Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia và các bệnh hemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long

GS.TS. Phạm Quang Vinh – Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học và Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội; PGS.TS. Huỳnh Nghĩa – Phó chủ nhiệm Bộ môn Huyết học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh; TS. Dương Bá Trực – Nguyên Trưởng khoa Huyết học lâm sàng, Bệnh viện Nhi Trung Ương; Prof. Suthat Fucharoen – Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện Nghiên cứu Sinh học phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; những người Thầy đã luôn dành hết tâm sức hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô cùng quý giá; động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỢI LÊ THỊ HOÀNG MY Nghiªn cứu tần suất, đặc điểm thalassemia bệnh hemoglobin cộng đồng dân tộc Khmer đồng sông Cưu Long LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỢI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ THỊ HOÀNG MY Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia bệnh hemoglobin cộng đồng dân tộc Khmer đồng b»ng s«ng Cưu Long Chun ngành : Hút học và Truyền máu Mã sô : 62720151 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS TS Phạm Quang Vinh PGS TS Huỳnh Nghĩa HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án, cho phép bày tỏ lòng biết ơn và lời cảm ơn chân thành tới: - Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Huyết học và Truyền máu - Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ hoàn thành luận án Tiến sĩ - Đảng ủy, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, đã ủng hộ và tạo mọi điều kiện tôt cho quá trình học tập và thực đề tài nghiên cứu Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới: - GS.TS Phạm Quang Vinh – Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học và Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội; - PGS.TS Huỳnh Nghĩa – Phó chủ nhiệm Bộ môn Huyết học, Đại học Y Dược Thành phô Hồ Chí Minh; - TS Dương Bá Trực – Nguyên Trưởng khoa Huyết học lâm sàng, Bệnh viện Nhi Trung Ương; - Prof Suthat Fucharoen – Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện Nghiên cứu Sinh học phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; - người Thầy đã dành hết tâm sức hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô quý giá; động viên và tạo điều kiện tôt cho tơi st quá trình thực luận án Xin cho gửi lời tri ân đến Thầy – Cố PGS.TS Bùi Văn Viên, người Thầy đã nhiệt tâm hướng dẫn, động viên tơi quá trình thực luận án…, Thầy nằm giường bệnh Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Trung tâm Chẩn đoán Y khoa Medic, thành phô Hồ Chí Minh; tập thể Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện nghiên cứu Sinh học Phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; đơn vị dịch vụ Thalassemia, Trường Đại học Khon Khaen, Thái Lan; Sở Khoa học và công nghệ tỉnh Sóc Trăng, Sở Y tế, trung tâm Y tế, các trạm y tế xã, phường các tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh, Bạc Liêu, Hậu Giang… đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi quá trình thu thập sô liệu và thực nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị em đồng nghiệp tại Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, và bạn bè đã dành cho tình cảm quý mến, lời động viên, chia sẻ, giúp tơi có thêm động lực để hoàn thành luận án này Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Lê Thị Hồng Mỹ LỜI CAM ĐOAN Tơi là Lê Thị Hoàng Mỹ, nghiên cứu sinh khóa 29 trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Huyết học và Truyền máu, xin cam đoan: Đây là luận án thân trực tiếp thực dưới hướng dẫn GS.TS Phạm Quang Vinh và PGS.TS Huỳnh Nghĩa Cơng trình này khơng trùng lặp với nghiên cứu nào khác đã công bô tại Việt Nam Các sô liệu và thông tin nghiên cứu là hoàn toàn xác, trung thực và khách quan, đã xác nhận và chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về cam kết này Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Người viết Lê Thị Hoàng Mỹ Lê Thị Hoàng Mỹ CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN Viết tắt -α3.7 Ý nghĩa đột biến xóa đoạn 3,7 kb α+-thalassemia -α4.2 đột biến xóa đoạn 4,2 kb α+-thalassemia SEA đột biến xóa đoạn α0-thalassemia South East Asia THAI đột biến xóa đoạn α0-thalassemia Thailand /α α0-thalassemia -/ αCSα αQSα αT α ααT α+-thal α0-thal AEBart’s α+-thalassemia ARMS ASO β β0 β+ βE β/βE, βE/βE βthal thal (δβ) CE ĐB ĐBSCL DCIP ddNTP DGGE DHT ĐHT ĐLC DNA dNTP đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Constant Spring đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Quong Sze đột biến điểm gen globin α2 đột biến điểm gen globin α1 α-thal các đột biến gây gen globin-α α-thal các đột biến gây gen globin-α Bệnh lý hemoglobin E dị hợp tử kết hợp đột biến gây tổn thương gen globin α xóa đoạn khơng xóa đoạn amplification refractory mutation system: hệ thông khuếch đại đột biến có tính chất trơ Allele specific oligonucleotide, mẫu dò đặc hiệu alen gen globin-β, alen gen globin-β bình thường đột biến gen β0-thalassemia không tổng hợp chuỗi globin-β đột biến gen β+-thalassemia giảm tổng hợp chuỗi globin-β đột biến gen globin-β tạo HbE (codon 26 GAG>AAG) Bệnh lý hemoglobin E dị hợp tử, hemoglobin E đồng hợp tử đột biến β-thalassemia giảm không tổng hợp chuỗi globin β, không bao gồm đột biến βE đột biến đoạn DNA chứa gen β và δ Capillary Electrophoresis, điện di mao quản đột biến Đồng sông Cửu Long Dichlorophenolindophenol dioxynucleotide triphosphat Denaturing gradient gel electrophoresis, Điện di gradient biến tính Dị hợp tử Đồng hợp tử Độ lệch chuẩn Deoxynucleotide acid Deoxynucleotide triphosphate GTLN GTNN Hb HbCS HC HCT HGB HPFH HPLC HRM HS IVS KKU MAS-PCR MCH Giá trị lớn Giá trị nhỏ Hemoglobin: huyết sắc tơ Hemoglobin Constant Spring Hồng cầu Hematocrit, thể tích khơi hồng cầu Nồng độ hemoglobin Heriditary persistence of fetal hemoglobin, tồn lưu hemoglobin bào thai High Performance Liquid Chromatography, Sắc ký lỏng hiệu cao High resolution melting, đường cong nóng chảy có độ phân giải cao Hypersensitive site: vị trí nhạy cảm Intervening sequence: trình tự đoạn chèn hay intron Khon Khaen University, Đại học Khon Khaen Thái Lan Multiplex allele specific Polymerase chain reaction Mean Corpuscular Hemoglobin, lượng hemoglobin trung bình MCHC hồng cầu Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ hemoglobin MCV MLPA trung bình hồng cầu Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu multiplex ligation-dependent probe amplification, khuếch đại đa NST OF test PCR RDB RDW RE rpm RT-PCR SLHC TB TPTTBMNV WHO γ, ζ, ε δ δβ đoạn dò phụ thuộc phản ứng nôi Nhiễm sắc thể osmotic fragility: xét nghiệm sức bền thẩm thấu polymerase chain reaction: phản ứng chuỗi trùng hợp Reverse dot blot: kỹ thuật lai điểm ngược Red cell distribution width, Độ rộng dải phân bơ kích thước hồng cầu Ristriction enzyme, enzyme giới hạn round per minute Realtime – PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực Red Blood cell count - sô lượng hồng cầu Giá trị trung bình Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi World Health Organisation, Tổ Chức Y Tế Thế giới gen globin gamma, zeta, epsilon gen globin-delta alen gen globin-delta beta bình thường MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về cấu trúc và chức hemoglobin 1.2 Phân loại bệnh hemoglobin và chế bệnh sinh 1.2.1 Phân loại bệnh hemoglobin .4 1.2.2 Cơ chế bệnh sinh .6 1.3 Đặc điểm bệnh hemoglobin 1.3.1 -thalassemia 1.3.2 Alpha thalassemia 11 1.3.3 Bệnh lý hemoglobin E 14 1.4 Các kỹ thuật sàng lọc và chẩn đoán 15 1.4.1 Các sô hồng cầu 15 1.4.2 Khảo sát hình thái hồng cầu tiêu máu ngoại vi .16 1.4.3 Khảo sát sức bền thẩm thấu hồng cầu cải tiến nồng độ 16 1.4.4 Xét nghiệm Dichlorophenolindophenol 17 1.4.5 Phân tích thành phần hemoglobin 18 1.4.6 Chẩn đoán phân tử 20 1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh thalassemia và hemoglobin HbE và ngoài nước 28 1.5.1 Tại Việt Nam 28 1.5.2 Trên thế giới 31 1.6 Vài nét tổng quan về dân tộc Khmer 33 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đôi tượng nghiên cứu 35 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đôi tượng 35 PHỤ LỤC QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA PHƯƠNG PHÁP TỦA BẰNG ΜUỐI (SALTING – OUT) Dụng cụ, trang thiết bị - Týp 1,5 mL (Eppendorf®) đã khử khuẩn - Micropipette (Gilson®) loại 100 – 1000 L, 20 – 200 L - Đầu tip 1000 L, 200 L (Axygen Scientific®) - Máy ly tâm týp (Hettich Mikro® 200) - Máy vortex (Genie® 2) Hóa chất, thuốc thử - Dung dịch ly giải hồng cầu - Dung dịch ly giải tế bào (Cell lysis solution - Qiagen®) - Dung dịch kết tủa protein (Protein precipitate solution - Qiagen®) - Dung dịch isopropanol (Merck®) - Ethanol 70% pha từ cồn tuyệt đơi (Merck®) - Đệm TE (Promega®) Các bước tiến hành (1) Chuẩn bị týp 1,5 mL cho mẫu, ghi mã sô mẫu và ngày tách lên týp (2) Lấy mẫu máu khỏi tủ trữ đơng, để nhiệt độ phòng 15 phút (3) Trộn đều cách dôc ngược nhiều lần, hút 400 L máu vào týp (4) Thêm 1000 L dung dịch ly giải hồng cầu cho vào týp (5) Trộn đều cách dôc ngược nhẹ nhàng nhiều lần, ủ 10 phút nhiệt độ phòng (6) Quay ly tâm 12.000 rpm phút (7) Nhẹ nhàng đổ bỏ dịch màu hồng, để lại cặn lắng bên dưới (8) Làm rã khôi cặn lắng cách lướt nhẹ đáy týp giá đựng ông nghiệm đến khôi cặn rã hoàn toàn (9) Lặp lại các bước (4) – (8) Thực bước này đến nhìn thấy khơi cặn lắng màu trắng đục (lớp bạch cầu) đáy týp (thường lặp lại lần) (10) Thêm 300 L dung dịch ly giải tế bào vào týp (11) Vortex khoảng 20 giây (12) Tiếp tục thêm 100 L dung dịch kết tủa protein (13) Vortex khoảng phút (14) Quay ly tâm 12.000 rpm phút (15) Chuyển dịch suôt (chứa DNA) sang týp đã ghi mã sô và ngày tách chiết, bỏ týp (16) Thêm 300 L dung dịch isopropanol týp (17) Dôc ngược lên – xuông nhẹ nhàng khoảng 50 lần đến thấy có cuộn DNA màu trắng đục (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) Quay ly tâm 12.000 rpm phút Nhẹ nhàng đổ bỏ lớp dịch nổi, tránh đổ phần DNA lắng dưới đáy týp Dùng tay búng nhẹ đáy týp để tách DNA khỏi thành týp Thêm 300 L ethanol 70% vào týp, trộn đều Quay ly tâm 12.000 rpm phút Đổ bỏ lớp dịch nổi, tránh đổ bỏ DNA bên dưới Gạn thật sạch ethanol giấy thấm Để khô týp không khí nhiệt độ phòng > 15 phút Thêm 30 – 50 L dung dịch đệm TE Để týp nhiệt độ phòng khoảng 24 giờ Sau 24 giờ, trữ DNA 40C -200C đến sử dụng Hình 1.1 Máy quay ly tâm Hettich Mikro 200 máy vortex PHỤ LỤC QUY TRÌNH ĐO NỒNG ĐỘ DNA BẰNG QUANG PHỔ KẾ Nguyên lý hoạt động Sức căng bề mặt sử dụng để giữ cột mẫu vị trí để ánh sáng truyền qua thuận tiện cho phép đo Người sử dụng cần dùng pipette nhả trực tiếp thể tích nhỏ (0,5 – L) mẫu vào vị trí đo, có tay cầm nơi có sợi cáp quang ấn xng vị trí đặt mẫu, sau thả nhẹ để tạo khoảng cách nhỏ dưới tác dụng sức căng bề mặt, cột chất lỏng mẫu kéo lên Lúc này thực phép đo với thời gian < 10 giây Biểu đồ quang phổ và các kết phân tích lên màn hình máy tính kèm Dụng cụ, trang thiết bị - Micropipette 0,2 – L - Nước cất - Đầu típ 10 L - Giấy lau - Máy đo quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Specific ®) và phần mềm cài đặt máy tính Các bước thực (1) Mở phần mềm: nhấp chuột lần vào biểu tượng NanoDrop 2000 máy tính (2) Chọn chương trình đo: chọn Nucleic Acid (3) Xác minh bước sóng thường quy: dùng giấy lau sạch bệ đo (pedestal) bên dưới và cánh tay NanoDrop, hạ cánh tay xuông và click OK, máy chạy vài giây để kiểm tra (4) Blank trước sử dụng: tải L nước cất trực tiếp lên bệ đo NanoDrop, hạ cánh tay máy xuông, nhấp chuột vào nút Blank màn hình Máy tiếp tục chạy vài giây để blanking Sau blank xong, nút Measure rõ màn hình (5) Tiến hành đo mẫu: nhập mã sô mẫu vào ô ID, nâng cánh tay lên, lau sạch bệ đo bên dưới và cánh tay giấy thấm, nhỏ L sản phẩm DNA lên vị trí đo, hạ cánh tay máy xng, nhấp chọn nút Measure Sau chương trình đo hoàn thành, máy hiển thị cửa sổ cho phép lưu các sơ liệu vừa đo, tạo folder để lưu kết Kết đo hiển thị lên màn hình, với nồng độ ng/ L Đơi với DNA, cần quan tâm đến tỉ sô hấp thụ quang phổ bước sóng 260 nm và 280 nm (A260/A280) Tỉ sô này nằm khoảng từ 1,8 – 2,0 cho biết sản phẩm DNA tinh sạch, nếu A260/A280