèn cực tím (21) Lưu lại hình chụp bản gel để đọc kết quả (22) Bỏ gel trong thùng có ký hiệu “Gel nhiễm ethidium bromide” (KHÔNG được bỏ trong thùng rác) (23) Sử dụng giấy tẩm cồn 70% lau sạch bề mặt bàn máy Gel Doc bị nhiễm ethium bromide PHỤ LỤC 4 MỘT SỐ DUNG CỤ, THIẾT BỊ XÉT NGHIỆM Hình 4.1 Máy Vortex Stuart Scientific Hình 4.2 Máy spin down Cubee Hình 4.3 Máy Real-time PCR CFX Bio-Rad Hình 4.4 Micropipette (Gilson®) Hình 4.5 Máy luân nhiệt Bio-rad® MyCyclerTM Hình 4.6 Bể cách thủy Memmert® PHỤ LỤC 5 MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN 1 Kết quả Gap-PCR M -3.7/ -3.7/-3.7 / -3.7/ SEA/ Hình 5.1 Kết quả điện di sản phẩm Gap-PCR xác định các đột biến xóa - đoạn trên gen globin- Giếng M: thang đo chuẩn (Thermo Fisher Scientific®) Giếng 3.7: mẫu chứng dị hợp tử đột biến -α3.7 Giếng 4.2: mẫu chứng dị hợp tử đột biến -α4.2 Giếng THAI: mẫu chứng dị hợp tử đột biến THAI Giếng SEA: mẫu chứng dị hợp tử đột biến SEA Các giếng còn lại là các giếng chứa mẫu thử 2 Kết quả RDB (1) (2) (3) ) (4) ) ) - Hình 5.2 Kết quả RBD xác định đột biến gen globin- Hình (1): đồng hợp tử E/E Hình (2): dị hợp tử IVSII-654/ Hình (3): dị hợp tử Cd17/ Hình (4): dị hợp tử E/ 3 Kết quả StripAssay chẩn đoán đột biến gen globin- -3.7/ -3.7/ SEA/ CS/ -4.2/ -3.7/ SEA/ CS/ CS/ CS/ Hình 5.4 Kết quả StripAssay (ViennaLab) xác định các đột biến gen globin- 4 Kết quả giải trình tự gen globin- xác định đột biến HbTak Chèn 2 nu AC vào giữa trình tự CTA  CACTA Chèn 2 nu AC vào giữa trình tự CTA  CACTA Hình 5.5 Kết quả giải trình tự gen globin- xác định đột biến Hb Tak (HBB:c.441_442insAC) [đối tượng S.H.C (v972), sinh năm 1971, phường Vĩnh Phước, thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng] Hình 5.5 Kết quả giải trình tự gen globin- xác định đột biến Hb Tak (HBB:c.441_442insAC) [đối tượng S.H.C (v972), sinh năm 1971, phường Vĩnh Phước, thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng] Hình 5.6 Kết quả giải trình tự HbTak/HbE (con trai đối tượng S.H.C, sinh năm 2003) THÔNG TIN CHO NGƯỜI THAM GIA NGHIÊN CỨU 1 Giới thiệu về nghiên cứu Bệnh thalassemia là một bệnh di truyền gây thiếu máu do tan máu bẩm sinh Theo y văn, bệnh được phát hiện ở khắp nơi trên thế giới; và tỉ lệ mắc bệnh cao ở các nước trong khu vực Đông Nam châu Á, trong đó có Việt Nam, đặc biệt cao ở các dân tộc ít người Bệnh thể hiện ở nhiều thể lâm sàng khác nhau từ dạng hoàn toàn khỏe mạnh như người bình thường đến dạng cần được truyền máu suôt đời tạo ra gánh nặng cho gia đình và cả xã hội Tuy nhiên, thực tế từ nhiều quôc gia trên thế giới cho thấy bệnh thalassemia có thể được dự phòng để giảm tỉ lệ mắc bệnh môt cách đáng kể nếu có chiến lược đúng đắn ………………………… là một tỉnh có khá đông đồng bào dân tộc ít người cư trú xen kẽ với dân tộc Kinh, do đó tỉ lệ mắc bệnh có thể rất cao 2 Mục đích của nghiên cứu Xác định tỉ lệ mang gen thalassemia, các kiểu đột biến gen α – và globin-β; khảo sát đặc điểm lâm sàng, và xét nghiệm của các thể bệnh; từ đó cung cấp thông tin về các đặc điểm của bệnh trong cộng đồng các dân tộc Khmer ở tỉnh ………………………… làm cơ sở đề xuất các biện pháp nhằm sàng lọc và dự phòng bệnh một cách hiệu quả 3 Nội dung nghiên cứu - Phỏng vấn một sô thông tin cá nhân: tên, tuổi, nghề nghiệp, dân tộc, tôn giáo - Thăm khám: phát hiện các biểu hiện thiếu máu tan máu như nhìn da lòng bàn tay, mắt, mặt - Tiến hành lấy 3 mL máu ở khuỷu tay, xét nghiệm máu xác định có mang gen bệnh hay không Các kết quả xét nghiệm bất thường sẽ được thông báo cho người tham gia và tư vấn hướng điều trị, dự phòng Thông tin của người tham gia nghiên cứu được bảo mật hoàn toàn, và chỉ nhằm phục vụ cho mục đích nghiên cứu khoa học Việc tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện, người tham gia nghiên cứu có quyền từ chôi tham gia bất cứ lúc nào Chi phí xét nghiệm do chủ nhiệm đề tài chi trả, người tham gia nghiên cứu không phải chi trả bất cứ khoản chi phí nào 4 Thông tin liên hệ Mọi thắc mắc liên quan đến nghiên cứu xin vui lòng liên hệ với: ThS Lê Thị Hoàng Mỹ - Bộ môn Huyết học, Trường ĐH Y Dược Cần Thơ Điện thoại cơ quan: 07103 739730; điện thoại cá nhân: 0913 848691 Xin chân thành cảm ơn ông/bà đã đồng ý/ đồng ý cho cháu tham gia vào nghiên cứu của chúng tôi PHIẾU XÁC NHẬN ĐỒNG Ý THAM GIA NGHIÊN CỨU Tôi tên: Năm sinh: Giới: Tôi đã đọc về các thông tin của nghiên cứu, sau khi được giải thích về lơi ích và nguy cơ khi tham gia nghiên cứu, tôi đã hiểu rõ và:  Đồng ý tham gia nghiên cứu  Không đồng ý tham gia nghiên cứu , ngày tháng năm 201 Ký tên ... sơ kiện về thalassemia và bệnh hemoglobin cộng đồng người Khmer, thực đề tài ? ?Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia bệnh hemoglobin cộng đồng dân tộc Khmer đồng sông Cửu Long? ?? với các... TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ THI HOANG MY Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia bệnh hemoglobin cộng đồng dân tộc Khmer đồng sông Cửu Long Chuyờn nganh : Huyờt học và Truyền máu... cộng đồng dân tộc Khmer ĐBSCL 66 3.3 Đặc điểm lâm sàng và huyết học các thể thalassemia và bệnh Hb cộng đồng dân tộc Khmer ĐBSCL 70 3.3.1 Đặc điểm lâm sàng các thể thalassemia