CÁC kỹ THUẬTSÀNG lọc DI TRUYỀN ỨNG DỤNG TRONG điều TRỊ vô SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ BÍCH VÂN CÁC KỸ THUẬT SÀNG LỌC DI TRUYỀN ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ VÔ SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ BÍCH VÂN CÁC KỸ THUẬT SÀNG LỌC DI TRUYỀN ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ VÔ SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Duy Bắc Cho đề tài: “Mối liên quan số yếu tố nguy tình trạng rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi” Chuyên ngành: Sản Phụ khoa Mã số: 62720131 CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2018 CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT a-CGH: Array Comparative Genomic Hybridization/ Lai so sánh/ Đối chiếu gen dùng chíp DNA ADO: Allele Drop-Out / Mất alen ART: Assisted Reproductive Technology/ Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản a-SNP: Array Single Nucleotide Polymorphism/ Phân tích đa hình đơn dùng chíp DNA BAC: Bacterial artificial chromosome DNA: DeoxyriboNucleic Acid FISH: Fluorescent In Situ Hybridization/ Lai huỳnh quang chỗ ICM: Inner Cell Mass/ Nguyên bào phôi-mầm phôi ICSI: Intra Cytoplasmic Sperm Injection/ Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn IUI: Intra-Uterine Insemination/ Bơm tinh trùng vào buồng tử cung IUI-D: Sử dụng tinh dịch hiến tặng IUI-H: Sử dụng tinh dịch chồng IVF: In-Vitro Fertiliztion/ Thụ tinh ống nghiệm IVM: In vitro maturation of oocytes/ Kỹ thuật nuôi trứng trưởng thành ống nghiệm KL-BoBs: BACs - on - Beads/ Phương pháp KaryoLite BoBs NGS: Next Generation Sequencing/ Giải trình tự gene hệ NST: Nhiễm sắc thể PB: Phôi bào PGD: Preimplantation genetic diagnosis/ Chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi PGS: Preimplantation genetic screening/ Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi PGT: Preimplantation genetic testing/ Test di truyền trước chuyển phôi PZD: Partial zona dissection qPCR: Quantitative Polymerase Chain Reaction/ Phản ứng chuỗi định lượng RNA: RiboNucleic Acid TE: Trophectoderm/ Nguyên bào nuôi WGA: Whole Genome Application / Khuếch đại gen WHO: Tổ chức Y tế Thế giới MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Vô sinh vấn đề giới quan tâm tỷ lệ vơ sinh có xu hướng ngày tăng Theo thống kê WHO, tỷ lệ vơ sinh chung giới 6÷12%, tỷ lệ Việt Nam 7,7% Nhờ phát triển y học đại, nhiều nguyên nhân vơ sinh tìm từ đưa phương pháp điều trị vô sinh phù hợp có hiệu Thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization/IVF) phương pháp hỗ trợ sinh sản có vai trò quan trọng điều trị vơ sinh, ngày phát triển rộng khắp giới Tuy nhiên, phôi chuyển kỹ thuật IVF phôi chọn lựa hình thái tốt, tỷ lệ thành cơng kỹ thuật thấp, từ 30÷35% Ngun nhân rối loạn nhiễm sắc thể cao trứng phôi Đã 60 năm kể từ ca phát rối loạn NST, nhà khoa học giới thu thập nhiều thông tin nguồn gốc, nguyên nhân gây rối loạn Những rối loạn xảy suốt hệ thống tế bào sinh sản ( trứng tinh trùng), vào giai đoạn phát triển ban đầu phơi bào, tế bào sau sinh Một số nghiên cứu cho gần nửa noãn người bị rối loạn NST, tỷ lệ tăng lên đáng kể người phụ nữ 35 tuổi [1] Nhiều nghiên cứu phơi người giai đoạn sớm thường có rối loạn NST 50% phôi tạo ống nghiệm có chứa phơi bào bị đột biến NST Các rối loạn NST dẫn đến kết phôi không làm tổ được, sẩy thai, thai chết lưu, sinh đứa trẻ bị Trisomy Vì vậy, sàng lọc rối loạn NST cho phôi trước chuyển vào tử cung người phụ nữ thực cần thiết Gần đây, tổng hợp kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ có thai tăng lên đáng kể tiến hành sàng lọc di truyền trước chuyển phôi (preimplantation genetic screening/PGS) [2] Với tiến di truyền học đại, nhiều kỹ thuật di truyền tế bào phân tử ứng dụng thành cơng sàng lọc chẩn đốn di truyền trước chuyển phôi FISH, aCGH, BoBs, NGS Mỗi kỹ thuật có ưu nhược điểm khác Việc nghiên cứu, tìm phương pháp ưu việt để sàng lọc, lựa chọn phơi có nhiễm sắc thể bình thường yêu cầu cấp thiết thực tiễn, giúp cho thụ tinh ống nghiệm đạt kết cao, đảm bảo cho đời hệ khoẻ mạnh thể lực, sáng suốt tinh thần, góp phần nâng cao chất lượng dân số Mục tiêu chuyên đề “Các kỹ thuật sàng lọc di truyền ứng dụng điều trị vô sinh phương pháp thụ tinh ống nghiệm” gồm: Trình bày kỹ thuật sinh thiết phôi thụ tinh ống nghiệm Các kỹ thuật di truyền sàng lọc di truyền trước chuyển phôi I SỰ PHÁT TRIỂN BÌNH THƯỜNG CỦA PHƠI TRƯỚC KHI LÀM TỔ Phơi giai đoạn tiền nhân Noãn thụ tinh để tạo thành hợp tử phát triển thành phôi qua nhiều giai đoạn, khởi đầu giai đoạn tiền nhân Tiền nhân đực tiền nhân thường hình thành lúc Tiền nhân đực hình thành gần vị trí tinh trùng thâm nhập tiền nhân hình thành cực bào tương có thoi phân bào [3] Tiền nhân có kích thước nhỏ mờ, tiền nhân có khoảng đến hạt nhân, tiền nhân nhỏ có hạt nhân [1] Có thể quan sát thấy hình ảnh tiền nhân sau tiêm tinh trùng vào bào tương noãn 4h; muộn cấy noãn với tinh trùng, từ 5-6 Khoảng 15 sau thụ tinh, hai tiền nhân nằm sát có hình số 8, phần tiếp xúc sát tạo thành mặt phẳng, đồng thời hạt nhân di chuyển xếp hàng cạnh vùng tiếp xúc hai tiền nhân Phôi giai đoạn phân chia (ngày 2-3 sau thụ tinh) Sự phân chia phôi bào gồm loạt chu kỳ phân bào bào tương Trung thể tinh trùng kiểm soát phân chia sau thụ tinh [4] Trong chu kỳ phân bào giai đoạn cuối, bào tương hợp tử kéo dài thắt lại dần hợp tử phân chia thành hai phơi bào Q trình tiếp tục chu kỳ phân bào Trong chu kỳ phân bào đầu tiên, kích thước phơi thường thay đổi, kích thước phơi bào giảm khoảng 28,5% cho chu kỳ phân bào (hình 1) Phơi có đến phơi bào phụ thuộc chủ yếu vào dịch mã từ chất liệu RNA mẹ để phân chia [5] Phôi dâu (phơi ngày 4) Ở người phơi dâu bắt đầu hình thành phôi giai đoạn phôi bào bắt đầu q trình kết đặc Phơi dâu người xuất sớm khoảng 65 sau thụ tinh, thường xuất ngày thứ thứ sau thụ tinh [6] Q trình phơi kết đặc trình hình thành liên kết chặt chẽ phôi bào, phần phôi bào tiếp xúc với tăng lên dàn phẳng tạo thành khối khơng nhìn rõ ranh giới phôi bào, bề mặt phôi phủ lớp vi nhung mao Các phôi bào mảnh vụn tế bào mà khơng hình thành liên kết với phơi bào khác bị đẩy ngồi khối phơi phía màng suốt phơi màng [7] Dưới kính hiển vi, hình thái phơi dâu thể tăng tiếp xúc phôi bào, ranh giới phơi bào nhìn thấy Khi q trình kết đặc tăng dần, ranh giới phôi bào trở nên khó phân biệt phơi bào dàn phẳng kết liền với Phôi dâu lúc giai đoạn hồn tồn trơng tế bào có nhiều nhân (hình 2) Khi phơi bắt đầu kết đặc lại, phôi bào tương tác với làm phơi bào khơng đặc tính tồn khởi đầu cho mã DNA phôi Phôi nang (phôi ngày 5-6) Sau phôi kết đặc, phôi bắt đầu lớn dần tạo nang dịch bên tạo điều kiện cho phát triển để phơi bào biệt hóa thành ngun bào ni mầm phơi (hình 3) Phơi nang thường hình thành khoảng 100 sau thụ tinh Q trình tạo nang bao gồm tích lũy dịch vận chuyển ngun bào ni Để hồn thành q trình này, ngun bào ni phụ thuộc vào hồn thành q trình phân cực tế bào hình thành mối liên kết chặt nguyên bào nuôi Sự liên kết vị trí phơi bào phơi kiểm sốt phân cực tế bào Một số yếu tố ảnh hưởng đến hình thành phát triển phơi nang như: chất lượng tinh trùng, tuổi mẹ, số lượng noãn thu được, số lượng trứng thụ tinh, số lượng hợp tử, số lượng phôi phát triển đến giai đoạn phôi bào vào ngày 3, yếu tố khác liên quan đến phát triển phôi giai đoạn trước Sau 5-6 ngày ni cấy, 26-65% phôi phát triển đến giai đoạn 10 Sự phát triển tùy thuộc vào phương pháp ni cấy thành phần mơi trường ni cấy Hình Sự phát triển phôi ngày (từ trái qua phải: phơi có phơi bào, phơi bào, phôi bào phôi bào) (Nguồn: RRFC) Hình Phơi dâu ngày (từ trái qua phải: phôi bào bắt đầu kết đặc vài điểm nhìn rõ ranh giới phơi bào; phôi bào kết đặc thấy ranh giới góc 9-12 giờ, có nhiều nhân; kết đặc hồn tồn khơng rõ ranh giới phơi bào) (Nguồn: RRFC) Hình Phôi giai đoạn tạo nang/ (từ trái qua phải: xuất khe dịch góc giờ; khe dịch lớn dần, nhiều lên, khe dịch chiếm 1/2 thể tích phơi) (Nguồn: RRFC) Sự biệt hóa tế bào Ở người, phôi giai đoạn phôi bào có đặc tính tồn năng, chứng tiến hành chẩn đoán trước làm tổ, sinh thiết hai phơi bào phơi có khả phát triển bình thường Tuy nhiên, sinh thiết phôi bào giai đoạn ≤ phôi bào ảnh hưởng đến phát triển phôi giảm số lượng nguyên bào phôi (mầm phôi) [8] Trong trình hình 21 Hình Quy trình kỹ thuật FISH Khi thiết kế thí nghiệm lai FISH, người sử dụng cần cân nhắc độ nhạy độ phân giải cần thiết cho thí nghiệm để lựa chọn thiết bị phù hợp Độ nhạy phụ thuộc nhiều vào khả tụ sáng kính hiển vi đặc biệt, độ nhạy cao có khả phát trình tự đích có kích thước nhỏ Độ phân giải tương đương với khả phân biệt hai điểm chiều dài nhiễm sắc thể Các kính hiển vi quang học bình thường khơng thể cho độ phân giải nhỏ 200-250 nm, giới hạn quan sát phổ ánh sáng nhìn thấy Ngồi ra, nghiên cứu viên cần cân nhắc lựa chọn thời điểm lai, nhiễm sắc thể kỳ có kích thước lớn gấp hàng ngàn lần nhiễm sắc thể kỳ trung gian, vậy, cần thấu kính có độ phóng đại x10 quan sát DNA mắt thường 22 Kỹ thuật lai so sánh gen CGH (Comparative Genomic Hybridization) 2.1 Nguyên lí kỹ thuật: Kỹ thuật lai so sánh gen kỹ thuật di truyền tế bào phân tử dùng để phân tích đánh giá thay đổi trình chép số lượng (nhiều/ít) thành phần DNA mẫu xét nghiệm Cùng lúc kỹ thuật CGH kiểm tra toàn NST tế bào giai đoạn phân chia mà không cần kỹ thuật cố định tế bào Trong kỹ thuật này, sử dụng kỹ thuật lai so sánh/đối chiếu DNA cần xét nghiệm đánh dấu màu xanh với DNA NST bình thường sử dụng làm chứng đánh dấu màu đỏ Tỷ lệ phần huỳnh quang xanh/ phần huỳnh quang đỏ dọc theo NST thể số lượng NST mẫu thử với mẫu chứng Nếu màu huỳnh quang xanh đặc hiệu cho NST tăng dư chứng tỏ có tăng thêm NST (thể tam nhiễm), trái lại màu huỳnh quang đỏ tăng dư biểu thiếu NST 23 Hình Nguyên lý kỹ thuật lai so sánh gen CGH 24 2.2 Quy trình kỹ thuật DNA tế bào phơi sau sinh thiết nhân tồn hệ gen, sau dán nhãn với fluorochrome (phân tử huỳnh quang) màu xanh cây, sau trộn lẫn (1: 1) với DNA bình thường tham chiếu dán nhãn màu đỏ lai 2-3 ngày Sử dụng kính hiển vi huỳnh quang máy tính với phần mềm phân tích hình ảnh chun dụng để thực phân tích tín hiệu huỳnh quang màu khác so sánh dọc theo chiều dài nhiễm sắc thể, để xác định khác biệt nhiễm sắc thể hai nguồn Cường độ màu mẫu tế bào phôi cao vùng cụ thể nhiễm sắc thể (tỷ lệ> 1) cho thấy thừa vật liệu vùng mẫu phơi tương ứng, ngược lại cường độ cao mẫu màu tham chiếu (tỷ lệ