Kỹ thuật kháng sinh đồ MIC

Kỹ thuật kháng sinh đồ MIC XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG SINH TỐI THIỂU ỨC CHẾ VI KHUẨN (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) I II III IV V VI I Ts LÊ THỊ ÁNH HỒNG MỤC LỤC MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ TRANG THI ẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ MÔI TRƯỜNG VÀ SINH PHẨM 3.1 Môi trường 3.2 Các loại kháng sinh tá dược CHỦNG VI KHUẨN 4.1 Các chủng vi khuẩn chuẩn quốc tế 4.2 Chủng vi khuẩn cần xác định MIC KỸ THUẬT 5.1 Cách pha kháng sinh 5.1.1 Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch “mẹ”) 5.1.2 Pha đậm độ kháng sinh 5.2 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn môi trường đặc 5.3 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn môi trường lỏng PHỤ LỤC 6.1 Dung dịch đệm phosphat dùng để pha dung dịch kháng sinh “mẹ” 6.2 Dung dịch đệm phosphat để pha loãng kháng sinh vi khuẩn (PBS) 6.3 Ống mẫu Mc Farland 0.5 6.4 Bảng mẫu ghi kết 6.5 Giá trị MIC chủng chuẩn quốc tế MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ Mục đích: Kỹ thuật nhằm mục đích xác định xác nồng độ nhỏ kháng sinh có tác dụng ức chế phát triển chủng vi khuẩn môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng) Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần môi trường nuôi cấy, đạt đến nồng độ định ức chế phát triển vi khuẩn, mắt thường xác định điều II TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ  Nồi cách thủy  Cân điện xác (0,000g)  Tủ lạnh  Tủ đông lạnh – 20oC  Tủ ấm 37oC  Bộ cấy phiên 32 chân đinh (bằng thép không rỉ), đầu chứa l  Pipet Pasteur  Ống đong khắc vạch 25 ml 50 ml  Các loại pipet khắc vạch: 0,1 ml, 0,2 ml, ml, ml, ml, 10 ml  Micropipet: 0,5 – 10 l, 10 - 100 l  Các loại ống nghiệm đường kính: 12 mm, 16 mm, 18 mm  Bình cầu bình nón: 25 ml, 50 ml, 100 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml  Hộp lồng đường kính 90 mm III MƠI TRƯỜNG VÀ SINH PHẨM 3.1 Môi trường  Thạch Mueller - Hinton (MH)  Canh thang MH  Canh thang thường BHI (Brain Heart Infusion)  Thạch máu (Blood agar base)  Máu cừu máu thỏ loại fibrin, lấy máu dùng ngay, giữ tủ lạnh không 48h  NAD (nicotin adenin dinucleotid) 3.2 Các loại kháng sinh hóa dược  Các loại kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm, kháng sinh bột dùng để tiêm truyền tĩnh mạch  Dung dịch đệm dùng để pha kháng sinh:  Đệm phosphat dùng để pha dung dịch “mẹ”: pH 6, pH 7, pH  Đệm phosphat dùng để pha lỗng kháng sinh  Nước cất vơ trùng  Hóa chất  NaCl  KCl  Na2HPO4.H20  KH2PO4  H2SO4  BaCl2  Dung dịch NaOH 2M   Dung dịch HCl 0,5 N Cồn tuyệt đối Methanol Ethanol IV CHỦNG VI KHUẨN 4.1 Các chủng vi khuẩn chuẩn quốc tế - Hemophilus influenzae NCTC 8468  Staphylococcus aureus ATCC 25923  Escherichia coli ATCC 25922  Streptococcus faecalis ATCC 29212  Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 4.2.Chủng vi khuẩn cần xác định MIC: Nhất thiết phải chủng định danh khiết V KỸ THUẬT 5.1 Cách pha kháng sinh 5.1.1 Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch “mẹ”) 5.1.1.1 Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm: dựa hoạt lực kháng sinh (được ghi nhãn lọ), ta tính để pha dung dịch mẹ theo cơng thức sau: Ví dụ: Kháng sinh chloramphenicol có hoạt lực 99,13%, cần pha 10 ml dung dịch kháng sinh mẹ có nồng độ 1600 g/ml, phải cân Xg kháng sinh: Kháng sinh bột sau cân, pha với dung dịch đệm thích hợp (xem 6.1.), tùy theo loại kháng sinh khác có dung mơi dung dịch đệm khác (phụ thuộc hãng sản xuất loại kháng sinh) Nhiều loại kháng sinh hồ tan pha lỗng nước cất Một số khác cần phải hồ tan dung mơi đặc biệt, sau pha lỗng nước cất Ví dụ: Kháng sinh Chất hòa tan Chất pha lỗng Ampicillin Dung dịch đệm phosphat pH Dung dịch đệm phosphat pH Cephalosporin Dung dịch đệm phosphat pH Nước cất Tetracyclin Cồn methanol Nước cất Trimethoprim Cồn methanol Nước cất Sulfamethoxazol NaOH 2M Nước cất Chloramphenicol Cồn ethanol 100% Nước cất Rifampycin Cồn ethanol 100% Nước cất Erythromycin Cồn ethanol 100% Nước cất Acid fusidic Cồn ethanol 100% Nước cất Dung dịch kháng sinh gốc sau pha xong, chia nhỏ ống nghiệm, bảo quản lạnh - 200C Một lấy ra, dùng phạm vi ngày 5.1.1.2 Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho tiêm truyền tĩnh mạch: bột kháng sinh không tinh khiết, có tá dược hòa lẫn bột kháng sinh để dễ hòa tan với dung dịch hồi chỉnh nước cất tiêm, khơng có số hoạt lực kháng sinh Vì cân bột kháng sinh để pha dung dịch kháng sinh mẹ (vì khơng xác) Vậy muốn có dung dịch mẹ: pha tồn lọ kháng sinh với lượng nước hồi chỉnh nước cất theo dẫn (có nhãn lọ kháng sinh), từ tính nồng độ dung dịch mẹ Ví dụ: lọ kháng sinh Ampicillin dùng cho tiêm truyền có 1g bột hòa với ml nước cất, nồng độ kháng sinh dung dịch mẹ là: 200.000 g/ml, tiếp tục pha loãng dung dịch đệm phosphat pH nước cất đến có nồng độ cần thiết Chia nhỏ vào ống nghiệm, bảo quản lạnh - 200C Một lấy để tan băng, dùng phạm vi ngày 5.1.2 Pha đậm độ kháng sinh Dung dịch “mẹ” 2,5 ml (1280 g/ml) ml ml 0,5 ml 0,5 ml 2ml (80 g/ml) ml 0,5 ml 0,5 2ml (5 g/ml) ml 0,5 ml 0,5 ml 2ml (0,32 g/ml) ml Dung dịch đệm PBS * (hoặc nước cất) 2ml ml 3,5 ml 7,5 ml ml 3ml 3,5 ml 7,5 ml ml 3ml 3,5 ml 7,5 ml ml 3ml Độ pha Đậm độ trung gian (g/ml) 1/2 1/4 1/8 1/16 1/2 1/4 1/8 1/16 1/2 1/4 1/8 1/16 1/2 1/4 1280 640 320 160 80 40 20 10 2,5 1,25 0,64 0,32 0,16 0,08 Đậm độ cuối (g/ml)** 128 64 32 16 0,5 0,25 0,125 0,064 0,032 0,016 0,008 * PBS: Dung dịch đệm phosphat dùng để pha loãng kháng sinh (xem 6.2.) ** Đậm độ cuối tính theo tỷ lệ trộn 2,5 ml dung dịch trung gian + 22,5 ml thạch MH, 0,2 ml dung dịch trung gian +1,8 ml canh thang MH (pha loãng 1/10) 5.2 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn môi trường đặc Ngày 1: - Tất chủng cần thử MIC chủng chuẩn quốc tế, cấy canh thang thường (hoặc mơi trường thích hợp loại), đặt 37 0C/18h để có vi khuẩn non Chú ý điều kiện khí trường theo yêu cầu loại vi khuẩn: H influenzae, S pneumoniae, S pyogenes để khí trường có 5% CO2(trong điều kiện khơng có tủ ấm CO2, tạo CO2 cách cho đĩa thạch vào bình thủy tinh lớn, đốt nến, đậy nắp thật kín) - Chuẩn bị thạch MH: Cân thạch theo cơng thức (ghi hộp), đun sôi cho tan hết thạch, hấp thạch 121oC/15 phút Đối với số chủng cần mơi trường có chất dinh dưỡng cao phải cho thêm: 5-10% máu (cho chủng S pneumoniae), 5-10% máu hấp cách thủy 80oC/20 phút, lắc suốt thời gian hấp cách thủy, sau cho thêm NAD (đối với chủng H influenzae) Để thạch nguội khoảng 40-500C, dùng ống đong khắc vạch đong 22,5 ml thạch cho vào bình nón có sẵn 2,5 ml dung dịch kháng sinh theo nồng độ bảng pha kháng sinh, lắc kỹ đổ vào hộp lồng, thạch nguội cất bảo quản tủ lạnh - 80C (có thể bảo quản tuần) Mỗi lần làm MIC cần đĩa môi trường MH khơng có kháng sinh để làm đĩa chứng (cho thêm 2,5 ml PBS nước cất) Ngày 2: - Cấy vi khuẩn khiết từ canh khuẩn non (canh khuẩn cấy qua đêm 18h) nhặt số khuẩn lạc từ mơi trường thạch thích hợp hồ vào ml dung dịch đệm PBS (hoặc nước cất) để có độ đục độ đục ống Mc Farland 0,5 – tương đương 1-1,5 x 10 vi khuẩn/ml (xem 6.3.) Tiếp tục pha lỗng 1/100 để có đậm độ vi khuẩn 1-1,5 x 10 6/ml cách dùng micropipet hút 20 l cho vào ml đệm PBS (hoặc nước cất) - Dùng pipet Pasteur hút khoảng 0,5 ml huyền dịch (1-1,5 x 10 6/ml) cho vào giếng, theo sơ đồ ghi số chủng: 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Chủng chuẩn* Chủng chuẩn* * Tùy theo loài vi khuẩn cần xác định MIC để chọn chủng chuẩn cho thích hợp: Với chủng vi khuẩn đường ruột dùng chủng E coli ATCC 25922, S aureus 25923 làm chủng chuẩn, với chủng H influenzae, S pneumoiae dùng chủng H influenzae NCTC 8468 làm chủng chuẩn - Dùng phiên 32 chân đinh chấm vào giếng sau đặt lên đĩa thạch MH có nồng độ kháng sinh khác (nếu khơng có cấy phiên bản, dùng micropipet nhỏ l/chủng lên mặt đĩa thạch theo sơ đồ) Lưu ý:  Các đĩa thạch cần để se mặt thạch tủ ấm 37 oC/ 30 phút trước cấy vi khuẩn  Đánh dấu vị trí trái phải đĩa thạch để tránh nhầm lẫn đọc kết  Đặt vào đĩa thạch MH chứng (khơng có kháng sinh) trước sau đặt vào đĩa thạch có kháng sinh  Đặt từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp đến nồng độ cao  Chú ý cần nhẹ nhàng không để chân đinh ấn sâu vào thạch - Sau đặt lên đĩa thạch, chờ cho đĩa thạch khô (các giọt nước chân đường cấy thấm vào thạch (khoảng 15 phút- 20 phút) cất vào tủ ấm 37 oC/18 giờ, lật úp đĩa thạch Đối với số chủng cần thiết phải đặt đĩa thạch điều kiện có CO (S pneumoniae, H influenzae, Branhamella catarrhalis) Ngày 3: - Trước tiên đọc kết đĩa thạch chứng khơng có kháng sinh để kiểm tra khiết chủng vi khuẩn đảm bảo không bị chết trước tiến hành, chủng đảm bảo khiết phát triển tốt đọc tiếp - Đọc kết chủng chứng (chủng chuẩn quốc tế), so sánh kết MIC chủng với bảng mẫu (xem 6.5.), kết nằm giới hạn, sai số cho phép bậc nhỏ bậc lớn hơn, điều nói lên điều kiện thí nghiệm đạt chuẩn thức: pH, nồng độ kháng sinh, nhiệt độ, dinh dưỡng môi trường, mật độ vi khuẩn… Như tiếp tục đọc kết chủng cần xác định MIC Nếu không đạt trên, bắt buộc phải làm lại thí nghiệm, đồng thời phải kiểm tra lại điều kiện thí nghiệm cho chuẩn thức - Đọc kết quả, đọc từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp Nồng độ MIC xác định đĩa mơi trường mà vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn 1-3 khuẩn lạc mọc - Kết MIC chủng với kháng sinh ghi theo bảng mẫu (xem 6.4.) tờ giấy - - Ở nồng độ thấp nhất, khơng có vi khuẩn mọc kết ghi nhận là: nhỏ nồng độ () Trong trường hợp đến nồng độ cao mà thấy vi khuẩn mọc kết ghi nhận lớn nồng độ () Kết MIC chủng so sánh với nồng độ ranh giới kháng (xem 6.6.) để phân biệt thành mức độ nhạy cảm, kháng hay mức độ trung gian: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I) đề kháng (Resistante - viết tắt R) 5.3 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn môi trường lỏng Ngày 1: - Tất chủng cần thử MIC chủng chuẩn quốc tế, cấy canh thang thường BHI để có canh khuẩn non, theo tỷ lệ sau: trực khuẩn Gram âm: cấy 0,1 ml; Liên cầu D, tụ cầu trực khuẩn mủ xanh: cấy 0,3 ml; Các liên cầu khác: 0,6 ml (hoặc mơi trường thạch thích hợp loại) Đặt 37 oC/ 18 để có vi khuẩn non Chú ý điều kiện khí trường theo yêu cầu loại vi khuẩn: H influenzae, S pneumoniae, S pyogenes để khí trường có 5% CO2(trong điều kiện khơng có tủ ấm CO2, tạo CO2 cách cho đĩa thạch vào bình thủy tinh lớn, đốt nến, đậy nắp thật kín) Ngày 2: - Pha loãng 0,1 ml (100 l) canh khuẩn non (sau để 37 oC/18 có đậm độ tương đương 1-1,5 x 108 vi khuẩn ml) 9,9 ml canh thang MH (pha lỗng 100 lần để có đậm độ tương đương 1-1,5 x 10 vi khuẩn/ml), chia 1,8 ml vào ống nghiệm đường kính 12 mm Nếu nuôi cấy qua đêm môi trường thạch, lấy vi khuẩn khiết từ mơi trường thạch thích hợp hoà vào ml dung dịch đệm PBS (hoặc nước cất) để có độ đục độ đục ống Mc Farland 0,5 – tương đương 1-1,5 x 108 vi khuẩn/ml (xem 6.3.), sau lại pha lỗng 1/100 canh thang MH chia vào ống nghiệm - Thêm 0,2 ml nước cất nước muối sinh lý vô trùng vào ống nghiệm (chứng âm) - Thêm 0,2 ml kháng sinh pha theo bảng pha đậm độ kháng sinh vào ống nghiệm, phân phối từ nồng độ kháng sinh thấp đến nồng độ cao Lắc kỹ ống nghiệm - Đặt vào tủ ấm 37oC/18 Ngày - Lắc kỹ ống nghiệm trước đọc kết - Đọc kết ống chứng âm trước để kiểm tra xem chủng vi khuẩn có phát triển tốt hay không, vi khuẩn phát triển tốt tiếp tục đọc kết quả, không mọc tốt phải làm lại thí nghiệm - Đọc kết chủng chứng (chủng chuẩn thức quốc tế), so sánh kết MIC chủng với bảng mẫu (xem 6.5.), kết nằm giới hạn, sai số cho phép bậc nhỏ bậc lớn hơn, điều nói lên điều kiện thí nghiệm đạt chuẩn thức: pH, nồng độ kháng sinh, nhiệt độ, dinh dưỡng môi trường, mật độ vi khuẩn… Như tiếp tục đọc kết chủng cần xác định MIC Nếu không đạt trên, bắt buộc phải làm lại thí nghiệm, đồng thời phải kiểm tra lại điều kiện thí nghiệm cho đạt điều kiện chuẩn thức - Xác định nồng độ MIC: Đọc kết ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp Nồng độ MIC tính ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp ức chế phát triển vi khuẩn (bằng mắt thường khơng nhìn thấy vi khuẩn mọc - canh thang trong) - Kết MIC chủng với kháng sinh ghi theo bảng mẫu (xem 6.4.) - - Ở nồng độ thấp nhất, khơng thấy vi khuẩn mọc kết ghi nhận : nhỏ nồng độ () Trong trường hợp đến nồng độ cao mà thấy vi khuẩn mọc kết ghi nhận lớn nồng độ () Kết MIC chủng so sánh với nồng độ ranh giới (xem 6.6.) để phân biệt mức độ nhạy cảm, kháng hay mức độ trung gian: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I), kháng (Resistante - viết tắt R) PHỤ LỤC 6.1 Dung dịch đệm phosphat dùng để pha dung dịch kháng sinh “ mẹ ” Dung dịch A: Na2HPO4.2 H2O 11,867 g/l Dung dịch B: KH2PO4 9,078 g/l Dung dịch đệm phosphat pH 6: 20 ml dung dịch A + 80 ml dung dịch B Dung dịch đệm phosphat pH 7: 70 ml dung dịch A + 30 ml dung dịch B Dung dịch đệm phosphat pH 8: 95 ml dung dịch A + ml dung dịch B Kiểm tra lại độ pH, cần thiết cho thêm dung dịch A B Hấp vô trùng 1210C/15’ 6.2 Dung dịch đệm phosphat để pha loãng kháng sinh vi khuẩn (PBS) NaCl gam KCl 0,2 gam Na2 HPO4 2H20 1,44 gam KH2P04 0,2 gam Nước cất vừa đủ 1000 ml Lắc đều, điều chỉnh pH = 7,4 Hấp vô trùng 1210C/15’ 6.3 6.3 Ống mẫu Mc Farland 0,5 Dung dịch H2S04 1% 9,95 ml Dung dịch BaCl2 1% 0,05 ml Ống mẫu Mc Farland 0,5 có độ đục tương đương với 1-1,5 x108 vi khuẩn/ ml 6.4 6.4 6.4 Bảng mẫu ghi kết quả: Kháng sinh: Mơi trường: Nhiệt độ khí trường: 6.5 Giá trị MIC chủng chuẩn quốc (Theo Clinical Microbiology and Infection, volume supplement 1, Dec 1996 ) Enterococcus faecalis ATCC 29212 Amikacine Escherichia coli ATCC 25922 0,5 - Ampicilline 2-8 0,25 - Tên kháng sinh Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1-4 Staphylococcus aureus ATCC 25923 0,5 - 0,03 - 0,.25 tế Azlocilline Escherichia coli ATCC 25922 - 32 Azotréonam 0,06 - 0,.25 Carbénicilline - 16 Céphalotine - 32 Céfamandole 0,25 - 16 - 64 Céfopérazone Céfotaxime 0,12 - 0,5 0,06 - 0,25 - 32 >32 Céfoxitine 1-4 >128 Ceftazidime 0,06 - 0,5 1-4 Ceftriaxone 0,03 - 0,12 - 32 Chloramphénicol - 16 Ciprofloxacine 0,004 - 0,015 Tên kháng sinh Clindamycine Colistine Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - 16 16 - 64 ATCC 25923 16 - 64 0,06 - 0,25 0,25 - 2-8 2-8 0,25 - 1-4 - 16 - 16 0,25 - 0,2 - 0,006 - 0,25 0,25 - 0,5 - 0,25 - 0,06 - 0,25 Staphylococcus aureus 2-8 - 16 Erythromycine Gentamicine Imipeneme Enterococcus faecalis ATCC 29212 1-4 0,5 - 0,5 - 0,12 - 0,5 0,12 - 0,5 1-4 0,12 - 0,25 0,01 - 0,06 Sơ đồ 1: Qui trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán 6.6 Độ tin cậy Qui trình Kỹ thuật xây dựng dựa thường qui chuẩn thức Việt Nam dựa qui trình thao tác chuẩn thử nghiệm tính nhậy cảm kháng sinh CLSI (Clinical laboratory standard Institute) năm 2010 Qui trình đánh giá phòng thí nghiệm kháng sinh-khoa Vi khuẩn-Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Nếu thực qui trình cách xác, thu kết mà qua dự báo cách chắn kháng sinh có tác dụng lâm sàng - - Kiểm sốt chất lượng: Để đảm bảo cách xác qui trình cần phải kiểm tra chất lượng loạt mơi trường sau pha hoạt tính khoanh giấy kháng sinh chủng chuẩn quốc tế Các chủng chuẩn quốc tế phải thử nghiệm song song với chủng thử nghiệm nhằm đảm bảo xác kết - - Tuân thủ cách xác qui trình xét nghiệm Ghi lại đầy đủ nhật ký làm việc giúp cho theo dõi kiểm soát cách dễ dàng tồn qui trình thử nghiệm Các u cầu an toàn: Các cán làm thử nghiệm phải tuân thủ đầy đủ nguyên tắc an toàn làm việc với vi khuẩn gây bệnh Mặc quần áo bảo hộ lao động, đội mũ, đeo găng mang trang Không ăn uống hay mang thức ăn vào phòng xé nghiệm Chất thải phát sinh phương pháp xử lý: Chất thải qui trình xét nghiệm phải cho túi đựng chất thải nguy hiểm cho vào phòng khử trùng hấp xấy 1210C/15 phút 10 Tài liệu tham khảo Lê Lan Hương Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật Y học Nhà xuất Y học, Hà nội, 1991:339-349 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing twentieth informational supplement M100-S20; 30(1), 2010 Phụ lục 1: Bảng Dung mơi chất hòa tan để chuẩn bị dung dịch kháng sinh [CLSI, 2010] Kháng sinh Dung mơi hòa tan Chất hòa tan Amikacin Nước Amoxicillin Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Ampicillin Đệm Phosphate, pH 8.0, 0.1 mol/L Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Azithramycin 95% ethanol axit acetic Môi trường canh thang Azlocillin Nước Aztreonam Saturated solution sodium bicarbonate Nước Besitloxacin Methanol Carbenicillin Nước Cefaclor Nước Cefadroxil Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Cefamandole Nước Cefazolin Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Nước Nước Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Cefdinir Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Nước Cefditoren Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Nước Ceíepime Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Cefetamet Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Nước Cefixime Đệm Phosphate, pH 7.0, 0.1 mol/L Đệm Phosphate, pH 7.0, 0.1 mol/L Cefmetazole Nước Cefonicid Nước Cefoperazone Nước Cefotaxime Nước Cefotetan DMSO Ceíoxitin Nước Ceípodoxime 0.10% (11.9 mmol/L) dung dịch Natri bicarbonate Cefprozil Nước Nước Nước Ceftaroline 0.85% nước muối sinh lý 0.85% nước muối sinh lý Ceftazidime Natri carbonated Nước Ceftibuten 1/10 voi DMSO Nước Ceftizoxime Nước Ceftobiprale DMSOg thêm axit acetic băng e,i Ceftríaxone Nước Cefuroxime Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Cephalexin Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Nước Cephalothin Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Nước Cephapirin Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Nước Cephradine Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Nước Chloramphenicol 95% ethanol Nước Cinoxacin 1/2 thể tích nước, thêm1 mol/L NaOH, nhỏ giọt để hòa tan Nước Ciprofloxacin Nước Clarithromycin Methanole or glacial acetic axite Nước, vortex mạnh Đệm Phosphate, pH 6.5, 0.1 mol/L Clavulanic axit Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Clinatloxacin Nước Clindamycin Nước Colistina Nước Nước Dalbavancin DMSOg DMSO Daptomycin Nước Nước Dirithromycin Axit acetic Nước Doripenem 0.85% nước muối sinh lý 0.85% nước muối sinh lý Doxycycline Nước Enoxacin 1/2 thể tích nước, nhỏ giọt 0.1 mol/L NaOH để hòa tan Nước Ertapenem Đệm phosphate, pH 7.2, 0.01 mol/L Đệm phosphate, pH 7.2, 0.01 mol/L Erythromycin 95% ethanol axit acetic băng Nước Faropenem Nước Nước Fidaxomicin DMSOg Nước Fleroxacin 1/2 thể tích nước, nhỏ giọt 0.1 mol/L NaOH để hòa tan Nước Garenoxacin Nước (kết hợp khuấy) Gatitloxacin Nước (kết hợp khuấy) Gemiíloxacin Nước Gentamicin Nước lclaprim DMSOg Nước Imipenem Đệm Phosphate, pH 7.2, 0.01 mol/L Đệm Phosphate, pH 7.2, 0.01 mol/L Kanamycin Nước Levofloxacin 1/2 thể tích nước, nhỏ giọt 0.1 mol/L NaOH để hòa tan Linezolid Nước Linopristin-tlopristin DMFl Lomefloxacin Nước Loracarbet Nước Mecillinam Nước Meropenem Nước Methicillin Nước Nước Nước Metronidazole DMSO Mezlocillin Nước Minocycline Nước Moxalactam(diammon 0.04 mol/L HOI (để yên 1.5 đến h) ium salt) Nước Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Moxiíloxacin Nước Mupirocin Nước Nafcillin Nước Nalidixic axit 1/2 thể tích nước, nhỏ giọt 0.1 mol/L NaOH để hòa tan Netilmicin Nước Nitrofurantoinc Đệm Phosphate, pH 8.0, 0.1 mol/L Đệm Phosphate, pH 8.0, 0.1 mol/L Norfloxacin 1/2 thể tích nước Nước Ofloxacin 1/2 thể tích nước Nước Oritavancin 0.002% polysorbate-80 in wateH 0.002% polysorbate-80 nước Oxacillin Nước Penicillin Nước Piperacillin Nước Polymyxin B Nước Quinupristindalfopristin Nước Razupenem Đệm Phosphate, pH 7.2, 0.01 mol/L Đệm Phosphate, pH 7.2, 0.01 mol/L Rifampin Methanole (nồng độ tối đa = 640 μg/mL) Nước (kết hợp khuấy) Nước Nước Sparfloxacin Nước Spectinomycin Nước Streptomycin Nước Sulbactam Nước Sultonamides 1/2 thể tích nước nóng lượng tối thiểu 2.5 mol/L NaOH để hòa tan Sulopenemk 0.01 M đệm phosphate, pH 7.2, vortex 0.01 M đệm phosphate, pH để hòa tan 7.2 Tazobactam Nước Teicoplanin Nước Nước Telavancin DMSO Nước Telithromycin Axit acetic Nước Tetracycline Nước Ticarcillin Đệm Phosphate , pH 6.0, 0.1 mol/L Đệm Phosphate, pH 6.0, 0.1 mol/L Tigecycline Nước Nước Tobramycin Nước Trimethoprim 0.05 mol/L lacticg axit hydrochlorice, 10% thể tích cuối Trimethoprim (nếu lactate) Nước Trospectomycin Nước Ulifloxacin (prulitloxacin) DMSO Vancomycin Nước Nước Nước (có thể cần đun nóng) Nước Phụ lục 2: Bảng Giới hạn cho phép chủng chuẩn kiểm tra chất lượng sử dụng để đảm bảo tính xác nồng độ ức chế tối thiểu (MICs) (μg/mL) chủng dễ nuôi cấy (Sử dụng môi trường Mueller-Hinton điều chỉnh cation môi trường lỏng) không bổ sung máu chất dinh dưỡng khác [CLSI, 2010] Escherichia Coli ATCC® 25922 Escherichia coli ATCC® 35218b 0.5-4 - 2/1-8/4 4/2-16/8 2-8 - 2/1-8/4 8/4-32/16 - - 8-32 - Aztreonam 0.06-0.25 - Besifloxacin 0.06-0.25 - Carbenicillin 4-16 - 1-4 - 0.25-1 - 1-4 - 0.12-0.5 - Cefditoren 0.12-1 - Cefepime 0.015-0.12 - Cefetamet 0.25-1 - Cefixime 0.25-1 - Cefmetazole 0.25-1 - Cefonicid 0.25-1 - Kháng sinh Amikacin Amoxicillin-clavulanic axit Ampicillin Ampicillin-sulbactam Azithromycin Azlocillin Cefaclor Cefamandole Cefazolin Cefdinir Cefoperazone 0.12-0.5 - Cefotaxime 0.03-0.12 - Cefotetan 0.06-0.25 - Cefoxitin 2-8 - 0.25-1 - 1-4 - Ceftaroline 0.03-0.12 - Ceftazidime 0.06-0.5 - Ceftibuten 0.12-0.5 - Ceftizoxime 0.03-0.12 - Ceftobiprole 0.03-0.12 - Ceftriaxone 0.03-0.12 - Cefuraxime 2-8 - Cephalothin 4-16 - Chloramphenicol 2-8 - Cinoxacin 2-8 - 0.004-0.015 - - - Clinafloxacin 0.002-0.015 - Dalbavancin - - Daptomycin - - Dirithromycin - - Doripenem 0.015-0.06 - Doxycycline 0.5-2 - Cefpodoxime Cefprozil Ciprofloxacin Clarithromycin Enoxacin 0.06-0.25 - 0.004-0.015 - - - 0.25-1 - - - Fleroxacin 0.03-0.12 - Fosfomycin 0.5-2 - Garenoxacin 0.004-0.03 - Gatifloxacin 0.008-0.03 - Gemifloxacin 0.004-0.015 - Gentamicinh 0.25-1 - 0.004-0.03 - 1-4 - Imipenem 0.06-0.25 - Kanamycin 1-4 - 0.008-0.06 - - - 0.03-0.12 - Loracarbef 0.5-2 - Mecillinam 0.03-0.251 - Meropenem 0.008-0.06 - Methicillin - - Mezlocillin 2-8 - Ertapenem Erythromycin Faropenem Fidaxomicin Grepafloxacin Iclaprim Levofloxacin Linezolid Lomefloxacin Minocycline 0.25-1 - Moxalactam 0.12-0.5 - Moxifloxacin 0.008-0.06 - - - 1-4 - < 0.5-1 - 4-16 - Norfloxacin 0.03-0.12 - Clindamycin - - 0.25-1 - 0.015-0.12 - Oritavancin - - Oxacillin - - Penicillin - - 1-4 - Piperacillin-tazobactam 1/4-4/4 0.5/4-2/4 Polymyxin B 0.25-2 - - - 0.06-0.5 - 4-16 - Sparfloxacin 0.004-0.015 - Sulfisoxazole 8-32 - 0.015-0.06 - Nafcillin Nalidixic axit Netilmicin Nitrofurantoin Colistin Ofloxacin Piperacillin Quinupristin-dalfopristin Razupenem Rifampin Sulopenem Teicoplanin - - Telavancin - - Telithromycin - - Tetracycline 0.5-2 - Ticarcillin 4-16 - Ticarcillin-clavulanic axit 4/2-16/2 8/2-32/2k Tigecycline 0.03-0.25 - Tobramycin 0.25-1 - 0.5-2 - < 0.5/9.5 - 8-32 - 0.004-0.015 - 0.004-0.015 - - - Trimethoprim Trimethoprimsulfamethoxazole Trospectomycin Trovafloxacin Ulifloxacin (prulifloxacin) Vancomycin Lưu ý: Các giá trị MIC thu số phòng xét nghiệm tham khảo phương pháp vi pha lỗng Nếu bốn nồng độ thử nghiệm, việc kiểm sốt chất lượng khó khăn Bảng mẫu ghi kết MIC: Tên kháng sinh: Mơi trường: Nhiệt độ khí trường: Số thứ tự Số chủng Kết MIC 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Chủng chuẩn 32 Chủng chuẩn ... - viết tắt I) đề kháng (Resistante - viết tắt R) Sơ đồ 1: Qui trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán 6.6 Độ tin cậy Qui trình Kỹ thuật xây dựng dựa... khuẩn cần xác định MIC: Nhất thiết phải chủng định danh khiết V KỸ THUẬT 5.1 Cách pha kháng sinh 5.1.1 Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch “mẹ”) 5.1.1.1 Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho... cân Xg kháng sinh: Kháng sinh bột sau cân, pha với dung dịch đệm thích hợp (xem 6.1.), tùy theo loại kháng sinh khác có dung mơi dung dịch đệm khác (phụ thuộc hãng sản xuất loại kháng sinh) Nhiều