Nghiên cứu sự xuất hiện của gen KIR2DS1, KIR2DL1ở thai phụ tiền sản giật

Tiền sản giật, đặc trưng bởi sự tăng huyết áp và protein niệu, có thể xảy ra từ tuần 20 của thai kỳ đến 6 tuần sau sinh, biểu hiện lâm sàng rất đa dạng vàthường được chẩn đoán muộn.. Tro

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tiền sản giật là một bệnh lý hệ thống nằm trong nhóm các rối loạn tănghuyết áp xảy ra trong thai kỳ, dẫn đến gia tăng bệnh suất và tử suất ở cả thaiphụ và thai nhi Dù đã có nhiều bước tiến trong tầm soát, dự phòng và điều trị,

tỉ lệ mắc tiền sản giật vẫn chiếm vào khoảng 2-8% thai kỳ và đang có xuhướng gia tăng, tạo ra gánh nặng lớn cho xã hội [1], [2]

Tiền sản giật, đặc trưng bởi sự tăng huyết áp và protein niệu, có thể xảy ra

từ tuần 20 của thai kỳ đến 6 tuần sau sinh, biểu hiện lâm sàng rất đa dạng vàthường được chẩn đoán muộn Điều này dẫn đến khó khăn trong việc theo dõiđiều trị và tiên lượng bệnh Nhu cầu cần có một công cụ chẩn đoán sớm và chínhxác tiền sản giật là bức thiết, nhằm cải thiện tiên lượng của thai kỳ [3 ], [4 ]

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bệnh sinh của tiền sản giậtnhưng bệnh nguyên chính xác vẫn còn chưa rõ ràng Hiện nay, nguyên nhângốc rễ của tiền sản giật được cho là do giảm tưới máu rau thai [5] Sự giảm mộtcách tương đối lưu lượng dòng máu chảy ở tử cung và rau thai được gây ra bởi

sự suy giảm xâm nhập của các nguyên bào nuôi dẫn đến sự tái cấu trúc khôngđầy đủ các động mạch xoắn [6] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vai trò quantrọng của tế bào dNK (decidual natural killer cell) trong hỗ trợ các nguyên bàonuôi trong quá trình xâm lấn, tái cấu trúc động mạch xoắn thông qua tương tácgiữa phân tử KIR (Killer cell immunoglobulin like receptor) của dNK và phối

tử của chúng là HLA-C (Human leukocyte antigen) trên các nguyên bào nuôicủa thai nhi KIR là một nhóm receptor trên màng tế bào dNK, gồm 2 loạivới sự khác nhau ở phần đuôi nội bào dài hay ngắn dẫn đến sự truyền đạtthông tin tăng cường hay ức chế xâm nhập nguyên bào nuôi vào màng rụnghay cơ tử cung Hiện có 16 gen KIR được tìm thấy, thứ tự sắp xếp của chúngdọc trên nhiễm sắc thể 19q13.4 Phối tử tương ứng của chúng trên nguyênbào nuôi của mẹ HLA-C gồm HLA-C1 và HLA-C2 [7 ], [8 ], [9 ]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tập trung xác định các yếu tố gen

di truyền trong tiền sản giật, đặc biệt là các gen KIR ở người mẹ và các genHLA-C ở thai nhi Người ta thấy vai trò hết sức quan trọng của tương tác

KIR/HLA-C trong điều hòa làm tổ thai nhi qua các nghiên cứu so sánh giữacác thai phụ bình thường và các thai phụ thiếu hụt xâm lấn các nguyên bàonuôi.Đã có rất nhiều nghiên cứu về mối liên hệ này, đặc biệt là 2 genKIR2DS1 và KIR2DL1 Nghiên cứu của Xiong S và cộng sự (2013) đã chothấy KIR2DS1 được biểu lộ nhiều trên các tế bào dNK, chúng kích thích mạnh

mẽ hoạt động của các tế bào này [10], thúc đẩy sự xâm nhập của các nguyên bàonuôi vào màng rụng tử cung Trong nghiên cứu của Hiby S.E và các cộng sự(2004), tác giả thấy những thai phụ thiếu hầu hết hoặc tất cả các KIR hoạt hoátrong khi thai nhi mang gen HLA-C2 thì có sự gia tăng đáng kể nguy cơ mắctiền sản giật [8] Và khi đó phân tử HLA-C2 trên nguyên bào nuôi sẽ chỉ kết hợpvới các receptor ức chế (ví dụ như KIR2DL1), dẫn đến ức chế hoạt động tế bàodNK Theo một nghiên cứu khác của cùng tác giả vào năm 2010, các rối loạntrong thời kỳ mang thai giảm một cách đáng kể ở những bà mẹ có mang genhoạt hoá KIR2DS1 [11] Từ các nghiên cứu của mình tác giả chỉ ra rằng ở cácthai kỳ mà nguyên bào nuôi biểu hiện HLA-C2 thì gen KIR quan trọng nhấtmang tính bảo vệ cho thai kỳ thành công là gen hoạt hoá KIR2DS1

Như vậy vai trò của 2 gen KIR2DS1 và KIR2DL1 trong cơ chế bệnhsinh tiền sản giậtđã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu khác nhau Tuynhiên những kết quả trước đây ở các chủng tộc và vùng địa lý khác nhau cógiống ở Việt Nam khi gen KIR có tính đa hình thái cao? Xuất phát từ thực tếhiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đánh giá sự liên quan giữa kiểugen KIR của thai phụ với khả năng mắc tiền sản giật, từ đó có thể đề ra mộtphương thức sàng lọc tiền sản giật rất sớm từ các tuần đầu thai kỳ của lầnmang thai thứ nhất hoặc dự đoán nguy cơ tiền sản giật ở các lần mang thai

tiếp theo, chúng tôi chọn tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu sự xuất hiện của gen KIR2DS1, KIR2DL1 ở thai phụ tiền sản giật” nhằm 2 mục tiêu:

1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các thai phụ tiền sản giật tại bệnh viện phụ sản Hà Nội.

2. Nghiên cứu sự xuất hiện của gen KIR2DS1, KIR2DL1 và mối liên quan của chúng với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trên.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 TIỀN SẢN GIẬT

Tiền sản giật là một bệnh lý phức tạp, xảy ra sau tuần thứ 20 của thời kỳthai nghén, gồm tăng huyết áp, protein niệu và có thể có phù cùng một sốtriệu chứng khác [3] Theo ACOG 2013, tiền sản giật là một rối loạn đa cơquan được đặt trưng bởi sự xuất hiện của tăng huyết áp và protein niệu hoặctăng huyết áp kèm theo rối loạn chức cơ quan đích có hay không protein niệu,xảy ra ở nửa sau thai kỳ [12] Tiền sản giật gây ra nhiều biến chứng nguyhiểm cho cả sản phụ và thai nhi

1.1.1 Nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh của tiền sản giật

Tiền sản giật chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của rau thai trong tử cung,thậm chí kể cả khi không đi kèm với thai nhi như trong trường hợp chửa trứng[13] Điều này xác nhận rằng tiền sản giật có nguồn gốc từ rau thai [14], [15].Sau khi sổ rau, các triệu chứng và dấu hiệu tiền sản giật của thai phụ thườngbiến mất Mặc dù nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh chính xác còn chưa rõ vànhiều tranh cãi nhưng nguyên nhân gốc rễ của tiền sản giật được cho là dogiảm tưới máu rau thai [16]

Trong quá trình làm tổ bình thường, các nguyên bào nuôi ngoài gai rau(EVT) di cư vào màng rụng và xâm nhập sâu vào tới một phần ba chiều dàylớp cơ tử cung Các nguyên bào nuôi này tập hợp lại hình thành các cấu trúcgiống như mạch máu mà các nguyên bào nuôi lót bên trong lòng ống với vaitrò như các tế bào nội mạc mạch máu Từ đó, một hệ thống giả mạch máu cókháng trở thấp được sinh ra hay còn được gọi là sự tái cấu trúc các động mạchxoắn, cho phép lưu lượng máu chảy tăng lên gấp 10 lần, cần thiết cho sự tăng

trưởng của thai nhi [17] Quá trình này đạt đỉnh ở tuần 12 và hoàn thành vàokhoảng tuần thứ 20 của thai kỳ [18].

Sự giảm một cách tương đối lưu lượng dòng máu chảy ở tử cung và rau thaiđược gây ra bởi sự suy giảm xâm nhập của các nguyên bào nuôi dẫn đến sự táicấu trúc không đầy đủ các động mạch xoắn [17], [19] là tác nhân thúc đẩy sựphát triển của tiền sản giật [20] Trên hình ảnh giải phẫu bệnh rau thai tiền sảngiật, người ta thấy hình ảnh nhồi máu rau thai, giống như do tổn thương thiếumáu cục bộ và tắc nghẽn động mạch xoắn [21] Sự xâm nhập của nguyên bàonuôi kém và chỉ giới hạn ở các động mạch xoắn ở phía nông của màng rụng hìnhthành nên mạng lưới các giả mạch có đường kính hẹp và trở kháng cao khiếncho tuần hoàn rau thai bị hạn chế, không đáp ứng đầy đủ nhu cầu trao đổi oxy vàchất dinh dưỡng cho thai nhi tăng trưởng và phát triển

Hình 1.1: Sự tái cấu trúc động mạch xoắn ở thai phụ bình thường và thai

1.1.2 Các triệu chứng của tiền sản giật

1.1.2.1 Tăng huyết áp

Tăng huyết áp là một triệu chứng chủ yếu để chẩn đoán và tiên lượngcủa tiền sản giật Việc chẩn đoán tăng huyết áp phải dựa vào cả huyết áp tâmthu và huyết áp tâm trương.

Theo “Hướng dẫn quốc gia về các dịch vụ chăm sóc sức khoẻ sinh sản”của Bộ Y tế năm 2009[25], tăng huyết áp khi:

- Khi huyết áp tâm trương trên 90 mmHg hoặc huyết áp tâm thu trên 140mmHg đối với người không biết số đo huyết áp bình thường của mình

- Khi huyết áp tâm trương tăng 15 mmHg hoặc huyết áp tâm thu tăngtrên 30 mmHg so với huyết áp trước khi có thai

Sự thiếu tưới máu thận có thể kích hoạt hệ thống renin – angiotensin gây

co mạch ngoại vi, làm cho sức cản ngoại vi tăng nên huyết áp tâm trươngtăng Sau đó, tâm thất trái phải tăng cường co bóp để thắng sức cản ngoại vi,lúc đó huyết áp tâm thu mới tăng Vì vậy, dấu hiệu tăng huyết áp tâm trươngtrong tiền sản giật là dấu hiệu báo động Tăng huyết áp là đặc trưng cơ bảncủa tiền sản giật và có liên quan tới việc phân loại tiền sản giật Trong bệnh lýtiền sản giật, huyết áp tăng lên ở nửa sau thai kỳ có nguyên nhân là co mạchchứ không phải tăng cung lượng tim, do đó, người ta cho rằng dùng huyết áptâm trương làm tiêu chuẩn của tăng huyết áp và đánh giá tình trạng thai phụtrong tiền sản giật là hợp lý, vì huyết áp tâm trương thể hiện sức cản ngoạiviso với huyết áp bình thường trước khi có thai Vì vậy, các tác giả đã khuyếncáo rằng để chẩn đoán tăng huyết áp cần phải đohuyết áp ít nhất là 2 lần vàcách nhau 4h sau khi thai phụ đã được nghỉ Kết quả thu được huyết áp tâmtrương phải ≥90mmHg [3], [26], [27] Sự thay đổi trong tiêu chuẩn chẩn đoántăng huyết áp ở người không mang thai 2017 theo hiệp hội tim mạch Hoa Kỳ

không ảnh hưởng đến tiêu chuẩn chẩn đoán tiền sản giật và các rối loạn tănghuyết áp trong thai kỳ [28].

1.1.2.2 Protein niệu

Protein niệu là dấu hiệu quan trọng thứ 2 và thường xuất hiện muộn hơntăng huyết áp.Protein niệu ≥300mg/l ở mẫu 24h hoặc ≥500mg/l ở mẫu ngẫunhiên là có giá trị chẩn đoán[26] Ngoài ra việc sử dụng tỉ lệ protein/creatinine≥0.3 hoặc que thử nước tiểu 1+ (khi không có sẵn các phương phápđịnh lượng ở trên) cũng có giá trị trong chẩn đoán [12]

Hầu hết bệnh nhân xuất hiện dấu hiệu cao huyết áp và protein niệu là sau

34 tuần tuổi thai(tiền sản giật khởi phát muộn), đôi khi trong chuyển dạ [29],[30] Xấp xỉ 10% số bệnh nhân khởi phát tiền sản giật sớm trước 34 tuần tuổithai và hiếm khi vào tuần thai 20 đến 22 tuần [29] Khoảng 5% số bệnh nhân

là khởi phát các triệu chứng trong giai đoạn hậu sản (tiền sản giật hậu sản),thường là trong 48h sau đẻ [31], [32], [33]

1.1.2.4 Lượng Protein huyết tương

Studd và cộng sự thấy rằng nồng độ protein toàn phần và albumin huyếtthanh bị giảm xuống trong thai nghén bình thường Do tổng lượng albuminkhông đổi nên điều này có thể do sự pha loãng máu Ở bệnh lý tiền sản giật,nồng độ albumin hạ thấp hơn và lượng protein toàn phần giảm nhiều so vớingười có thai bình thường, trong khi tỉ lệ albumin/globulin là không thay đổi.

Sự tổng hợp albumin tăng lên có thể do thiếu sản phẩm estrogen của phôi thaihay đơn thuần do sự đáp ứng với tình trạng hạ albumin ở thai phụ tiền sảngiật Tình trạng giảm albumin được cho là kết quả của tình trạng protein niệu

và tăng dị hóa albumin [34]

Nghiên cứu của Phan Trường Duyệt và cộng sự cho thấy trong tiền sảngiật lượng protein niệu càng cao thì lượng protein máu càng thấp và làm giảm

áp lực keo trong lòng mạch do đó làm tăng mức độ phù [35]

1.1.2.5 Ure và acid uric

Trong thai nghén bình thường, sự thanh thải ure toàn phần được tăng lên,

do đó, nồng độ ure trong máu giảm xuống Trong tiền sản giật, độ thanh thảiure giảm và thể tích nước tiểu giảm xuống đã dẫn đến nồng độ ure và aciduric tăng cao trong máu [36]

Nồng độ acid uric trong máu tăng cao thường xuất hiện trước dấu hiệutăng huyết áp và protein niệu Có nhiều nguyên nhân giải thích cho điều này,bao gồm bất thường chức năng thận, tăng cường hủy hoại mô, toan hóa máu

và sự tăng hoạt động của enzym xanthine oxidase/dehydrogenase Tuy vậy giảthuyết được nhiều người chấp nhận là tổn thương chức năng thận Lượng aciduric trong máu tăng cao phản ánh thiếu máu thận, lưu lượng máu qua thận bịgiảm xuống, áp lực máu qua cầu thận giảm làm giảm chức năng bài tiết cácsản phẩm chuyển hóa của protein (ure và acid uric) Do đó, các sản phẩm nàytăng trong máu nên ở giai đoạn có biến chứng, bệnh nhân sẽ bị nhiễm toanmáu và là nguyên nhân gây ra đẻ non, thai kém phát triển hoặc chết lưu trong

tử cung Gần đây người ta cho rằng acid uric tăng cao trong máu không chỉ làdấu hiệu đánh giá sự trầm trọng của bệnh mà còn đóng vai trò trong sinh lýbệnh của tiền sản giật [37].

1.1.2.6 Các triệu chứng khác

Tình trạng thiếu máu: Mệt mỏi, da xanh, niêm mạc nhợt Giảm thể tíchtuần hoàn do giảm áp lực keo trong lòng mạch, nếu có xuất huyết có thể tăngnguy cơ sốc Biểu hiện giảm thể tích tuần hoàn là tăng hematocrit

Phổi: Đôi khi có hội chứng ba giảm do có dịch màng phổi, phù phổitrong tiền sản giật nặng có thể xảy ra do giảm áp lực keo trong lòng mạch,tăng thấm mao mạch phổi, suy tim trái, quá tải dịch truyền hoặc kết hợp cácyếu tố này

Bụng: Có thể có cổ trướng tự do Đau thượng vị khi xuất hiện là triệuchứng nặng có thể đe dọa tính mạng

Triệu chứng thần kinh: Tăng phản xạ thần kinh, tăng kích thích Đau đầuhay nhìn mờ khi xuất hiện cũng là một triệu chứng của tiền sản giật nặng, thểhiện sự co thắt mạch

Thiểu niệu: Là triệu chứng nặng khi lượng nước tiểu <400ml/24h, thểhiện tình trạng cô đặc máu hay giảm tưới máu thận Tình trạng này kéo dài cóthể là một dấu hiệu của hoại tử ống thận cấp, có thể dẫn tới suy thận cấp Tuynhiên theo khuyến cáo gần đây, nếu thiểu niệu kèm protein niệu mà không cótăng creatinine hoặc các dấu hiệu nghiêm trọng khác thì có thể không phải làdấu hiệu nghiêm trọng của tiền sản giật [4], [12], [38]

1.1.2.7 Hội chứng HELLP

Hội chứng HELLP là một biến chứng nghiêm trọng trong sản khoa đặctrưng bởi tan máu (H: hemolysis), tăng men gan (EL: elevated liver enzymelevels) và giảm tiểu cầu (LP: low platelet levels) xảy ra khoảng 0,5- 0,9% ở tất

cả các thai phụ và 10-20% các trường hợp tiền sản giật nặng [39] Weinstein lầnđầu tiên mô tả hội chứng này năm 1982, coi các dấu hiệu và triệu chứng là độclập với tiền sản giật Hiện nay nó được coi là một thể khác hay một biến chứngcủa tiền sản giật Tuy vậy có đến 15%-20% sản phụ có hội chứng HELLP màkhông hề có tăng huyết áp hay protein niệu dẫn đến những quan điểm khác chorằng HELLP là một rối loạn hoàn toàn độc lập với tiền sản giật [40].

Bệnh nguyên của hội chứng này còn chưa rõ ràng Nếu là một thể củatiền sản giật nặng, nó bắt nguồn từ những bất thường cửa sự phát triển vàchức năng của bánh rau Còn nếu là một rối loạn độc lập, nó có thể bắt nguồn

từ bất thường bám dính và xâm nhập của bánh rau, giống như tiền sản giật,nhưng với sự hoạt hóa hệ thống đông máu và phản ứng viêm tế bào gan mạnhhơn [41] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra bệnh nguyên của HELLP có thể là rốiloạn hệ thống viêm, cụ thể là hệ thống bổ thể [42]

70% các trường hợp HELLP xảy ra trước chuyển dạ, đa phần từ 27 đến

37 tuần tuổi thai Các trường hợp còn lại thường xảy ra trong vòng 48h sauchuyển dạ Thường thì bệnh nhân hội chứng HELLP đã được theo dõi trước

đó với tình trạng tăng huyết áp do thai nghén, hoặc đã được nghi ngờ có thểdiễn biến đến tiền sản giật (tăng huyết áp và protein niệu) Các triệu chứnglâm sàng điển hình bao gồm đau hạ sườn phải hay đau thượng vị, nôn và buồnnôn, 30-60% đau đầu, 20% có dấu hiệu về thị giác Bệnh nhân có thể mệt mỏinhiều ngày trước khởi phát bệnh Tuy nhiên nhiều trường hợp các dấu hiệukhông điển hình hoặc chỉ biểu hiện tiền sản giật nhẹ, đặc biệt trong trườnghợp hội chứng HELLP không đầy đủ Vì vậy các xét nghiệm lâm sàng khi códấu hiệu nghi ngờ luôn phải đặt ra

Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán HELLP [ 39 ]

Phân độ Phân loại Tennessee Phân loại Mississippi

1 Tiểu cầu≤100G/l

AST≥70UI/L

Tiểu cầu≤50G/lAST≥70UI/L

LDH≥ 600UI/L LDH≥ 600UI/L2

50G/l ≤Tiểu cầu≤100G/lAST≥70UI/L

LDH≥ 600UI/L

3

100G/l ≤ Tiểu cầu ≤150G/lAST≥40UI/L

LDH≥ 600UI/LTùy thuộc vào sự đầy đủ cả 3 tiêu chuẩn hay chỉ có 1 hoặc 2 tiêu chuẩn

mà người ta phân ra hội chứng HELLP đầy đủ hay không đầy đủ

1.1.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán, phân loại tiền sản giật

1.1.3.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán

Theo hướng dẫn quốc gia về các dịch vụ chăm sóc sức khỏe sinh sản, thainghén gây tăng huyết áp có thể gặp:

- Tăng huyết áp không kèm theo protein niệu hoặc phù

Bảng 1.2: Tiêu chuẩn chẩn đoán theo ACOG [ 12 ]

Huyết áp tâm thu ≥ 140mmHg hoặc huyết áp tâm trương ≥ 90mmHg trong 2lần đo cách nhau ít nhất 4h sau 20 tuần thai ở người có huyết áp bình thườngtrước đó kèm theo ít nhất 1 trong các triệu chứng sau:

 Protein niệu ≥ 0.3 mg/24h hoặc tỉ lệ protein/creatinin ≥ 0.3(mg/mg)

hoặc Dipstick 1+ khi không sẵn phương pháp định lượng

 Triệu chứng thần kinh hoặc thị giác

1.1.3.2 Phân loại tiền sản giật

Theo hướng dẫn quốc gia về các dịch vụ chăm sóc sức khỏe sinh sản,tiền sản giật được phân loại như sau:

Bảng 1.3: Phân loại tiền sản giật [ 25 ] Triệu chứng Tiền sản giật nhẹ Tiền sản giật nặng

Rối loại thị giác: mờ mắt, nhìn đôi Không Có

Xét nghiệm hóa sinh Bình thường Ure, SGOT, SGPT,

acid uric, bilirubin

là các chất tăng cao trong máu, trong khitiểu cầu và protein huyết thanh toàn phần giảm

Theo ACOG 2013, các triệu chứng thiểu niệu không kèm thay đổi cácchỉ số hóa sinh, thai chậm phát triển trong tử cung cùng số lượng protein niệukhông còn được sử dụng trong phân loại tiền sản giật nặng [12].

1.1.4 Dự báo sớm và dự phòng tiền sản giật

Tiền sản giật không thể được tiên đoán một cách đáng tin cậy vì không

có một công cụ nào hiện thời có thể phân biệt chính xác thai kỳ có thể diễntiến thành tiền sản giật hay không [43], [44] Vì lý do này, các nhà lâm sàngtập trung vào việc phát hiện sớm các dấu hiệu của bệnh ở các thai phụ trongmỗi lần đến khám thai Việc chẩn đoán sớm có thể cải thiện tiên lượng của mẹ

và con, thêm vào đó các sản phụ nguy cơ cao có thể dự phòng aspirin liềuthấp từ cuối quý 1 thai kỳ, làm giảm khả năng diễn tiến thành tiền sản giật.Các biện pháp được đề xuất gồm có:

Đo huyết áp trong mỗi lần đến khám thai [45]

Phát hiện thai phụ nguy cơ cao: thai kỳ trước bị tiền sản giật, đặc biệtkhởi phát sớm với hậu quả nặng nề; song thai; tăng huyết áp mạn tính; bệnhthận; các bệnh tự miễn (hội chứng kháng antiphospholipid, lupus ban đỏ hệthống) Các yếu tố nguy cơ trung bình gồm có: con so; béo phì(BMI>30kg/m2); tiền sử gia đình có mẹ hoặc chị em bị tiền sản giật; ≥35tuổi; đặc điểm nhân chủng học; tiền sử bản thân khác(sinh con nhẹ cân, lầnsinh trước trên 10 năm) [46]

Các chỉ dấu sinh học: chủ yếu dựa vào yếu tố bệnh sinh của tiền sảngiật được cho là mất cân bằng giữa yếu tố tân tạo mạch (VEGF, PLGF) vàkháng tân tạo mạch (sEng, sFlt-1) Trong các chỉ số này, tỉ lệ sFlt-1/PLGFđược coi là chính xác nhất trong dự báo tiến triển thành tiền sản giật, tuynhiên hạn chế của các chỉ dấu sinh học này là thường chỉ có giá trị dự đoáncao ở nửa sau của thai kỳ [47], [48]

Doppler động mạch tử cung: Kháng trở của động mạch tử cung giảmdần trong thai kỳ Trong tiền sản giật, sự tăng kháng trở có thể là dấu hiệusớm phản ánh sự bất thường trong xâm nhập của các tế bào nuôi, làm khiếmkhuyết tái cấu trúc động mạch xoắn tử cung và chuyển dạng chúng thành cácđộng mạch với kháng trở thấp Mặc dù các nghiên cứu lớn đều chỉ ra dopplerđộng mạch tử cung có thể dự đoán sản phụ có nguy cơ cao mắc tiền sản giật[49], các chuyên gia không khuyến cáo sử dụng phương pháp này sàng lọcthai kỳ sớm vì tỉ lệ dương tính giả rất cao [50], có thể làm tăng lo lắng cũngnhư chi phí điều trị của bệnh nhân

Mô hình dự báo nguy cơ: kết hợp yếu tố nguy cơ của mẹ, doppler độngmạch tử cung và các chỉ dấu sinh học tỏ ra có hiệu quả trong việc dự báo sớmnguy cơ tiền sản giật trong giai đoạn sớm thai kỳ so với từng chỉ dấu riêng lẻ(82% so với 41% trong một nghiên cứu [51]) Những mô hình dự báo có thểgiúp đỡ các nhà lâm sàng trong việc hướng dẫn bệnh nhân nguy cơ cao thayđổi lối sống, phát hiện và theo dõi các triệu chứng cũng như dự phòng sớmbằng aspirin liều thấp

Cho đến này, các nghiên cứu lớn chỉ mới đưa ra được biện pháp dựphòng có ý nghĩa duy nhất trong tiền sản giật là aspirin liều thấp [52], [53].Theo khuyến cáo của ACOG hay USPSTF, aspirin được khuyến cáo dùng vớiliều 81mg vào buổi tối từ tuần thứ 12 đến 28 của thai kỳ, tối ưu là trước 16tuần [54], [46] Nhiều tác giả khuyến cáo có thể sử dụng đến 36 tuần haytrước ngày dự sinh 5 đến 10 ngày Việc dùng các chất chống oxy hóa hay bổsung calci còn tranh cãi và chưa được chứng minh có hiệu quả

1.2 TẾ BÀO NK VÀ RECEPTOR KIR

1.2.1 Tế bào NK và vai trò trong mang thai

Tế bào NK là một thành phần quan trọng của hệ thống miễn dịch bẩmsinh, chúng tham gia vào các đáp ứng giai đoạn sớm chống lại các tế bào bị

nhiễm virus hay các tế bào chuyển dạng ác tính bằng cách sản xuất ra cáccytokin và trực tiếp gây độc ly giải tế bào đích.

Trong giai đoạn đầu của thai kỳ, các tế nào NK là quần thể tế bào bạchcầu phong phú nhất trong màng rụng Chúng chiếm khoảng 70% trong tổng

số bạch cầu ở màng rụng trong quý đầu của thai kỳ [55], [56], và tồn tại suốttrong quá trình mang thai [57], chúng được gọi là các tế bào dNK (tế bào NKmàng rụng) Mặc dù mang tên là tế bào tự nhiên nhưng các tế bào dNK khôngtham gia tiêu diệt hay loại bỏ tế bào dị gen của thai nhi hay rau thai mà có vaitrò quan trọng trong tái cấu trúc động mạch xoắn tử cung, vốn được hìnhthành do sự xâm nhập của các nguyên bào nuôi ngoài gai rau (EVT) vàomàng rụng tử cung Nhiều nghiên cứu đã chứng minh điều này là kết quả của sựtương tác của receptor KIR (một dấu ấn độc quyền trên tế bào dNK [58]) và phối

tử tương ứng của chúng, phân tử HLA-C trên nguyên bào nuôi thai nhi [7], [8]

Từ sự tương tác KIR/HLA-C, các tế bào dNK điều hoà sự tăng sinh mạch máu

và sự xâm lấn của các nguyên bào nuôi vào màng rụng và cơ tử cung thông quagiải phóng các cytokine, chemokine và các yếu tố tiền sinh mạch như yếu tố tăngnội mạc mạch máu (VEGF) và yếu tố tăng trưởng rau thai (PLGF) [57], [59]

1.2.2 Receptor KIR của tế bào NK

Killer cell immunoglobulin like receptor (KIRs, còn được biết đến làCD158) là thành viên của một nhóm các phân tử điều hoà được tìm thấy trênmột số dưới nhóm dòng tế bào lympho Gia đình receptor KIR là một trongnhững nhóm receptor quan trọng nhất biểu hiện trên tế bào NK, và HLA lớp I

là các phối tử hàng đầu của chúng, biểu hiện trên bề mặt gần như tất cả mọi tếbào có nhân

Locus KIR bao gồm một gia đình các gen có tính đa hình thái và đồngnhất cao nằm trên 19q13.4 Các gen KIR nằm nối tiếp nhau trên một đoạnnhiễm sắc thể dài khoảng 150kb [9] Chúng được đặt tên dựa trên cấu trúc

protein mà chúng mã hoá, theo 2 đặc tính: số lượng domain Ig ngoại bào (2Dhay 3D) và đặc điểm phần đuôi nội bào (L: dài, hay S: ngắn) (theo bảng danhpháp HUGO- Human Genome Organization) Các KIR với phần nội bào

“dài” (L-long), được gọi là KIR ức chế, khi phối hợp với phối tử sẽ có tácdụng ức chế hoạt động của NK dựa vào ITIMs (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) ở phần nội bào truyền đạt tín hiệu ức chế vào trong tếbào Ngược lại, các KIR có phần nội bào “ngắn”(S-short), được gọi là KIRhoạt hoá, sẽ hoạt hoá hoạt động của NK dựa vào ITAMs (immunoreceptortyrosine-based activation motif) ở phần nội bào truyền đạt tín hiệu kích thíchvào trong tế bào [60]

Hình 1.2: Cấu trúc các phân tử KIR trên bề mặt tế bào NK [ 61 ]

Sự kết hợp các gen KIR dọc theo nhiễm sắc thể xác định 2 haplotypekhác nhau là A và B Mặc dù các halotype có sự thay đổi số lượng và loại genhiện diện, nhưng các gen KIR2DL4, -3DP1, -3DL2 và -3DL3 luôn xuất hiệntrong tất cả các haplotype Do đó chúng hình thành nên khung của locus, cácgen còn lại sẽ hiện diện trong 1 loại haplotype nhất định [62] Haplotype Athường có 7 gen KIR tất cả đều mã hóa các thụ thể ức chế (KIR2DL1, 2DL3,

2DL4, 3DL1, 3DL2, 3DL3) với chỉ 1 thụ thể hoạt hóa duy nhất KIR2DS4 Dovậy hầu hết phụ nữ với KIR AA không hoạt hóa được dNK Ngược lạihaplotype B chứa số lượng các locus KIR khác nhau hầu hết mã hóa các thụthể hoạt hóa (KIR2DS1, -DS2, -DS3, -DS5, và KIR3DS1).

Hình 1.3: Trình tự các gen KIR trên các halotype KIR [ 11 ]

1.2.2.1 KIR2DL1

KIR2DL1 nằm ở băng 13.4 nhánh dài NST 19, bao gồm 11 exon, dài

15119 bp, bắt đầu từ vị trí 54769208 bp và kết thúc ở 54784326 bp Cho đếnnay có 43 alen được mô tả, mã hoá cho 25 protein Một haplotype KIR A điểnhình được đặc trưng bằng sự hiện diện của KIR2DL1, vì thế những cá nhân

có kiểu gen KIR AA thì sẽ có hai bản sao của gen này Tuy nhiên, một sốhaplotype B cũng có KIR2DL1, nên KIR AB hoặc KIR BB có thể cũng có 2bản sao của KIR2DL1 [63] Phối tử của gen này là nhóm HLA-C2 [64]

1.2.2.2 KIR2DS1

KIR2DS1 nằm trên băng 13.4 nhánh dài NST 19, bao gồm 8 exon, dài

14015 bp, bắt đầu từ vị trí 479358 bp và kết thúc ở 493372 bp Không giống

như KIR2DL1 hiện diện ở 72-100% cá thể trên toàn thế giới, tỉ lệ người mangKIR2DS1 thấp hơn, phân bố từ 13-63%, nhưng chủ yếu nằm giữa 33% và49% đối với hầu hết các quần thể [65] Ái lực của KIR2DS1 với HLA-C2thấp hơn KIR2DL1 (khoảng 50%) do acid amin ở vị trí 70 là Threonine đượcthay thế bằng Lysine [62], [63] Khi một tế bào dNK biểu hiện cả KIR2DL1

và KIR2DS1 thì tín hiệu ức chế sẽ chiếm ưu thế [66] Phối tử của gen này lànhóm HLA-C2 [64]

1.3 MỐI LIÊN QUAN GIỮA KIR2DS1, KIR2DL1, HLA-C VÀ TIỀN SẢN GIẬT

1.3.1 HLA-C

HLA (Human leukocyte antigen) lớp I bao gồm 6 nhóm gen B,-C, -E, -F và HLA-G), tất cả chúng được biểu lộ trong mọi haplotypeHLA.Phân tử HLA-C, cũng giống như các phân tử HLA lớp I khác, là mộtphân tử cấu tạo từ 3 thành phần không đồng nhất, bao gồm một glycoprotein45kD, một chuỗi β2m 12 kD hằng định và một cầu nối peptid Dựa trên sựtương tác với các KIRs, HLA-C được chia thành hai nhóm HLA-C1 và HLA-C2 Về cấu trúc phân tử chúng khác nhau ở vị trí acid amin 77 và 80 ở vùngα1 trong chuỗi nặng HLA-C Nhóm HLA-C1 có Serin (Ser) ở vị trí 77 vàAsparagine (Asn) ở vị trí 80, là phối tử của KIR2DL2/3 và KIR2DS2 NhómHLA-C2 có Asn ở vị trí 77 và Lysin (Lys) ở vị trí 80), là phối tử củaKIR2DL1 và KIR2DS1 [64], [67]

(HLA-A,-1.3.2 Mối liên quan giữa các gen trên và tiền sản giật

Nhiều nghiên cứu cho thấy khi có sự kết hợp giữa HLA-C và KIR AAlàm tăng nguy cơ bị bệnh do KIR AA thiếu hầu hết các gen hoạt hóa trừKIR2DS4, do vậy thiếu dNK hoạt hóa làm giảm khả năng hỗ trợ cho việcxâm lấn nguyên bào nuôi và sửa đổi mạch máu từ đó góp phần gây ra tiền sảngiật Gen luôn có mặt trên kiểu gen KIR AA có khả năng gây ra nguy cơ này

là KIR2DL1, mã hóa cho một protein KIR ức chế đặc hiệu cao với HLA-C2.

Do đó, ở phụ nữ có kiểu gen KIR AA chứa hai bản sao của KIR2DL1, tế bàouNK sẽ bị ức chế rất mạnh khi kết hợp với nguyên bào nuôi biểu lộ HLA - Cmang C2 Ngược lại KIR Bx đa dạng và thường bao gồm nhiều hơn một KIRhoạt hóa, khi kết hợp với phối tử HLA-C của chúng hoạt hóa nhiều dNK cótác dụng bảo vệ [68], [69], [70], [71], [72] dNK hoạt hóa sản xuất nhiềucytokin tham gia điều hòa xâm lấn nguyên bào nuôi bao gồm yếu tố kíchthích dòng bạch cầu hạt (G-CSF), dòng bạch cầu hạt – đại thực bào (GM-CSF), đại thực bào (M-CSF), yếu tố ức chế bạch cầu (LIF), TNF-α (yếu tốhoại tử u – α) và IFN-γ [73] Tương tác của HLA-C2 với KIR được xem xét làmạnh hơn HLA-C1 nên sự phối hợp của HLA-C2 thai với KIR BB thai là tốtnhất cho việc thúc đẩy quá trình hình thành rau thai đầy đủ và tránh tiền sảngiật Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra khi nguyên bào nuôi biểu hiện HLA-C2 thìgen hoạt hóa có vai trò quan trọng nhất bảo vệ thai kỳ là KIR2DS1 [11] Tần

số gen KIR2DS1 cũng giảm và kiểu gen KIR AA tăng ở nhóm tiền sản giật sovới nhóm chứng [74] Tương tự KIR AA mẹ tương tác với HLA-C2 thai lànhạy cảm nhất với tiền sản giật Khi HLA-C1 liên kết với thụ thể KIR2DL2 và2DL3 các tín hiệu ức chế được sản xuất cho dNK nhẹ hơn do vậy sự xâm lấn củanguyên bào nuôi hầu như không ảnh hưởng Ngược lại, khi HLA-C2 liên kết vớithụ thể KIR2DL1 các tín hiệu ức chế sinh ra cho dNK mạnh hơn, ảnh hưởng đến

sự xâm lấn nguyên bào nuôi làm nó diễn ra với nhiều thiếu sót, đây được coi làmột trong những căn nguyên của tiền sản giật [75]

1.4 KỸ THUẬT PCR TRONG XÁC ĐỊNH GEN

1.4.1 Kỹ thuật PCR

PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật được sử dụng trongsinh học phân tử để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNAtrong ống nghiệm qua các chu kỳ nhiệt để sản sinh ra hàng ngàn đến hàng

triệu bản sao DNA có trình tự xác định Về nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt baogồm 3 giai đoạn:

Hình 1.4: Quy trình PCR [ 76 ]

Giai đoạn biến tính (denaturation) nhiệt độ được đưa lên 94-960 C trong

30 giây đến 1 phút để phá vỡ liên kết hydro, DNA đích tháo xoắn tách thànhhai sợi đơn

Giai đoạn bắt cặp (annealing) nhiệt độ hạ xuống 55-650 C trong 30 giâyđến 1 phút để các primer lai bắt cặp bổ sung vào đầu đoạn DNA đích

Giai đoạn kéo dài (elongation) nhiệt độ được đưa lên 720 C là nhiệt độthích hợp cho hoạt tính Taq polymerase lắp ghép các dNTP lại đầu 3’ củaprimer, tổng hợp DNA bổ sung với DNA đích theo chiểu 5’-3’ Giai đoạn nàydài hay ngắn tuỳ thuộc vào kích thước đoạn DNA cần khuếch đại

Sau mỗi chu kỳ, số lượng DNA đích được nhân lên gấp đôi, và sau

30-40 chu kỳ thì từ một DNA đích ta thu được 230-240 bản sao

1.4.2 Kỹ thuật multiplex-PCR

Multiplex PCR (multiplex polymerase chain reaction), còn gọi là PCR

đa mồi, là kỹ thuật sử dụng PCR để khuếch đại đồng thời nhiều trình tự DNA

khác nhau (giống như thực hiện các phản ứng PCR riêng biệt trong cùng mộtphản ứng) Phản ứng này sử dụng nhiều cặp mồi (primer) để thực hiện khuếchđại các đoạn DNA đích trong các chu kỳ nhiệt như PCR thông thường

Việc thiết kế primer cho multiplex PCR là rất quan trọng, quyết định

sự thành công của phản ứng Các cặp primer được thiết kế tối ưu để có cùngnhiệt độ bắt cặp lên DNA đích, đồng thời các các mồi này cũng không đượcbắt cặp với nhau, và quan trọng nhất là độ nhạy phát hiện từng đoạn DNAđích không bị giảm mà vẫn tương đương độ nhạy của PCR đơn mồi Cácprimer phải có chiều dài thích hợp, thông thường 18-22 cặp base Chúngphải có nhiệt độ nóng chảy tương tự nhau, thường nằm trong khoảng 55-600

C, sự chênh lệch chung khoảng 3-50 C là có thể chấp nhận được Đối với cácprimer có tỉ lệ thành phần GC cao thì nhiệt độ nóng chảy sẽ cao hơn, thíchhợp nhất là trong khoảng 75-800 C Đặc biệt các primer này phải được thiết

kế đặc hiệu cao với trình tự DNA đích do có thể sẽ có sự cạnh tranh ghépcặp với trình tự DNA đích giữa các primer Đồng thời các primer cũng phảiđược thiết kế để tránh bắt cặp nhau tạo thành các dimer, sẽ dẫn đến sựkhuếch đại không đặc hiệu

Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm khuếch đại có thể được điện di đểxác định sự hiện diện các gen đích Do các gen đích có trình tự và độ dài khácnhau nên sản phẩm khuếch đại của các gen này sẽ di chuyển với tốc độ khácnhau trong điện trường và hình thành các vạch tương ứng, đặc trưng cho từnggen Từ hình ảnh các vạch trên kết quả điện di sẽ chỉ ra có sự hiện diện haykhông của các gen đích trên mẫu nghiên cứu

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.5.1 Nghiên cứu trong nước

Hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về tiền sản giật được tiếnhành Các nghiên cứu này ở nước ta chủ yếu tập trung vào đánh giá các đặc

điểm lâm sàng, cận lâm sàng, điều trị, tiên lượng sự ảnh hưởng đến sức khoẻcủa thai phụ và thai nhi Gần đây, đã có một số nghiên cứu sâu hơn về tiền sảngiật theo hướng đi sâu vào nghiên cứu những biến đổi về phân tử, proteintrong tiền sản giật để phục vụ chẩn đoán sớm, điều trị và tiên lượng bệnh.

Năm 2011, Nguyễn Chính Nghĩa và cộng sự tiến hành nghiên cứunồng độ yếu tố tân mạch máu (PLGF) và yếu tố kháng tân tạo mạch máu(sFlt-1) trong huyết thanh thai phụ có nguy cơ tiền sản giật [77]

Năm 2012, Trương Minh Phương và Nguyễn Duy Ánh tiến hành địnhlượng nồng độ PLGF cho những thai phụ có nguy cơ tiền sản giật ở tuổi thai12-14 tuần [78]

Năm 2013, Nguyễn Chính Nghĩa và cộng sự nghiên cứu yếu tố pháttriển rau thai (PlGF) và thụ thể yếu tố phát triển tế bào nội mạc hoà tan (sFlt-1) trong huyết thanh ở thai phụ bình thường và thai phụ có nguy cơ tiền sảngiật [79]

Năm 2014, Phạm Phương Hạnh thực hiện nghiên cứu hoạt độ Lactatdehydrogenase trong huyết thanh thai phụ tiền sản giật tại Bệnh viện Phụ Sản

Hà Nội [80]

Năm 2015, Nguyễn Duy Ánh, Nguyễn Thanh Thuý và cộng sự đã bướcđầu xây dựng đường chuẩn và sử dụng trong kỹ thuật real time PCR để địnhlượng DNA phôi thai trong huyết tương thai phụ tiền sản giật [81] Cùng năm,nhóm tác giả cũng tiến hành nghiên cứu kết hợp siêu âm và DNA phôi thaitrong máu mẹ để dự báo sớm tiền sản giật

1.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tập trung xác định các yếu tố gen

di truyền trong tiền sản giật, đặc biệt là các gen KIR ở thai phụ và các genHLA-C ở thai nhi

Nghiên cứu của Xiong S và cộng sự (2013) đã cho thấy KIR2DS1được biểu lộ nhiều trên các tế bào dNK, chúng kích thích mạnh mẽ hoạt độngcủa các tế bào này [10] Hoạt hoá của KIR2DS1 bởi HLA-C2 đã kích thíchsản sinh ra các chất hoà tan, trong đó có GM-CSF Tiếp đó, GM-CSF tăngcường khả năng xâm nhập của các nguyên bào nuôi vào màng rụng tử cung.Phát hiện này đã cung cấp cơ chế phân tử để giải thích cho sự tương tác giữaKIR người mẹ với HLA-C thai nhi đã hỗ trợ thế nào cho quá trình làm tổ,điều kiện tiên quyết cho sự phát triển thai nhi và thai kỳ thành công.

Trong nghiên cứu của Hiby S.E và các cộng sự vào năm 2004, tác giảthấy những thai phụ thiếu hầu hết hoặc tất cả các KIR hoạt hoá (kiểu gen AA)trong khi thai nhi mang gen HLA-C2 thì có sự gia tăng đáng kể nguy cơ mắctiền sản giật với p<0,001 [8] Và khi đó phân tử HLA-C2 trên nguyên bàonuôi sẽ chỉ kết hợp với receptor ức chế KIR2DL1, dẫn đến sản sinh quá nhiềutín hiệu ức chế hoạt động tế bào dNK và làm suy giảm sự xâm nhập cácnguyên bào nuôi vào động mạch tử cung Theo một nghiên cứu khác của cùngtác giả vào năm 2010, các rối loạn trong thời kỳ mang thai giảm một cáchđáng kể ở những bà mẹ có haplotype B mang gen hoạt hoá KIR2DS1 [11] Từcác nghiên cứu của mình tác giả chỉ ra rằng ở các thai kỳ mà nguyên bào nuôibiểu hiện HLA-C2 thì gen KIR quan trọng nhất mang tính bảo vệ cho thai kỳthành công là gen nằm ở vùng telomer B của haplotype B, cũng chính là vùngchứa gen hoạt hoá KIR2DS1

Khi nghiên cứu trên đối tượng người Hán Trung Quốc, tác giả Hong Yu

và cộng sự (2014) nhận thấy tần số gen KIR2DS1 giảm (p=0,028) và kiểu genKIR AA tăng (p=0,017) ở các bệnh nhân tiền sản giật so với nhóm chứng[74] Còn trong nghiên cứu của Long W và cộng sự (2015), nghiên cứu bệnhchứng trên 271 thai phụ tiền sản giật và 295 thai phụ bình thường cũng ởngười Hán Trung Quốc cho thấy có sự giảm số lượng riêng lẻ của các các

genvKIR hoạt hoá (2DS2, 2DS3 và 2DS5) ở các thai phụ tiền sản giật Hơnnữa, tần số của tổng số gen KIR hoạt hoá cũng giảm một cách rõ rệt ở cácbệnh nhân so với nhóm chứng (p=0,03) Và gen KIR2DL1 cũng tăng tần số ởcác thai phụ tiền sản giật có thai nhi mang kiểu gen đồng hợp HLA-C2 [70].Cùng năm 2015, Annettee Nakimuli và cộng sự tiến hành nghiên cứutrên đối tượng các thai phụ người Châu Phi vùng cận Sahara cho thấy vùngCentromer của KIR B hiện diện ở người châu Phi nhưng không hiện diện ởngười châu Âu có vai trò bảo vệ phụ nữ mang thai khỏi tiền sản giật [82].

Có rất nhiều nghiên cứu đã được thực trên thế giới, tuy nhiên, có lẽ dotính đa hình thái của các gen KIR và HLA mà kết quả của các nghiên cứu có

sự khác biệt vai trò từng gen trong tiền sản giật giữa các chủng tộc Trongkhi đó tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về mối liên quan giữa kiểu genKIR của thai phụ và tiền sản giật Điều đó thúc đẩy chúng tôi thực hiệnnghiên cứu này

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là các thai phụ được khám và quản lý thai tạiBệnh viện Phụ sản Hà Nội trong thời gian từ tháng 03 năm 2017 đến tháng 07năm 2018; bao gồm 2 nhóm sau:

1 Nhóm thai phụ bình thường

2 Nhóm thai phụ mắc tiền sản giật

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu

2.1.1.1 Nhóm thai phụ bình thường

Nhóm thai phụ bình thường, không có các triệu chứng của tiền sản giật,được lựa chọn theo tiêu chuẩn sau:

• Thai phụ mang thai đơn, khoẻ mạnh

• Đồng ý, tự nguyện tham gia nghiên cứu Có thể theo dõi thai phụđến khi sinh con để biết tình trạng của con

2.1.1.2 Nhóm thai phụ mắc tiền sản giật

Nhóm thai phụ này được chẩn đoán tiền sản giật khi có cả triệu chứngtăng huyết áp và protein niệu

Theo “Hướng dẫn quốc gia về các dịch vụ chăm sóc sức khoẻ sinh sản”của Bộ Y tế năm 2009 [25], tăng huyết áp khi:

- Khi huyết áp tâm trương trên 90 mmHg hoặc huyết áp tâm thu trên 140mmHg đối với người không biết số đo huyết áp bình thường của mình

- Khi huyết áp tâm trương tăng 15 mmHg hoặc huyết áp tâm thu tăngtrên 30 mmHg so với huyết áp trước khi có thai

Protein niệu ≥500mg/l ở mẫu ngẫu nhiên là có giá trị chẩn đoán [26].

Ngoài ra:

• Có thể theo dõi thai phụ cho đến khi sinh con để biết tình trạng của con

• Đồng ý, tự nguyện tham gia nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

Những thai phụ có tình trạng bệnh lý sau không được chọn làm đốitượng nghiên cứu:

• Đa thai, thai dị dạng

• Thai phụ có các bệnh lý đi kèm: bệnh tim, bệnh thận, bệnh tănghuyết áp, đái tháo đường, Basedow, bệnh gan

• Thai phụ không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2 CỠ MẪU NGHIÊN CỨU

• Với nhóm thai phụ bình thường, chúng tôi sử dụng cỡ mẫu là 100thai phụ bình thường

• Với nhóm thai phụ tiền sản giật, chúng tôi lấy cỡ mẫu thuận tiện với

số lượng là 81 thai phụ tiền sản giật

2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.3.1 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 03 năm 2017 đến tháng 7 năm 2018

2.3.2 Địa điểm nghiên cứu

• Chọn đối tượng nghiên cứu và lấy mẫu máu được thực hiện tại Bệnhviện Phụ sản Hà Nội

Thu thập mẫu máu Tách DNA và đo độ tinh

sạch OD

Tách DNA và đo độ tinh sạch OD

Xác định sự có mặt gen KIR2DS1 và KIR2DL1 bằng phương pháp PCR

Xác định sự có mặt gen KIR2DS1 và KIR2DL1 bằng phương pháp PCR

Đánh giá kết quả

• Xác định sự có mặt của gen KIR2DS1 và KIR2DL1 bằng kỹ thuậtPCR được thực hiện tại Labo bộ môn Sinh lý bệnh-Miễn dịchtrường Đại học Y Hà Nội

2.4 PHƯƠNG PHÁP, CÁCH THỨC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.4.2 Cách thức tiến hành

Các thai phụ sắp sinh trong tiêu chuẩn lựa chọn và các thai phụ đượcxác định tiền sản giật ngay trong lần đầu tiên đến khám sẽ được tư vấn mờitham gia nghiên cứu Nếu thai phụ đồng ý, chúng tôi sẽ lấy máu sản phụ đểxét nghiệm xác định sự có mặt gen KIR2DS1 và KIR2DL1 của thai phụ Kếtquả xét nghiệm được ghi lại để phân tích sau này

Hình 2.1: Quy trình nghiên cứu

2.4.2.1 Quy trình tách chiết DNA từ máu tĩnh mạch thai phụ

Sử dụng quy trình chiết tách DNA từ bạch cầu máu ngoại vi bằngQIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN GmbH – Đức)

• Bước 1: Thêm 20 µl Quiagen Protease (hoặc Protease K) vào các eppendorf.

• Bước 2: Thêm 200 µl mẫu máu

• Bước 3: Thêm 200 µl AL, lắc bằng vortex trong 15s

• Bước 4: Ủ hỗn hợp trên ở nhiệt độ 56oC trong 10 phút

• Sau đó mang ly tâm nhanh để tránh đọng dung dịch trên nắp ống

• Bước 5: Thêm 200 µl ethanol (96-100%), lắc bằng vortex trong 15s

• Bước 6: Chuyển hỗn hợp trên vào Quiagen cột được đặt sẵn trong ống, đậynắp ly tâm 8000 vòng x 1 phút, thay ống thu gom 2ml mới

• Bước 7: Thêm 500 µl Buffer Aw1, đậy nắp ly tâm 8000 vòng x 1 phút, lấy lạicặn và đổ dịch nổi trong ống đi

• Bước 8: Thêm 500 µl Buffer Aw2, ly tâm 14000 vòng x 3 phút

• Bước 9: Thay ống thu gom bằng ống 2ml, ly tâm 14000 vòng x 1 phút

• Bước 10: Đặt cột vào ống 1,5ml mới, thêm 200 µl Buffer AE, để ở nhiệt

độ phòng trong 15 phút Sau đó ly tâm 8000 vòng x 1 phút, bỏ cặn, lấy dịchhòa tan, bảo quản ở -30 oC đến -15 oC

• Đo OD xác định độ tinh khiết và nồng độ DNA (1.8-2.2)

2.4.2.2 Quy trìnhxác định kiểu gen KIR bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen đích

• Thiết kế các cặp mồi cho các gen như sau:

Bảng 2.1 Trình tự primer các gen KIR [ 83 ]:

(bp)

2DL1 2DL1_A F1 GTTGGTCAGATGTCATGTTTGAA 146

R1 GGTCCCTGCCAGGTCTTGCG 2DL1_B F2 TGGACCAAGAGTCTGCAGGA 330

R2 TGTTGTCTCCCTAGAAGACG

2DS1 2DS1_A F1 CTTCTCCATCAGTCGCATG 100

R1 AGGGTCACTGGGAGCTGACAA 2DS1_B F2 CTTCTCCATCAGTCGCATG 102

R2 AGAGGGTCACTGGGAGCTGAC

• Phản ứng PCR cho mỗi mẫu:

Nước cất 2,5µl Mồi xuôi 1,0µl

Master Mix 2x 7,5µl Mồi ngược 1,0µl

DNA 3,0µl

• Cài đặt máy chu kỳ nhiệt, sau đó cho các ống phản ứng vào máy và bắt đầukhởi động chạy PCR:

Hình 2.2: Chu kỳ nhiệt của PCR

Điện di sản phẩm PCR

• Bước 1: Chuẩn bị gel thạch agarose 1,5%, pha 40ml dung dịch TAE 1x trong0,6g agarose, đun nóng cho đến khi tan hoàn toàn Làm nguội hỗn hợp đến

650C và thêm 5µg ethidium bromide

• Bước 2: Đổ hỗn hợp gel vào khuôn gel, đợi 20 phút cho gel đông đặc lại Sau

đó làm ngập khuôn thạch với 800ml TAE 1x trong buồng điện di và loại bỏlược

• Bước 3: Sử dụng 5µl sản phẩm PCR để điện di Trộn dung dịch màu LoadingDye với sản phẩm PCR và nhỏ vào 13 giếng để theo dõi sự di chuyển của sảnphẩm trong suốt quá trình điện di, riêng giếng đầu tiên và giếng cuối cùngthêm 2µl thang Ladder DNA 100bp

• Bước 4: Điện di tronghiệu điện thế 70V x 100 phút Sản phẩm điện di đượcthấy rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại và đối chiếu với hai giếng điện di mẫuchuẩn Thiết bị có gắn máy ảnh để chụp lại kết quả

2.4.3 Phương pháp thu thập thông tin

Dựa vào bảng thu thập thông tin (phụ lục): Kỹ thuật thu thập thông tinđược sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm phỏng vấn các thai phụ, khám lâmsàng và xét nghiệm

2.4.4 Các biến số nghiên cứu

- Thông tin cơ bản: tuổi, số lần mang thai, tuổi thai khi sinh, cân nặngtrẻ khi sinh, chỉ số apgar.

- Có mặt gen KIR2DS1, KIR2DL1

- Không có mặt gen KIR2DS1, KIR2DL1

- Có tiền sản giật

- Không tiền sản giật

- Các dấu hiệu lâm sàng: huyết áp tâm thu, huyết áp tâm trương, phù,đau đầu, nhìn mờ, đau thượng vị

- Các dấu hiệu cận lâm sàng: hồng cầu (T/l), hemoglobin(g/l), tiểu cầu (g/l), AST(U/l), ALT(U/l), ure(mmol/l), creatinin(µmol /l), acid uric(µmol /l), protein máu(g/l), albumin(g/l), protein niệu (g/l)

2.4.5 Kinh phí thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện dựa trên nguồn kinh phí của đề tài lớn cấp thành phố

2.4.6 Phân tích và xử lý số liệu

Các số liệu sau khi thu thập sẽ được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0

2.5 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

- Trung thực trong nghiên cứu

- Bảo đảm giữ bí mật các thông tin cá nhân về bệnh tình của bệnh nhân và cácthông tin trong hồ sơ nghiên cứu

- Cung cấp đầy đủ, trung thực các thông tin liên quan tới nguy cơ có thể xảy ra đốivới bệnh nhân trong nghiên cứu

- Bảo đảm quyền lợi của người bệnh khi tham gia nghiên cứu

- Tôn trọng các ý nguyện của người bệnh khi muốn dừng tham gia nghiên cứu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ

Sau khi tiến hành nghiên cứu trên hai nhóm đối tượng bao gồm 100 thaiphụ bình thường (nhóm chứng) và 81 thai phụ tiền sản giật (nhóm bệnh),chúng tôi ghi nhận kết quả sau đây:

3.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ CẬN LÂM SÀNG CỦA THAI PHỤ BÌNH THƯỜNG VÀ THAI PHỤ TIỀN SẢN GIẬT

3.1.1 Tuổi thai phụ

Bảng 3.1: Đặc điểm tuổi của thai phụ bình thường và thai phụ

tiền sản giật Nhóm

3.1.2 Số lần sinh của thai phụ

Biểu đồ 3.1: Số lần sinh của thai phụ

Nhận xét:

Nhóm thai phụ con so mắc tiền sản giật chiếm tỉ lệ 45.2 %, con rạ là 54.8% Nhóm thai phụ bình thường con so chiếm tỉ lệ 46%, con rạ là 54%

3.1.3 Tuần thai khi sinh

Biểu đồ 3.2: Tuần thai trẻ khi sinh

Nhận xét:

Trong nhóm trẻ có mẹ tiền sản giật, 6.2% nhỏ hơn 32 tuần, 38.3% từ 32đến trước 37 tuần, 55.6% ≥ 37 tuần

Trong nhóm trẻ có mẹ bình thường, tỉ lệ trên lần lượt là 2% và 98%

Sự khác biệt giữa 2 nhóm là có ý nghĩa thống kê Có thể thấy tỉ lệ thaitrên 37 tuần chiểm tỉ lệ cao nhất trong cả 2 nhóm

3.1.4 Một số đặc điểm của trẻ khi sinh

Biểu đồ 3.3: Cân nặng trẻ khi sinh

Nhận xét:

Tỉ lệ trẻ sinh ra có cân nặng dưới 2500gr ở nhóm bình thường là 5%, ởnhóm tiền sản giật là 56.8% Tỉ lệ trẻ sinh ra có cân nặng ≥ 2500gr ở nhómbình thường là 95%, ở nhóm tiền sản giật là 43.2% Sự khác biệt ở 2 nhóm có

4 đến 6 điểm là 11.1% và 0 đến 3 điểm là 1.2% Khác biệt giữa 2 nhóm có ý nghĩathống kê Có thể thấy apgar từ 7 đến 10 điểm chiếm tỉ lệ cao nhất ở cả 2 nhóm.

3.1.5 Một số đặc điểm lâm sàng ở thai phụ

Bảng 3.2: Huyết áp ở thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật

thường (100)

Nhóm tiền sản giật (n=81) p

Huyết áp tâm thu (mmHg) 111.6±6.8 155.9±14.8 <0.05

Huyết áp tâm trương (mmHg) 68.8±6.5 99.9±12.2 <0.05

Nhận xét:

Huyết áp tâm thu trung bình ở thai phụ bình thường là 11.6±6.8, ở thaiphụ tiền sản giật là 155.9±14.8 Ở nhóm thai phụ bình thường, huyết áp tâmtrương trung bình là 68.8±6.5, ở thai phụ tiền sản giật là 99.9±12.2 Sự khácbiệt giữa 2 nhóm có ý nghĩa thống kê

Bảng 3.3: Phù ở thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật Phù

Nhóm bình thường(n=100) Nhóm tiền sản giật(n=81) p

Tỉ lệ phù ở nhóm tiền sản giật là 96.3%, ở nhóm bình thường là 18%

Sự khác biệt giữa 2 nhóm có ý nghĩa thống kê

Bảng 3.4: Đau đầu ở thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật

Bảng 3.5: Nhìn mờ ở thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật

Nhìn mờ Nhóm bình thường Nhóm tiền sản giật p

Trong cả 2 nhóm bệnh và nhóm thường khôngghi nhận trường hợp nàođau thượng vị

3.1.6 Một số đặc điểm cận lâm sàng ở thai phụ

Bảng 3.6: Một số đặc điểm cận lâm sàng ở thai phụ bình thường và thai

Đặc điểm Nhóm thường (100) bình Nhóm tiền sản giật (81) p

Hồng cầu trung bình của nhóm thai phụ bình thường là 4.2±0.4 Trongkhi đó với nhóm thai phụ tiền sản giật chỉ số này là 4.49±0.6 Sự khác nhaugiữa hai nhóm đối tượng nghiên cứu không có ý nghĩa thống kê (p>0.05) Chỉ

số hemoglobin của 2 nhóm đối tượng lần lượt là 122.1±10.1 và 129.1±15.3.Nhóm tiền sản giật có chỉ số này lớn hơn có ý nghĩa so với nhóm thường

Tiểu cầu : nhóm thai phụ tiền sản giật có số lượng tiểu cầu trung bình là205.8±60.7 G/l thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm thai phụ bìnhthường (225.5±61.7 G/l)

Giá trị trung bình các chỉ số AST và ALT lần lượt ở nhóm thai phụ tiềnsản giật là 33.9±36.5 U/l và 30.2±51.2U/l Ở nhóm thai phụ bình thường giátrị trung bình AST là 19.7±4.8 U/l và ALT là 13.4±6.5 U/l Sự khác biệt về haichỉ số này ở hai nhóm có ý nghĩa thống kê (p<0.05)

Giá trị ure,creatinin và acid uric máu trung bình của nhóm thai phụ tiềnsản giật cao hơn nhóm thai phụ bình thường với sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê (p<0.05)

Protein toàn phần trong huyết thanh của nhóm thai phụ tiền sản giật cógiá trị trung bình là 62.6±6.4 g/l thấp hơn so với nhóm bình thường (68.6±3.8g/l) Albumin ở nhóm thai phụ tiền sản giật là 31.8±4.1 cũng nhỏ hơn ở nhómthường là 35.1±7.6 Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê.

3.2 NGHIÊN CỨU SỰ XUẤT HIỆN CỦA GEN KIR2DS1 VÀ KIR2DL1

VÀ MỐI LIÊN QUAN CỦA CHÚNG VỚI CÁC ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG

Hình ảnh thu được sau điện di của chúng tôi như sau:

Hình 3.1 Kết quả thu được sau điện di

Giếng 2: Mẫu multi-PCR KIR2DL1A (146bp) và KIR2DL1B (330bp)Giếng 3: Mẫu single KIR2DL1B (+) (330bp)

Giếng 4: Mẫu single KIR2DL1A (+) (146bp)

Giếng 5: Mẫu single KIR2DS1A (+) (100bp)

Giếng 6: Mẫu single KIR2DS1B (+) (102bp)

Giếng 7: H2O

3.2.1 Sự xuất hiện của gen KIR2DS1 và mối liên quan với các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng

Bảng 3.7: Sự xuất hiện của KIR2DS1 ở nhóm bình thường và nhóm tiền

sản giật KIR2DS1

Nhóm bình thường(n=100) Nhóm tiền sản giật(n=81) p

Bảng 3.9: Mối liên quan của KIR2DS1 và huyết áp thai phụ ở nhóm tiền

sản giật

Bảng 3.10: Mối liên quan của KIR2DS1 với các triệu chứng lâm sàng ở

Bảng 3.11: Mối liên quan của KIR2DS1 với các triệu chứng cận lâm sàng

ở nhóm tiền sản giật