KẾT QUẢ NGHIÊN cứu độc TÍNH cấp và tác DỤNG bảo vệ GAN CHỐNG OXY hóa CỦA CÁC mẫu THỬ VMP TRÊN THỰC NGHIỆM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ MÔN DƯỢC LÝ Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự – Hạnh phúc KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN - CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC MẪU THỬ VMP TRÊN THỰC NGHIỆM Nơi tiến hành nghiên cứu: Bộ môn Dược lý - Đại học Y Hà Nội Thời gian tiến hành nghiên cứu: 05/2018 A ĐỘC TÍNH CẤP 1.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Thuốc nghiên cứu: Các mẫu VMP sản xuất Công ty Cổ phần Y Dược Công nghệ cao Việt Nam (VMP Pharma) Mẫu nghiên cứu Dạng bào chế Liều dùng người VMP235 Dịch chiết 60 mg/kg/ngày VMP135 Dịch chiết 60 mg/kg/ngày VMP145 Dịch chiết 60 mg/kg/ngày - Mẫu VMP 235, cân 11 gam thêm nước thành 32 ml vừa đủ dùng cho nghiên cứu độc tính cấp Như 32 ml chứa 11gam dược liệu dùng nghiên cứu độc tính cấpvà xác định LD50 - Mẫu VMP 135, cân 10 gam thêm nước thành 35 ml vừa đủ dùng cho nghiên cứu độc tính cấp Như 35 ml chứa 10gam dược liệu dùng nghiên cứu độc tính cấpvà xác định LD50 Mẫu VMP 145, cân 17,63 gam thêm nước thành 47 ml vừa đủ Lấy 20 ml dung dịch đậm đặc thêm 5ml nước thành 25 ml dùng cho nghiên cứu độc tính cấp Như 25 ml chứa 7,5 gam dược liệu dùng nghiên cứu độc tính cấpvà xác định LD50 1.1.2 Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22g Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột ni phịng thí nghiệm Bộ môn Dược lý 5-10 ngày trước nghiên cứu suốt thời gian nghiên cứu thức ăn chuẩn dành riêng cho chuột (do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp), uống nước tự 1.2 Máy móc phục vụ nghiên cứu - Cân điện tử Nhật, độ xác 0,001 gam - Kim đầu tù cho chuột uống - Cốc chia vạch, bơm kim tiêm 1ml 2 1.3 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu độc tính cấp thuốc thử VMP 235, VMP 135 VMP 145theo đường uống chuột nhắt trắng Nghiên cứu độc tính cấp xác định LD50 thuốc thử VMP 235, VMP 135 VMP 145 chuột nhắt trắng theo đường uống [1], [2] Trước tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm Chuột chia thành lô khác nhau, lô 10 Cho chuột uống thuốc thử VMP 235, VMP 135 VMP 145 với liều tăng dần thể tích để xác định liều thấp gây chết 100% chuột liều cao không gây chết chuột (gây chết 0% chuột) Theo dõi tình trạng chung chuột, q trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu nhiễm độc (như nơn, co giật, kích động, tiết…) số lượng chuột chết vòng 72 sau uống thuốc Tất chuột chết mổ để đánh giá tổn thương đại thể Từ xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 thuốc thử Sau tiếp tục theo dõi tình trạng chuột đến hết ngày thứ sau uống thuốc thử VMP 235, VMP 135 VMP 145 1.4 Xử lý số liệu Các số liệu xử lý thống kê theo thuật toán thống kê T-test Student phần mềm Microsoft Excel Kết nghiên cứu Chuột nhắt trắng uống thuốc thử VMP 235, VMP 135 VMP 145 từ liều thấp đến liều cao Lô chuột uống đến liều 0,25 ml/10 g, lần 24 dung dịch đậm đặc nhất, theo dõi thấy liều VMP 235, VMP 135 VMP 145 khơng có biểu gì, khơng xuất triệu chứng bất thường 72 sau uống thuốc thử Kết trình bày bảng Bảng 1: Kết nghiên cứu độc tính cấp thuốc thử VMP 235 Lô chuột n Lô Lô Lô 10 10 10 Liều (gam dược liệu/kg) 15,469 20,625 25,781 Tỷ lệ chết (%) 0 Dấu hiệu bất thường khác Không Không Không Kết bảng cho thấy: lô chuột uống thuốc thử VMP 235ở liều từ 15,469 g/kg đến liều tối đa 25,781/kg khơng có biểu độc tính cấp Từ bảng tính liều dung nạp tối đa (Ln nhỏ liều chết 50%) thuốc thử VMP 235 là: 25,781g/kg Như vậy, thuốc thử VMP 235 uống gấp 35,81 lần liều dự kiến người độc tính (tính người lớn 50kg, liều tối đa gam/người/ngày, hệ số ngoại suy chuột nhắt 12) Bảng 2: Kết nghiên cứu độc tính cấp thuốc thử VMP 135 Lô chuột Lô Lô Lô n 10 10 10 Liều Tỷ lệ chết g/kg 12,857 17,143 21,429 (%) 0 Dấu hiệu bất thường khác Không Không Không Kết bảng cho thấy: lô chuột uống thuốc thử VMP 135ở liều từ 12,857g/kg đến liều tối đa 21,429/kg khơng có biểu độc tính cấp Từ bảng tính liều dung nạp tối đa (Luôn nhỏ liều chết 50%) thuốc thử VMP 135 là: 21,429g/kg Như vậy, thuốc thử VMP 135 uống gấp 29,76 lần liều dự kiến người khơng có độc tính (tính người lớn 50kg, liều tối đa gam/người/ngày, hệ số ngoại suy chuột nhắt 12) Bảng 3: Kết nghiên cứu độc tính cấp thuốc thử VMP 145 Lơ n Liều g/kg Tỷ lệ chết (%) Dấu hiệu bất thường khác chuột Lô 1 13,5 Không Lô 18,0 Không Lô 22,5 Không Kết bảng cho thấy: lô chuột uống thuốc thử VMP 145ở liều từ 13,5g/kg đến liều tối đa 22,5 g/kg khơng có biểu độc tính cấp Từ bảng tính liều dung nạp tối đa (Luôn nhỏ liều chết 50%) thuốc thử VMP 145 là: 22,5 g/kg Như vậy, thuốc thử VMP 145 uống gấp 31,25 4 lần liều dự kiến người khơng có độc tính (tính người lớn 50kg, liều tối đa gam/người/ngày, hệ số ngoại suy chuột nhắt 12) Kết luận: 3.1 Về VMP 235 - Chưa xác định LD50 chuột nhắt trắng thuốc thử VMP 235trên đường uống - Thuốc thử VMP 235 uống gấp 35,81 lần liều dự kiến người khơng có độc tính cấp 3.2 Về VMP 135 - Chưa xác định LD50 chuột nhắt trắng thuốc thử VMP 135trên đường uống - Thuốc thử VMP 135 uống gấp 29,76 lần liều dự kiến người khơng có độc tính cấp 3.3 Về VMP 145 - Chưa xác định LD50 chuột nhắt trắng thuốc thử VMP 145trên đường uống - Thuốc thử VMP 145 uống gấp 31,25 lần liều dự kiến người khơng có độc tính cấp TÀI LIỆU THAM KHẢO Gerhard Vogel H (2012), Drug discovery and evaluation Pharmacological assays, Springer World Health Organization (2013),Working group on the safety and efficacy of herbal medicine, Report of regional office for the western pacific of the World Health Organization 5 B TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN VÀ CHỐNG OXY HÓA Nguyên liệu, đối tượng phương pháp nghiên cứu 1.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Các mẫu VMPđược sản xuất Công ty Cổ phần Y Dược Công nghệ cao Việt Nam (VMP Pharma) Mẫu nghiên cứu VMP235 VMP135 VMP145 1.1.2 Đối tượng nghiên cứu Dạng bào chế Dịch chiết Dịch chiết Dịch chiết Liều dùng người 60 mg/kg/ngày 60 mg/kg/ngày 60 mg/kg/ngày Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 25± 02g Động vật thực nghiệm ni phịng thí nghiệm Bộ môn Dược lý – ngày trước nghiên cứu suốt thời gian nghiên cứu thức ăn chuẩn dành riêng cho chuột nhắt, uống nước tự 1.2 Thuốc, hóa chất máy móc phục vụ nghiên cứu - Silymarin viên nang70 mg Công ty TNHH LD STADA-VN sản xuất - Paracetamol viên nén sủi bọt 500 mg (biệt dược Efferalgan), công ty SanofiAventis sản xuất - Dung dịch CMC 0,5% (dung mơi pha silymarin) - Máy xét nghiệm sinh hóa Erba Chem V3 (Ấn Độ) 1.3 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành sau [1], [2]: Chuột nhắt trắng, chia ngẫu nhiên thành lô sau: - Lô (đối chứng): uống nước cất, 0,2 mL/10 g - Lơ (mơ hình): uống nước cất 0,2 mL/10g + paracetamol 400 mg/kg - Lô (chứng dương): uống silymarin 140 mg/kg + paracetamol 400 mg/kg - Lô 4: uống VMP235liều thấp 720 mg/kg + paracetamol 400 mg/kg 6 - Lô 5: uống VMP235 liều cao 2160 mg/kg + paracetamol 400 mg/kg - Lô 6: uống VMP135 liều thấp 720 mg/kg + paracetamol 400 mg/kg - Lô 7: uống VMP135 liều cao 2160 mg/kg + paracetamol 400 mg/kg - Lô 8: uống VMP145 liều thấp 720 mg/kg + paracetamol 400 mg/kg - Lô 9: uống VMP145 liều cao 2160 mg/kg + paracetamol 400 mg/kg Chuột cho uống thuốc thử nước cất liên tục vào buổi sáng 10 ngày Đến ngày thứ 10, sau uống thuốc thử (chuột nhịn đói 16-18 trước đó), tiến hành gây tổn thương tế bào gan cách cho chuột từ lô đến lô uống paracetamol liều 400 mg/kg Sau 48 gây độc paracetamol: + + + + Lấy máu động mạch cảnh chuột để đo hoạt độ enzym AST, ALT Lấy gan: Cân trọng lượng gan Xác định hàm lượng MDA (malonyl dialdehyd) dịch đồng thể gan Quan sát hình ảnh đại thể gan lô chuột Giải phẫu mô bệnh học gan 30% số chuột lô 1.4 Xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu biểu diễn dạng X ± SD Các số liệu xử lý thống kê theo thuật toán thống kê T-test Student, test trước sau (Avant – Après) phần mềm Microsoft Excel 2010 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Khác biệt so với lô chứng trắng (lô 1) Khác biệt so với lô thuốc đối chứng (lô 2) Kết nghiên cứu 7 p ≤ 0,05 * p ≤ 0,01 ** p ≤ 0,001 *** + ++ +++ 2.1.Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan mẫu VMP qua trọng lượng gan, hoạt độ enzym gan số MDA gan chuột Bảng Ảnh hưởng mẫu VMP lên trọng lượng gan chuột Lô nghiên cứu Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Trọng lượng gan(g/10g thể trọng) Chứng sinh học Mơ hình Silymarin 140 mg/kg VMP235 liều thấp VMP235 liều cao VMP135 liều thấp VMP135 liều cao VMP145 liều thấp VMP145 liều cao 0,527 ± 0,095 0,650 ± 0,098* 0,567 ± 0,085 0,543 ± 0,083+ 0,519 ± 0,058++ 0,646 ± 0,117 0,544 ± 0,147 0,621 ± 0,110 0,557 ± 0,045+ Nhận xét: Kết bảng cho thấy - Trọng lượng gan chuột lơ mơ hình (chỉ uống paracetamol 400 mg/kg) (lô 2) tăng cao rõ rệt so với lô chứng (lô 1) (p < 0,001) - Trọng lượng gan chuột lô uống VMP235giảm có ý nghĩa thống kê so với lơ mơ hình (p < 0,05 p < 0,01) - Trọng lượng gan chuột lơ uống VMP135khơng có khác biệt so với lơ mơ hình(p > 0,05) - Trọng lượng gan chuột lô uống VMP145: + Liều thấp: khơng có khác biệt so với lơ mơ hình (p > 0,05) + Liều cao: giảm có ý nghĩa thống kê so với lơ mơ hình (p < 0,05) Bảng Ảnh hưởng VMP lên hoạt độ AST huyết chuột Lô nghiên cứu Lô Chứng sinh học Lơ Mơ hình Lơ Silymarin 140 mg/kg AST (UI/L) 125,82 ± 20,55 596,717 ± 109,61*** 318,71 ± 85,35+++ P so với lô uống silymarin Lô VMP235 liều thấp 413,71 ± 99,03++ P > 0,05 Lô VMP235 liều cao 200,57 ± 54,77+++ P < 0,05 Lô VMP135 liều thấp 339,38 ± 169,73++ P > 0,05 Lô VMP135 liều cao 229,14 ± 37,57+++ P < 0,05 Lô VMP145 liều thấp 361,71 ± 106,64++ P > 0,05 Lô VMP145 liều cao 201,63 ± 53,55+++ P < 0,05 Nhận xét: Kết bảng cho thấy - Hoạt độ AST lơ mơ hình tăng cao rõ rệt so với lơ chứng sinh học, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 - Silymarin liều 140 mg/kg/ngày có tác dụng làm giảm rõ rệt hoạt độ AST so với lơ mơ hình (p < 0,001) - Các lô uống mẫu thử VMP tất mức liều nghiên cứu có hoạt độ AST thấp có ý nghĩa thống kê so với lơ mơ hình với p < 0,01 p < 0,001 9 Bảng Ảnh hưởng VMP lên hoạt độ ALT huyết chuột Lô nghiên cứu ALT (UI/L) P so với lô uống silymarin Lô Chứng sinh học 59,00 ± 14,12 Lơ Mơ hình 499,14 ± 97,59*** Lô Silymarin 140 mg/kg 180,00 ± 37,24+++ Lô VMP235 liều thấp 345,00 ± 49,99++ P < 0,05 Lô VMP235 liều cao 207,14 ± 24,96+++ P > 0,05 Lô VMP135 liều thấp 310,38 ± 78,19+++ P < 0,05 Lô VMP135 liều cao 254,43 ± 68,86+++ P < 0,05 Lô VMP145 liều thấp 271,57 ± 59,47+++ P < 0,05 Lô VMP145 liều cao 154,38 ± 35,38+++ P < 0,05 Nhận xét: Kết bảng cho thấy - Hoạt độ ALT lô mô hình tăng cao rõ rệt so với lơ chứng sinh học, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 - Silymarin liều 140 mg/kg/ngày có tác dụng làm giảm rõ rệt hoạt độ ALT so với lơ mơ hình (p < 0,001) - Các lơ uống mẫu thử VMP tất mức liều nghiên cứu có hoạt độ ALT thấp có ý nghĩa thống kê so với lơ mơ hình với p < 0,01 p < 0,001 10 10 Bảng Ảnh hưởng VMP lên nồng độ MDAtrong dịch đồng thể gan Lô nghiên cứu MDA (nmol/100 mg gan) P so với lô uống silymarin Lô Chứng sinh học 10,99 ± 2,13 Lơ Mơ hình 20,38 ± 0,70*** Lô Silymarin 140 mg/kg 16,30 ± 0,72+++ Lô VMP235 liều thấp 20,62 ± 4,73 P > 0,05 Lô VMP235 liều cao 25,79 ± 5,62 P < 0,05 Lô VMP135 liều thấp 20,14 ± 4,13 P > 0,05 Lô VMP135 liều cao 21,83 ± 1,94 P < 0,05 Lô VMP145 liều thấp 17,75 ± 2,93 P > 0,05 Lô VMP145 liều cao 19,89 ± 2,98 P < 0,05 Nhận xét: Kết bảng cho thấy - Nồng độ MDA lô mô hình tăng cao rõ rệt so với lơ chứng sinh học, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 - Silymarin liều 140 mg/kg/ngày có tác dụng làm giảm rõ rệt nồng độ MDA so với lơ mơ hình (p < 0,001) - Nồng độ MDA lô uống VMP235, VMP135 tất mức liều nghiên cứu khơng có khác biệt so với lơ mơ hình (p > 0,05) - Nồng độ MDA lơ uống VMP145 có xu hướng giảm so với lơ mơ hình, nhiên khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 11 11 2.2 Hình ảnh đại thể vi thể gan chuột sau 10 ngày uống thuốc Ảnh 1: Hình ảnh đại thể vi thể gan chuột lơ chứng (chuột số 01) Gan bình thường (HE x 400) (HE x 400: Nhuộm Hematoxylin - Eosin, độ phóng đại 400 lần) Ảnh 2: Hình ảnh đại thể vi thể gan chuột lơ mơ hình(chuột số 13) Gan có hoại tử chảy máu lan rộng, thối hóa vừa tế bào gan(HE x 400) Ảnh 3: Hình ảnh đại thể vi thể gan chuột lơ mơ hình(chuột số 14) Gan có hoại tử tế bào gan, xâm nhập viêm thối hóa mức độ vừa (HE x 400) 12 12 Ảnh 4: Hình ảnh đại thể vi thể gan chuột lô silymarin (chuột số 22) Bào tương tế bào gan có hốc sáng nhỏ Gan thối hóa nhẹ (HE x 400) Ảnh 5: Hình ảnh đại thể gan chuột lô VMP235liều thấp(chuột số 97) Bào tương tế bào gan có nhiều hốc sáng nhỏ Gan thối hóa vừa (HE x 400) Ảnh 6: Hình ảnh đại thể gan chuột lô VMP235 liều thấp(chuột số 102) Bào tương tế bào gan có hốc sáng nhỏ Gan thối hóa nhẹ(HE x 400) 13 13 Ảnh 7: Hình ảnh đại thể gan chuột lơ VMP235 liều cao(chuột số 107) Bào tương tế bào gan có hốc sáng nhỏ Gan thối hóa nhẹ(HE x 400) Ảnh 8: Hình ảnh đại thể gan chuột lơ VMP135 liều thấp(chuột số 116) Bào tương tế bào gan có hốc sáng nhỏ Gan thối hóa nhẹ(HE x 400) Ảnh 9: Hình ảnh đại thể gan chuột lơ VMP135 liều thấp(chuột số 117) Bào tương tế bào gan có nhiều hốc sáng nhỏ Gan thối hóa vừa (HE x 400) 14 14 Ảnh 10: Hình ảnh đại thể gan chuột lơ VMP135 liều cao (chuột số 123) Gan có xâm nhập viêm thối hóa vừa tế bào gan (HE x 400) Ảnh 11: Hình ảnh đại thể gan chuột lơ VMP145 liều thấp(chuột số 125) Gan thối hóa mức độ vừa(HE x 400) Ảnh 12: Hình ảnh đại thể gan chuột lô VMP145 liều cao(chuột số 129) Gan thối hóa mức độ vừa(HE x 400) 15 15 Ảnh 13: Hình ảnh đại thể gan chuột lơ VMP145 liều cao(chuột số 131) Gan bình thường (HE x 400) Kết luận Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan chuột nhắt trắng mẫu thử VMPuống 10 ngày liên tục trênmơ hình gây tổn thương gan paracetamol liều 400 mg/kg cho thấy: - VMP235, VMP135 tất mức liều nghiên cứu làm giảm hoạt độ AST, ALT, nhiên chưa làm thay đổi nồng độ MDA so với lô mô hình - VMP145 mức liều nghiên cứu làm giảm hoạt độ AST, ALT có xu hướng làm giảm nồng độ MDA so với lô mô hình 16 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO Marisa Conti, Salvatore Malandrino and Maria Jose Magistretti (1992) Protective Activity of Silipide on Liver Damage in Rodents Japan J Pharmacol, 60, 315-321 Duangporn Werawatganon, Sittikorn Linlawan, Kessarin Thanapirom, Kanjana Somanawat, Naruemon Klaikeaw, Rungsun Rerknimitr, and Prasong Siriviriyakul (2014) Aloe vera attenuated liver injury in mice with acetaminophen-induced hepatitis BMC Complement Altern Med, 14: 229 (doi: 10.1186/1472-6882-14-229) Hà Nội, ngày 16 tháng 06năm 2018 Trưởng Bộ môn Dược lý PGS.TS Phạm Thị Vân Anh Trường Đại học Y Hà Nội xác nhận Chữ ký PGS.TS Phạm Thị Vân Anh Trưởng phòng Tổ chức Cán 17 17 ... Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu độc tính cấp thuốc thử VMP 235, VMP 135 VMP 145theo đường uống chuột nhắt trắng Nghiên cứu độc tính cấp xác định LD50 thuốc thử VMP 235, VMP 135 VMP 145 chuột... dùng nghiên cứu độc tính cấpvà xác định LD50 - Mẫu VMP 135, cân 10 gam thêm nước thành 35 ml vừa đủ dùng cho nghiên cứu độc tính cấp Như 35 ml chứa 10gam dược liệu dùng nghiên cứu độc tính cấpvà... 2) Kết nghiên cứu 7 p ≤ 0,05 * p ≤ 0,01 ** p ≤ 0,001 *** + ++ +++ 2.1 .Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan mẫu VMP qua trọng lượng gan, hoạt độ enzym gan số MDA gan chuột Bảng Ảnh hưởng mẫu VMP