ĐÁNH GIÁ mối LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHÔI NGÀY 3 với kết QUẢ xét NGHIỆM DI TRUYỀN TRONG kỹ THUẬT SÀNG lọc DI TRUYỀN TIỀN làm tổ

SỞ Y TẾ HÀ NỘI BỆNH VIỆN PHỤ SẢN HÀ NỘI NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHƠI NGÀY VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRONG KỸ THUẬT SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ Hà Nội, năm 2018 SỞ Y TẾ HÀ NỘI BỆNH VIỆN PHỤ SẢN HÀ NỘI NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHƠI NGÀY VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TRONG KỸ THUẬT SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ Chủ nhiệm đề tài BS.CKII Phạm Thúy Nga Nhóm nghiên cứu: CN Nguyễn Thu Huyền KS Đinh T Phương Thảo CN Ngô Tuấn Khanh HS Lê Thị Hương Hà Nội, năm 2018 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT a-CGH : Array Comparative Genomic Hybridization (lai so sánh gen) FISH : Fluorescent In Situ Hybridization (lai huỳnh quang chỗ) hCG : Human Chorionic Gonadotropin ICSI : IntraCytoplasmic Sperm Injection (tiêm tinh trùng vào bào tương noãn) IVF : In-Vitro Fertiliztion (thụ tinh ống nghiệm) LBNST : Lệch bội nhiễm sắc thể NC : Nghiên cứu NGS : Next Generation Sequencing (giải trình tự gene hệ mới) NST : Nhiễm sắc thể PGD : Preimplantation genetic diagnosis (Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ) PGS : Preimplantation genetic screening (Sàng lọc di truyền tiền làm tổ) TTTON : Thụ tinh ống nghiệm VS : vô sinh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI TTTON VÀ TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI PHƠI ĐANG PHÂN CHIA .3 1.1.1 Giai đoạn tiền nhân .3 1.1.2 Giai đoạn phân chia (Cleavage) 1.1.3 Giai đoạn phôi dâu (morula) 1.1.4 Giai đoạn phôi nang (blastocyst) 1.1.5 Các yếu tố hình thái phơi ngày 1.2 SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ 1.2.1 Khái niệm, định .8 1.2.2 Quy trình sàng lọc di truyền tiền làm tổ 1.3 BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI VÀ BẤT THƯỜNG NST .12 1.3.1 Bộ nhiễm sắc thể người .12 1.3.2 Bất thường số lượng nhiễm sắc thể 13 1.3.3 Bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể 14 1.3.4 Một số hội chứng người bất thường NST gây 15 1.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ 16 1.4.1.Nghiên cứu kết xét nghiệm di truyền 16 1.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng hình thái phôi đến két xét nghiệm 17 CHƯƠNG 19 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 19 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Tiêu chuẩn chọn 19 2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ 19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả hồi cứu tiến cứu 19 2.3.2 Cỡ mẫu .19 2.3.3 Kỹ thuật thu thập số liệu 20 2.3.4 Các bước tiến hành 20 2.3 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ PHÔI NGÀY TRONG NGHIÊN CỨU .23 2.4 CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU 25 2.4.1 Các biến số đặc điểm mẫu nghiên cứu 25 2.4.2 Các biến số kết xét nghiệm di truyền 25 2.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU VÀ SAI SỐ 25 2.6 KHÍA CẠNH ĐẠO ĐỨC CỦA ĐỀ TÀI 26 CHƯƠNG 27 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .27 3.1.1 Đặc điểm hình thái phơi .27 3.1.2 Đặc điểm kết xét nghiệm di truyền phôi 28 3.2 LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHƠI VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN .28 3.2.1 Liên quan hình thái phơi ngày với kết xét nghiệm 28 3.2.2 Liên quan yếu tố phôi ngày với kết xét nghiệm 30 3.2.3 Liên quan yếu tố phôi ngày với kết xét nghiệm qua phân tích kết hợp yếu tố hình thái .33 CHƯƠNG 39 BÀN LUẬN 39 4.1 BÀN LUẬN VỀ ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39 4.2 BÀN LUẬN VỀ TƯƠNG QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHƠI NGÀY VỚI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN 41 4.3 BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA TỪNG YẾU TỐ HÌNH THÁI ĐẾN KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN 44 Ảnh hưởng số lượng phôi bào đến kết di truyền 44 Ảnh hưởng tỷ lệ phân mảnh bào tương đến kết di truyền 45 Ảnh hưởng độ đồng tế bào đến kết di truyền 46 4.4 BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG KẾT HỢP CỦA CÁC YẾU TỐ HÌNH THÁI ĐẾN KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN 48 Ảnh hưởng hai yếu tố hình thái đến kết xét nghiệm 48 Ảnh hưởng kết hợp ba yếu tố hình thái đến kết xét nghiệm 49 KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái phơi sinh thiết 27 Bảng 3.2: Kết giải trình tự gen 23cặp nhiễm sắc thể phôi ngày .28 Bảng 3.3: Liên quan hình thái phơi với kết xét nghiệm 28 Bảng 3.4: Liên quan hình thái phơi với loại bất thường NST 29 Bảng 3.5: Liên quan số lượng tế bào với kết di truyền 30 Bảng 3.6: Liên quan tỷ lệ phân mảnh bào tương với kết di truyền 31 Bảng 3.7: Liên quan độ đồng tế bào với kết di truyền 32 G 32 Bảng 3.8: Liên quan số lượng tế bào, độ đồng tế bào .33 với kết xét nghiệm di truyền .33 Bảng 3.9: Liên quan số lượng tế bào, độ phân mảnh bào tương 34 với kết xét nghiệm di truyền .34 Bảng 3.10: Liên quan độ đồng tế bào, độ phân mảnh bào tương với kết xét nghiệm di truyền 35 Bảng 3.11: Liên quan số lượng tế bào, độ đồng tế bào tỷ lệ phân mảnh bào tương với kết xét nghiệm di truyền 37 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sự phát triển phơi ngày 2, ngày (2, 4, 6, tế bào)[23] Hình 1.2 : Phơi dâu ngày (từ lúc bắt đầu kết khối đến hoàn tất thành khối đặc không thấy ranh giới tế bào)[23] .4 Hình 1.3: Phơi nang (từ lúc xuất xoang phơi nang đến hình thành phơi nang hồn chỉnh) [23] Hình 1.4: Đánh giá độ đồng phôi Hình 1.5: Quy trình sàng lọc di truyền tiền làm tổ Hình 1.6: Sinh thiết tế bào phơi ngày (8 tế bào) Hình 1.7: Sinh thiết phôi nang 10 Hình 1.8: Bộ nhiễm sắc thể đặc trưng người .13 Hình 1.9: Cơ chế tạo thể lệch bội nguyên phân giảm phân 14 Hình 1.10: Cơ chế hình thành bất thường cấu trúc NST 15 Hình 2.1: Kỹ thuật sinh thiết tế bào ngày 21 Hình 2.2: Kỹ thuật rửa tế bào sau sinh thiết .21 Hình 2.3: Quy trình phân tích mẫu (bộ kit VeriSeq PGS – Illumina) 22 Hình 2.4: Phần mềm phân tích kết kỹ thuật NGS 22 Hình 2.5: Phơi có kích thước tế bào tương đối đồng 24 Hình 2.6: Phơi có kích thước tế bào không đồng .24 Hình 2.7: Mức độ phân mảnh bào tương phơi 24 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự phát triển ngày hoàn thiện kĩ thuật thụ tinh ống nghiệm tạo phôi giúp bệnh nhân tạo nhiều phôi chu kì IVF, nhờ có nhiều hội để lựa chọn phôi chuyển vào buồng tử cung Việc lựa chọn phôi “chất lượng tốt” để chuyển vào buồng tử cung bước quan trọng giúp tăng tỷ lệ có thai cho đời em bé khỏe mạnh, không bị dị tật Hiện nay, trung tâm thụ tinh ống nghiệm, việc lựa chọn phôi thường dựa tiêu chuẩn hình thái như: kích thước, số lượng tế bào tỷ lệ mảnh vụn bào tương phôi…không phản ánh đầy đủ chất lượng thực phôi [1] Rất nhiều kĩ thuật đời giúp lựa chọn phơi có tiềm để chuyển vào buồng tử cung nhằm tăng hội có thai Kỹ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ (Preimplantation genetic screening – Sàng lọc di truyền tiền làm tổ - PGS) kỹ thuật với sở khoa học rằng: nguyên nhân gây thất bại làm tổ sẩy thai nhiều lần phôi bị bất thường nhiễm sắc thể Kỹ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ giúp sàng lọc bất thường phôi giai đoạn sớm trước làm tổ nhằm phát phơi bất thường, chọn phơi bình thường có tiềm làm tổ cao để chuyển vào buồng tử cung cho bệnh nhân giúp cải thiện tỷ lệ có thai giảm tỷ lệ thai dị tật tăng hội sinh em bé khỏe mạnh [4] Sau thời gian chuẩn bị kĩ lưỡng trang thiết bị, nhân lực, kĩ thuật, tháng 10/2015, khoa Hỗ trợ sinh sản – Bệnh viện Phụ sản Hà Nội bắt đầu triển khai kĩ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ thu số kết đáng khích lệ Tuy nhiên, chi phí cho chu kì PGS tương đối cao phần lớn cặp vợ chồng muộn “Làm để giúp cặp vợ chồng khơng có điều kiện làm PGS lựa chọn phơi có tiềm cao tỷ lệ bất thường NST thấp” trăn trở Nhiều nghiên cứu nước cho thấy mối liên quan hình thái phơi ngày kết xét nghiệm di truyền Đây động lực để nhóm tác giả chúng tơi, dựa vào kết chu kỳ PGS, định thực đề tài: “Đánh giá mối liên quan hình thái phơi ngày với kết xét nghiệm di truyền kỹ thuật sàng lọc di truyền tiền làm tổ” với hai mục tiêu: Xác định mối liên quan hình thái phơi ngày với kết xét nghiệm di truyền Xác định mối liên quan yếu tố hình thái phơi ngày với kết xét nghiệm di truyền qua phân tích đơn biến đa biến 49 nhóm phơi có tế bào khơng đồng đều, tỷ lệ bình thường NST tương đương dù độ phân mảnh bào tương khác Trong nhóm phơi có tế bào đồng đều, tỷ lệ bình thường NST tương tự tỷ lệ phân mảnh ≤ 10% từ 11-19% Điều cho thấy tỷ lệ bình thường NST phơi ngày chịu ảnh hưởng yếu tố độ phân mảnh bào tương  Ảnh hưởng kết hợp ba yếu tố hình thái đến kết xét nghiệm Khi phân tích ảnh hưởng kết hợp yếu tố số lượng tế bào, độ đồng tế bào độ phân mảnh bào tương với tỷ lệ khơng phân tích kết quả, nhận thấy: kết hợp yếu tố số lượng tế bào - số lượng tế bào >9 kích thước tế bào thường gặp nên không thấy liên quan yếu tố hình thái phơi với kết xét nghiệm di truyền Đồng thời, nhóm phơi - tế bào có tỷ lệ bình thường NST thấp tỷ lệ bất thường NST cao hẳn nhóm phôi khác, không phụ thuộc vào tỷ lệ phân mảnh bào tương hay độ đồng tế bào phôi Với phôi từ tế bào trở lên, kết hợp yếu tố tỷ lệ phân mảnh bào tương độ đồng tế bào phơi có ảnh hưởng có ý nghĩa đến kết xét nghiệm di truyền Điều cho thấy yếu tố phôi phát triển chậm ảnh hưởng xấu đến tỷ lệ bình thường NST phôi ngày Những phôi không nên sinh thiết vào thời điểm ngày mà nên nuôi tiếp sinh thiết ngày 5/6 phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang Ở hầu hết nhóm phơi (kể nhóm phơi - tế bào), tỷ lệ phân mảnh bào tương tăng dẫn đến tăng mạnh tỷ lệ khơng phân tích kết Tỷ lệ phân mảnh bào tương ≥ 20% có tỷ lệ khơng phân tích kết cao, đặc biệt kết hợp yếu tố số lượng phơi bào 7-9 kích thước tế bào đồng (33,3%) Điều yếu tố độ phân mảnh bào tương có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ khơng phân tích kết so với hai yếu tố lại Những phơi có tỷ lệ phân mảnh bào tương ≥ 20% không nên 50 sinh thiết vào ngày mà nên sinh thiết ngày 5/6 phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang Yếu tố kích thước phơi bào khơng đồng kết hợp với hai yếu tố lại cho tỷ lệ bình thường NST thấp tỷ lệ bất thường NST cao so với phơi có tế bào đồng đều, đặc biệt nhóm phơi 7-9 tế bào Tuy nhiên, số lượng phôi 7-9 tế bào vào ngày chiếm tỷ lệ lớn phôi thu vào thời điểm sinh thiết nên với phôi không thiết phải nuôi đến ngày 5/6 sinh thiết mà cần lưu ý không sinh thiết ngày phơi có tế bào q lệch, chẳng hạn phơi có tế bào lớn nhiều tế bào bé phơi có loại tế bào kích thước khác Những phơi có độ đồng bất thường ghi nhận tỷ lệ bất thường lệch bội cao, nên sinh thiết ngày 5/6 phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang Như vậy, qua đánh giá đơn biến yếu tố hình thái phơi, đánh giá đa biến kết hợp yếu tố hình thái, chúng tơi nhận thấy ảnh hưởng khác đến kết xét nghiệm di truyền Từ phân tích đó, chúng tơi đưa gợi ý việc lựa chọn phôi ngày để sinh thiết dựa vào hình thái (xem phụ lục 5) Với hoàn thiện kỹ thuật sinh thiết phôi nang khoa Hỗ trợ sinh sản, chúng tơi khuyến khích bệnh nhân sinh thiết phơi nang để có kết xét nghiệm xác nhất, tiết kiệm chi phí hiệu Tuy nhiên với số trường hợp bệnh nhân sinh thiết ngày nên áp dụng lựa chọn phơi hình thái đủ điều kiện sinh thiết để giảm bớt nguy phôi bất thường giảm số lượng phôi cần sinh thiết Những phôi không đủ điều kiện sinh thiết nuôi đến giai đoạn phôi nang sinh thiết Đây phương án hợp lý giúp giảm chi phí xét nghiệm cho bệnh nhân 51 KẾT LUẬN MỤC TIÊU 1:  Hình thái phơi ngày có ảnh hưởng đến kết xét nghiệm di truyền: phôi có hình thái tốt có tỷ lệ bình thường NST cao phơi có hình thái trung bình xấu Phơi có hình thái xấu có tỷ lệ khơng phân tích kết cao phơi hình thái tốt trung bình  Hình thái phơi ngày khơng có ảnh hưởng đến loại bất thường di truyền phôi: tỷ lệ phôi bất thường số lượng NST, bất thường cấu trúc NST bất thường số lượng + cấu trúc NST ba nhóm hình thái phơi tương đương MỤC TIÊU 2:  Qua phân tích ảnh hưởng yếu tố hình thái phơi số lượng tế bào, độ đồng tế bào phơi độ phân mảnh bào tương có ảnh hưởng đến kết xét nghiệm di truyền  Chúng nhận thấy kết hợp yếu tố hình thái phơi tác động khác đến kết xét nghiệm di truyền: 52 o Yếu tố số lượng tế bào tác động mạnh đến tỷ lệ bất thường nhiễm sắc Yếu tố tốc độ phát triển chậm phôi làm tăng tỷ lệ bất thường NST phôi, khơng phụ thuộc vào hai yếu tố lại o Yếu tố phơi có kích thước tế bào khơng đồng có tỷ lệ bình thường NST thấp, bất thường NST cao phơi có kích thước tế bào đồng o Độ phân mảnh bào tương tăng làm tăng tỷ lệ khơng phân tích kết phơi ngày KIẾN NGHỊ Kết nghiên cứu cho thấy có mối liên quan hình thái phơi ngày mối liên quan yếu tố hình thái phôi với kết xét nghiệm di truyền tiền làm tổ Tuy nhiên, yếu tố hình thái phơi lại ảnh hưởng khác với kết xét nghiệm di truyền Điều góp phần gợi ý cho nhân viên phôi học lựa chọn phôi sinh thiết thời điểm sinh thiết phù hợp Đối với bệnh nhân khơng có điều kiện làm PGS, nghiên cứu đưa gợi ý giúp lựa phôi chuyển tốt hợn: phơi 7-9TB, phân mảnh bào tương