Nghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid tại viện huyết học_truyền máu trung ương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Vũ Đức Quang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ XÉT NGHIỆM ĐÔNG MÁU VÀ XÉT NGHIỆM KHÁNG T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Vũ Đức Quang

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ XÉT NGHIỆM ĐÔNG MÁU

VÀ XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƢƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Vũ Đức Quang

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ XÉT NGHIỆM ĐÔNG MÁU

VÀ XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: TS Trần Thị Kiều My Hướng dẫn 2: TS Nguyễn Thị Trung

Hà Nội - 2019

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của bản thân tôi Các số liệu trong luận văn này là có thật, do tôi thu thập và thực hiện tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng một cách trung thực, khoa học và chính xác

Kết quả luận văn chƣa đƣợc đăng tải trên bất kỳ một tạp chí hay công trình khoa học nào

Tác giả

Vũ Đức Quang

Lời cảm ơn

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám đốc, Phòng Đào tạo, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ và Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu

TS Trần Thị Kiều My và TS Nguyễn Thị Trung, những người thầy

đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và chia sẻ cho tôi những kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô cùng quý giá trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

TS Bạch Quốc Khánh, Viện trưởng Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, PGS.TS Chu Hoàng Hà, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học,

những người thầy đã động viên khuyến khích, chỉ bảo tận tình và đã cho tôi điều kiện tốt nhất để học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

ThS Đào Thị Thiết, CN Nguyễn Thị Thanh Hương cùng toàn thể các

bác sĩ và nhân viên trong khoa Đông máu, Tế bào – Tổ chức học, phòng Kế hoạch Tổng hợp và các khoa lâm sàng đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, giúp đỡ tôi trong quá trình lấy bệnh phẩm, chỉ định và làm xét nghiệm Xin cảm ơn những bệnh nhân đã hợp tác và tạo điều kiện cho tôi được lấy mẫu bệnh phẩm để nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn những người bạn, những người luôn ở bên tôi trong suốt hai năm học tập

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn cha mẹ, vợ và các con, những người thân trong gia đình đã luôn quan tâm, động viên, khích lệ và là nguồn sức mạnh, là chỗ dựa vững chắc để tôi vượt qua mọi khó khăn, không ngừng phấn đấu trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 3 năm 2019

Vũ Đức Quang

Các chữ viết tắt

a GPI Anti β2 - glycoprotein I Kháng β2 - glycoprotein IAPS Anti Phospholipid Syndrome Hội chứng kháng

phospholipid APTT Activated partial thromboplastin

Thời gian Stypven

INR International Normalized Ratio Tỷ lệ chuẩn hoá quốc tế

LA Lupus AntiCoagulant Kháng đông lupus

rAPTT Ratio Activated partial

Danh mục các bảng

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn giá trị xét nghiệm thực hiện trong nghiên cứu 29

Bảng 3.1 Xếp loại bệnh tật nhóm bệnh nhân nghiên cứu 36

Bảng 3.2 So sánh giá trị trung bình một số chỉ số xét nghiệm đông cầm máu theo giá trị xét nghiệm LA 41

Bảng 3.3 Đặc điểm chỉ số rAPTT theo giá trị xét nghiệm LA 42

Bảng 3.4 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm INR theo giá trị xét nghiệm LA 43

Bảng 3.5 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm rTT theo giá trị xét nghiệm LA 44

Bảng 3.6 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm D-Dimer theo giá trị xét nghiệm LA 44 Bảng 3.7 Đặc điểm số lƣợng tiểu cầu theo giá trị xét nghiệm LA 45

Bảng 3.8 Đặc điểm xét nghiệm Fib theo giá trị xét nghiệm LA 46

Bảng 3.9 Đặc điểm xét nghiệm KĐKPT theo giá trị LA 46

Bảng 3.10 So sánh giá trị trung bình một số chỉ số xét nghiệm đông máu theo giá trị xét nghiệm aCL 47

Bảng 3.11 Đặc điểm chỉ số rAPTT theo giá trị xét nghiệm aCL 49

Bảng 3.12 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm INR theo giá trị xét nghiệm aCL 49

Bảng 3.13 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm rTT theo giá trị xét nghiệm aCL 50

Bảng 3.14 Đặc điểm chỉ số D-Dimer theo giá trị xét nghiệm aCL 50

Bảng 3.15 Đặc điểm số lƣợng tiểu cầu theo giá trị xét nghiệm aCL 51

Bảng 3.16 Đặc điểm xét nghiệm Fib theo giá trị xét nghiệm aCL 52

Bảng 3.17 Đặc điểm xét nghiệm KĐKPT theo giá trị xét nghiệm aCL 52

Bảng 3.18 So sánh giá trị trung bình một số chỉ số xét nghiệm đông máu theo giá trị xét nghiệm aGPI 53

Bảng 3.19 Đặc điểm chỉ số rAPTT theo giá trị xét nghiệm aGPI 54

Bảng 3.20 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm INR theo giá trị xét nghiệm aGPI 55

Bảng.3.21 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm rTT theo giá trị xét nghiệm aGPI 55

Bảng 3.22 Đặc điểm chỉ số D-Dimer theo giá trị xét nghiệm aGPI 56

Bảng 3.23 Đặc điểm số lượng tiểu cầu theo giá trị xét nghiệm aGPI 57

Bảng 3.24 Đặc điểm xét nghiệm Fib theo giá trị xét nghiệm aGPI 57

Bảng 3.25 Đặc điểm xét nghiệm KĐKPT theo giá trị xét nghiệm aGPI 58

Bảng 3.26 So sánh giá trị trung bình một số chỉ số xét nghiệm đông cầm máu theo số lượng kháng thể aPL dương tính 59

Bảng 3.27 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm rAPTT theo số lượng kháng thể aPL dương tính 60

Bảng 3.28 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm INR theo số lượng kháng thể aPL dương tính 61

Bảng 3.29 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm rTT theo số lượng kháng thể aPL dương tính 61

Bảng 3.30 Đặc điểm chỉ số xét nghiệm D-Dimer theo số lượng kháng thể aPL dương tính 62

Bảng 3.31 Đặc điểm số lượng tiểu cầu theo số lượng kháng thể aPL dương tính 62

Bảng 3.32 Đặc điểm xét nghiệm Fib theo số lượng kháng thể aPL 63

dương tính 63

Bảng 3.33 So sánh giá trị trung bình xét nghiệm rAPTT 64

Bảng 3.34 So sánh xét nghiệm KĐKPT trước và sau 12 tuần 65

Bảng 3.35 Diễn biến kháng thể LA sau 12 tuần 66

Bảng 3.36 Diễn biến kháng thể aCL sau 12 tuần 66

Bảng 3.37 Diễn biến kháng thể aGPI sau 12 tuần 66

Bảng 3.38 So sánh giá trị trung bình kháng thể aCL và aGPI sau 12 tuần 67

Danh mục hình

Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế đông máu huyết tương 10

Hình 1.2: Quá trình tiêu sợi huyết 12

Hình 3.1: Biểu đồ đặc điểm về tuổi nhóm bệnh nhân nghiên cứu 34

Hình 3.2: Biểu đồ tỷ lệ nam/nữ nhóm bệnh nhân nghiên cứu 35

Hình 3.3: Biểu đồ số lượng bệnh nhân dương tính với từng loại kháng thể 37

Hình 3.4: Biểu đồ tỷ lệ xuất hiện kháng thể theo nhóm bệnh 38

Hình 3.5: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo số lượng kháng thể đồng thời xuất hiện 39

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 SINH LÝ ĐÔNG CẦM MÁU 6

1.1.1 Những yếu tố tham gia hoạt hoá quá trình đông-cầm máu 6

1.1.2 Các giai đoạn của cơ chế đông-cầm máu 9

1.1.2.1 Giai đoạn cầm máu ban đầu: 9

1.1.2.2 Giai đoạn đông máu huyết tương 9

1.1.2.3 Giai đoạn tiêu sợi huyết 12

1.2 ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID VÀ NGUYÊN LÝ XÉT NGHIỆM 13

1.2.1 Kháng thể Lupus AntiCoagulant (LA) 13

1.2.1.1 Đặc điểm kháng thể LA 13

1.2.1.2 Nguyên lý xét nghiệm LA 14

1.2.2 Kháng thể Anti Cardiolipin (aCL) 15

1.2.2.1 Đặc điểm kháng thể aCL 15

1.2.2.2 Nguyên lý xét nghiệm Anti Cardiolipin 16

1.2.3 Kháng thể Anti β2-Glycoprotein (aGPI) 16

1.2.3.1 Đặc điểm kháng thể Anti β2-Glycoprotein (aGPI) 16

1.2.3.2 Nguyên lý xét nghiệm anti β2-glycoprotein 16

1.3 HỘI CHỨNG ANTI PHOSPHOLIPID 17

1.3.1 Lịch sử phát hiện 17

1.3.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán 17

1.3.3 Xếp loại hội chứng Antiphospholipid 18

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu 22

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 22

2.2.2 Chọn mẫu 22

2.2.3 Vật liệu nghiên cứu 23

2.2.3.1 Bệnh phẩm 23

2.2.3.2 Phương tiện, dụng cụ nghiên cứu 23

2.2.3.3 Hóa chất - sinh phẩm 23

2.3 CÁC TIÊU CHUẨN ÁP DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 29

2.3.1 Tiêu chuẩn về giá trị xét nghiệm 29

2.3.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán APS 30

2.4 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH XÉT NGHIỆM 31

2.5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 31

2.6 PHÂN TÍCH, XỬ LÝ SỐ LIỆU 32

2.7 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU 34

3.1.1 Đặc điểm về tuổi 34

3.1.2 Đặc điểm về giới 35

3.1.3 Xếp loại bệnh tật nhóm bệnh nhân nghiên cứu 36

3.2 ĐẶC ĐIỂM XÉT NGHIỆM ĐÔNG MÁU VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID 37

3.2.1 Đặc điểm xuất hiện kháng thể kháng phospholipid (aPL) 37

3.2.1.1 Đặc điểm xuất hiện từng loại kháng thể aPL nhóm bệnh nhân nghiên cứu 37

3.2.1.2 Sự phân bố kháng thể theo chẩn đoán bệnh 38

3.2.1.3 Đặc điểm về số lượng kháng thể aPL đồng thời xuất hiện 39

3.2.2 Đặc điểm một số xét nghiệm đông máu liên quan tới sự xuất hiện kháng thể kháng phospholipid 40

3.2.2.1 Đặc điểm một số xét nghiệm đông máu theo giá trị xét nghiệm Lupus Anticoagulant (LA) 41

3.2.2.2 Đặc điểm một số chỉ số đông cầm máu theo giá trị xét nghiệm aCL 47

3.2.2.3 Đặc điểm một số chỉ số đông cầm máu theo giá trị xét nghiệm aGPI 53

3.2.2.4 Đặc điểm một số xét nghiệm đông máu theo số lượng kháng thể kháng phospholipid dương tính 59

3.3 KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC KHÁNG THỂ SAU 12 TUẦN Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN 63

3.3.1 Diễn biến xét nghiệm rAPTT và KĐKPT sau 12 tuần 64

3.3.2 Diễn biến kháng thể LA sau 12 tuần 65

3.3.3 Diễn biến kháng thể aCL và aGPI sau 66

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

4.1 KẾT LUẬN 68

4.1.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu 68

4.1.2 Đặc điểm xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid (aPL) và các xét nghiệm đông máu khác 68

4.1.3 Diễn biến động học kháng thể aPL sau 12 tuần 69

4.2 KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Hội chứng Antiphospholipid (APS - Antiphospholipid Syndrome) là bệnh lý tự miễn được mô tả bởi huyết khối động tĩnh mạch tái diễn hoặc sảy thai nhiều lần cùng với sự có mặt của kháng thể kháng phospholipid [1] Xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid là một trong những tiêu chuẩn bắt buộc trong chẩn đoán hội chứng Antiphospholipid Sự xuất hiện của một trong các kháng thể kháng phospholipid (bao gồm cả kháng đông lupus (LA), kháng thể kháng β2glycoprotein, kháng thể kháng cardiolipin) đều có vai trò trong chẩn đoán APS Mặt khác, kháng thể kháng phospholipid còn gặp trong một số bệnh lý tự miễn, nhiễm trùng, ung thư (có thể gây APS thứ phát) [1]

Các nghiên cứu về kháng thể kháng phospholipid đã bắt đầu từ những năm đầu của thế kỷ 20 Trải qua gần 100 năm, các nhà khoa học ngày càng tìm ra được nhiều loại kháng thể kháng phospholipid cũng như chứng minh được vai trò của các loại kháng thể này với sự xuất hiện của huyết khối và sảy thai liên tiếp Năm 1997, lần đầu tiên công bố về xếp loại hội chứng Antiphospholipid, sau đó các tiêu chuẩn chẩn đoán, xếp loại và điều trị APS ngày càng được hoàn thiện Ba loại kháng thể có vai trò quan trọng nhất được

đề cập tới đó là kháng đông lupus (LA), kháng thể kháng β2 - glycoprotein (a GPI), kháng thể kháng cardiolipin (a CL) Các xét nghiệm xác định kháng thể nêu trên được đưa vào tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh đồng thời có ý nghĩa trong theo dõi động học và đáp ứng điều trị APS [1]

Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về APS và sảy thai liên tiếp Theo thống kê, APS là nguyên nhân của khoảng 20% phụ nữ có sảy thai liên tiếp Một số nghiên cứu về tình trạng sảy thai hay các dấu hiệu lâm sàng của APS đã được tiến hành tại Việt Nam Theo một nghiên cứu tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương, có đến 47,9% sản phụ có tiền sử sảy thai liên tiếp có dương tính một trong ba loại kháng thể kháng phospholipid Tỷ lệ dương tính với các loại kháng thể cũng khác nhau [2] Tại viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, các xét nghiệm phát hiện chất kháng đông lupus (LA), kháng thể kháng β2 - Glycoprotein, kháng thể kháng Cardiolipin đang được thực hiện thường quy với các bệnh nhân có nghi ngờ kháng thể kháng phospholipid lưu hành Tại

Việt Nam, những nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm các xét nghiệm đông máu và kháng thể kháng phospholipid còn chƣa nhiều Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng phospholid với hai mục tiêu:

1 Nghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid ở bệnh nhân khám và điều trị tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương giai đoạn 2017-2018

2 Bước đầu khảo sát diễn biến động học các xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid ở một số bệnh nhân sau 12 tuần

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SINH LÝ ĐÔNG CẦM MÁU

Đông cầm máu là sự thay đổi tình trạng vật lý của máu để chuyển một loại protein hòa tan thành dạng gel rắn là sợi huyết nhằm mục đích lấp chỗ tổn thương thành mạch hạn chế mất máu đồng thời cũng tham gia duy trì tình trạng lỏng của máu [3]

Quá trình đông cầm máu bao gồm các tác động qua lại mật thiết giữa

ba thành phần: Thành mạch, các tế bào máu và các protein huyết tương hoạt động dưới hình thức phản ứng men Quá trình này hoạt động theo yêu cầu và

bị điều hòa bởi các yếu tố thần kinh và thể dịch [3]

Trong cơ thể luôn có sự cân bằng giữa hai hệ thống: Làm đông máu và chống lại quá trình đông máu Một hệ thống mang tính bảo vệ cơ thể tránh chảy máu, một hệ thống đóng vai trò gìn giữ lưu thông lòng mạch để luôn bảo đảm tuần hoàn duy trì sự sống Mất cân bằng hai hệ này sẽ dẫn đến hậu quả làm tắc mạch hoặc chảy máu [3][4]

1.1.1 Những yếu tố tham gia hoạt hoá quá trình đông-cầm máu

Nội mạc và dưới nội mạc huyết quản: Khi có tổn thương thành mạch làm lớp dưới nội mạc tiếp xúc với máu sẽ hoạt hoá tiểu cầu và các yếu tố tiếp xúc

Tiểu cầu: Chức năng dưỡng mạch, tạo nút tiểu cầu mà vấn đề chính cho chức năng này là những phản ứng: Dính, giải phóng, ngưng tập tiểu cầu, làm co mạch ở chỗ tổn thương và tham gia vào quá trình đông máu và ảnh hưởng đến quá trình tiêu sợi huyết [3]

Dính tiểu cầu: Sau khi mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu dính vào tổ

chức liên kết dưới nội mạc Chức năng chính này dựa vào một phần yếu tố von-Willebrand trong huyết tương Dính tiểu cầu cũng phụ thuộc vào glycoprotein của màng tiểu cầu

Phản ứng giải phóng: Collagen hoặc thrombin tác động đi đến giải

phóng các chất từ các hạt tiểu cầu trong đó có ADP, serotonin, fibrinogen, lysosoman, enzym và yếu tố 4 tiểu cầu (yếu tố chống heparin) collagen và thrombin hoạt hoá tiểu cầu tổng hợp prostaglandin dẫn đến hình thành một chất không ổn định là thromboxan A2 làm giảm AMP vòng của tiểu cầu và bắt đầu phản ứng giải phóng Phản ứng giải phóng bị ức chế bởi một chất có tác dụng làm tăng AMP vòng của tiểu cầu, đó là prostaglandin prostacyclin (PGI2) được tổng hợp ở dưới nội mạc [3]

Ngưng tập tiểu cầu: ADP và thromboxan A2 được giải phóng tạo ra những đám dính tiểu cầu ở chỗ thành mạch bị tổn thương ADP làm cho tiểu cầu trương lên và màng các tiểu cầu kề nhau dính chặt vào nhau, cứ như vậy phản ứng giải phóng tiếp ADP và thromboxan A2 dẫn đến ngưng tập thứ phát

và kết quả là dính tiểu cầu hình thành một khối tiểu cầu đủ lớn để nút vùng nội mạc bị tổn thương

Các yếu tố đông máu huyết tương: Các yếu tố đông máu đều là những glycoprotein, về phương diện chức năng chúng thuộc những nhóm khác nhau tuỳ theo chúng là zymogen, đồng yếu tố hoặc chỉ là cơ chất như fibrinogen Tám yếu tố là zymogen nghĩa là những protein có khả năng chuyển thành một chất có hoạt tính enzym Yếu tố XIII là zymogen của một transglutaminase Prekallikrein và các yếu tố XII, XI, IX, X, VII, II đều là những zymogen của serin protease [3]

- Yếu tố tổ chức:

Sự tiếp xúc của máu với tổ chức dập nát sẽ phát động quá trình đông máu, khởi phát do một lipoprotein gọi là yếu tố tổ chức hay thromboplastin ngoại sinh Các phần lipid và protein của yếu tố tổ chức đều cần thiết cho đông máu nhưng tính đặc hiệu nằm trên phần protein

Yếu tố tổ chức không có hoạt tính enzym nhưng tác động như một đồng yếu tố trong hoạt hoá yếu tố VII, X

- Ion canxi:

Ion canxi tạo thuận lợi cho các protein phụ thuộc vitamin K kết hợp với phospholipid Những ion này cũng can thiệp vào các phản ứng không có liên

quan đến protein phụ thuộc vitamin K và cũng cần thiết cho sự thể hiện hoạt tính enzym của yếu tố XIIIa, cho sự ổn định yếu tố V và phức hệ yếu tố von-Willebrand và yếu tố VIII: C

Bảng 1.1: Các yếu tố đông máu huyết tương

Yếu tố III Yếu tố tổ chức, Thromboplastin

Yếu tố IV Ion Canxi (hiện nay không xếp vào yếu tố đông

máu) Yếu tố V Proaccelerin, Plasma Accelerator Globulin

Yếu tố VIII Yếu tố chống Hemophilia A

Yếu tố IX Yếu tố chống Hemophilia B, Yếu tố Christmas

Thromboplastin Antecedent Yếu tố XII Yếu tố Hageman, yếu tố tiếp xúc

Yếu tố XIII Yếu tố ổn định sợi huyết

Prekallikrein Yếu tố Fletiểu cầuher

High Molecular Weigh

Kininogen (H.M.W.K)

Yếu tố Fitzgerald

1.1.2 Các giai đoạn của cơ chế đông-cầm máu

1.1.2.1 Giai đoạn cầm máu ban đầu:

Xảy ra ngay khi thành mạch bị tổn thương Khi thành mạch bị tổn thương, lớp dưới nội mạc bị bộc lộ và tiểu cầu dính vào lớp dưới nội mạc với

sự có mặt của yếu tố von-Willebrand và yếu tố tiểu cầu GPIb

+ Tiểu cầu dính vào tổ chức dưới nội mạc và giải phóng ra các sản phẩm ADP, serotonin, epinephrin và các dẫn xuất của prostaglandin, đặc biệt là thromboxan A2 Một số sản phẩm này thúc đẩy quá trình ngưng tập tiểu cầu

+ Các tiểu cầu dính vào nhau, kết quả là hình thành nút tiểu cầu mà bắt đầu từ sự kết dính tiểu cầu vào lớp dưới nội mạc Nút tiểu cầu nhanh chóng lớn lên về mặt thể tích và sau một vài phút hoàn thành nút chỗ mạch máu bị tổn thương

Đây là quá trình phức tạp với phản ứng co mạch, kết dính tiểu cầu, phản ứng giải phóng, ngưng tập tiểu cầu và làm hoạt hoá quá trình đông máu

Yếu tố 3 tiểu cầu là một phospholipid bề mặt được bộc lộ khi nút tiểu cầu hình thành và tham gia thúc đẩy quá trình đông máu Nút tiểu cầu ban đầu chỉ đảm bảo cầm máu tạm thời ở những mạch máu nhỏ Để cầm máu ở những mạch máu lớn bị tổn thương cần phải có sự hình thành cục đông qua từng bước của quá trình đông máu với sự tham gia của các yếu tố đông máu huyết tương [3]

1.1.2.2 Giai đoạn đông máu huyết tương

Sự hoạt hoá đông máu có thể phát động bằng đường nội sinh do sự tiếp xúc của máu với bề mặt mang điện tích âm (cấu trúc dưới nội mạc huyết quản

in vivo, thuỷ tinh hoặc kaolin in vitro), hoặc bằng đường ngoại sinh do sự can thiệp của yếu tố tổ chức Cả hai đường đều dẫn đến sự hoạt hoá yếu tố X thành Xa, là yếu tố tác động biến prothrombin thành thrombin - một enzym xúc tác chuyển fibrinogen thành fibrin Yếu tố XIII có nhiệm vụ ổn định fibrin mới được tạo thành Các sợi fibrin tạo thành dạng lưới chứa các đám dính tiểu cầu ở chỗ tổn thương, nút tiểu cầu ban đầu không bền vững thành vững chắc và cuối cùng là cục máu ổn định có đủ khả năng cầm máu

Cả dòng thác các phản ứng enzym với sự có mặt các yếu tố đông máu xảy ra ở chỗ tổn thương Trừ fibrinogen, các yếu tố đông máu khác là những tiền enzym hoặc đồng yếu tố Tất cả các enzym, trừ yếu tố XIII, đều là các serin protease tức là các chất có khả năng thuỷ phân các dây peptid Đây là hệ thống hoạt động rất mạnh: Chỉ cần một phân tử gam yếu tố XI hoạt hoá, có thể liên tục hoạt hoá yếu tố IX, X và prothrombin để đi đến hình thành 2 x108

phân tử gam fibrin [4]

Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế đông máu huyết tương

(Nguồn: Nguyễn Anh Trí, 2008, Chỉ định xét nghiệm đông máu hợp lý, Đông

máu ứng dụng trong lâm sàng; NXB Y học, Tr.191)

Quá trình đông máu huyết tương có thể chia thành 3 thời kỳ:

a Hình thành thromboplastin hoạt hoá

- Theo đường nội sinh

Năm protein gồm yếu tố XII, prekallikrein, yếu tố XI, kininogen trọng lượng phân tử cao (H.M.W.K) và chất ức chế CI là những yếu tố quyết định chính quá trình hoạt hoá và ức chế giai đoạn tiếp xúc đông máu

Thành mạch bị tổn thương sẽ kích thích hoạt hoá bốn yếu tố nhóm tiếp

xúc XII, XI, prekallikrein, H.M.W.K làm hoạt hoá yếu tố IX Sự hoạt hoá yếu

tố X được thực hiện với sự tham gia của một phức hợp bao gồm enzym (yếu

tố IXa), một đồng yếu tố (yếu tố VIII: C), ion Ca++

và phospholipid của tiểu cầu, và cuối cùng là sự hình thành thromboplastin (prothrombinase)

Yếu tố IXa không chỉ giới hạn tác dụng enzym trên yếu tố X, mà còn

có khả năng hoạt hoá yếu tố VII tạo nên mối liên hệ giữa đường nội sinh và ngoại sinh

- Theo đường ngoại sinh:

Yếu tố tổ chức (các lipoprotein từ tổ chức bị tổn thương) hoạt hoá yếu

tố VII Yếu tố này trực tiếp hoạt hoá yếu tố X

Tổ chức tổn thương, các chất hoạt hoá của tổ chức hoạt hoá đông máu

đi đến hình thành fibrin sẽ thúc đẩy nhanh con đường nội sinh bằng sự hoạt hoá đồng yếu tố VIII và V

là chìa khoá của sự hình thành fibrin:

+ Thrombin chuyển fibrinogen thành fibrin, hoạt hoá yếu tố XIII làm

ổn định sợi huyết và tự làm tăng tốc độ hình thành của chính thrombin

+ Thrombin hoạt hoá yếu tố VIII: C và yếu tố VIII làm gia tốc sự hình thành yếu tố Xa bằng cả hai đường nội sinh và ngoại sinh, đồng thời hoạt hoá yếu tố V làm tăng hoạt hoá prothrombin bởi yếu tố Xa

+ Thrombin tác động lên tế bào như chất kích tập tiểu cầu mạnh nhất bằng cách cố định lên và hoạt hoá tế bào Bị tác động, tế bào nội mạc tăng sản xuất ra prostacyclin có tác dụng là ức chế chất hoạt hoá plasminogen Thrombin cũng cố định lên nguyên bào xơ (fibroblast) và kích thích các tế bào này tăng sinh

c Hình thành fibrin

Thrombin tác động thuỷ phân fibrinogen thành fibrinopeptid A và B (dạng fibrin monomer) Với sự thay đổi về điện tích và sự xuất hiện các lực hút tĩnh điện, fibrin monome trùng hợp thành fibrin polymer

Yếu tố XIII được hoạt hoá bởi thrombin và có ion Ca++

đã làm ổn định Fibrin polymer Fibrin được ổn định có đặc tính cầm máu nghĩa là có khả năng bịt vết thương ở thành mạch làm ngưng chảy máu Cục sợi huyết là những khối gel hoá được tạo thành bởi lưới fibrin đường kính khoảng 1 μm Mạng lưới này bao bọc hồng cầu, bạch cầu và nhất là tiểu cầu Một protein tiểu cầu là actomyosin sẽ tác động làm cục máu co lại

1.1.2.3 Giai đoạn tiêu sợi huyết

Mục đích cơ bản của quá trình tiêu sợi huyết là làm tan fibrin và trả lại

sự thông thoáng cho mạch máu

Hình 1.2: Quá trình tiêu sợi huyết

(Nguồn: Nguyễn Anh Trí và cộng sự, 2012, Cơ chế đông cầm máu, Huyết học

- truyền máu cơ bản, NXB Y học, tr 57-67)

Fibrinogen Fibrin

tPA Urokinase

Streptokinase

Tiêu sợi huyết là phản ứng bình thường khi thành mạch bị tổn thương Plasminogen là một  globulin ở dạng tiền enzym trong máu và dịch tổ chức, được chuyển thành dạng enzym tiêu protein là plasmin, từ đó được phóng thích từ thành mạch (hoạt hoá nội sinh) hoặc tổ chức (hoạt hoá ngoại sinh) Hoạt hoá quá trình tiêu sợi huyết phần lớn là theo sau sự giải phóng chất hoạt hoá plasminogen từ tổ chức (tPA) từ tế bào nội mạc [3]

Plasmin có hoạt tính rộng hơn cả thrombin: Có thể tiêu fibrinogen, fibrin, yếu tố V, VIII và nhiều protein khác

Chất hoạt hoá plasminogen tổ chức bị ức chế bởi PAI 1, plasmin trong tuần hoàn bị ức chế bởi 2 Antiplasmin và 2 macroglobulin

1.2 ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THỂ KHÁNG PHOSPHOLIPID VÀ NGUYÊN

LÝ XÉT NGHIỆM

Phospholipid (PL): Là một thành phần rất quan trọng tạo nên màng tế bào PL chủ yếu được tạo nên từ các acid béo cần thiết và tồn tại dưới dạng một phức hợp acid béo và một phần tử chứa phospho (như serine hoặc choline) Phospholipid tham gia vào một số giai đoạn của thác đông máu huyết tương (sơ đồ 1), đặc biệt là tham gia vào quá trình đông máu nội sinh

Do đó, sự xuất hiện của kháng thể kháng Phospholipid có thể ảnh hưởng đến quá trình đông cầm máu trong cơ thể [1] [3][5][6][7]

Các kháng thể Anti-phospholipid (Antiphospholipid Antibodies - kháng thể kháng phospholipid) là một thuật ngữ chung để chỉ một nhóm các tự kháng thể

có thể chống phospholipid hoặc phức hệ protein-phospholipid Mỗi loại kháng thể kháng thể kháng phospholipid có tên gọi tương ứng với protein gắn phospholipid Dưới đây là ba loại kháng thể có vai trò quan trọng nhất trong nhóm các kháng thể kháng phospholipid [1]

1.2.1 Kháng thể Lupus AntiCoagulant (LA)

1.2.1.1 Đặc điểm kháng thể LA

LA là một Imunoglobulin có khả năng ức chế các phản ứng của quá trình đông máu có phụ thuộc phospholipid như APTT, thời gian Kaolin (kaolin clotting time = KCT), thời gian Stypven (dRVVT) Tuy nhiên LA lại

không có khả năng ức chế hoạt tính của yếu tố đông máu đặc hiệu [1]

Cho đến nay, còn khá nhiều vấn đề xung quanh LA vẫn chưa được làm

rõ Người ta cho rằng: Kháng thể LA hình như tồn tại dưới dạng đa kháng thể, chứ không phải dạng kháng thể đơn lẻ Bởi vậy, ở bệnh nhân có LA, không có nghĩa là bệnh nhân đó bị SLE (lupus ban đỏ hệ thống); và ở bệnh nhân bị SLE

có thể có chất ức chế đông máu nhưng không chỉ là LA mà có thể là các chất

1.2.1.2 Nguyên lý xét nghiệm LA

Có nhiều kỹ thuật xét nghiệm LA Tuy nhiên các kỹ thuật này đều dựa trên nguyên lý chung là: Tiến hành sàng lọc LA bằng kỹ thuật đo thời gian đông với phospholipid pha loãng và sau đó khẳng định sự có mặt của LA bằng kỹ thuật đo thời gian đông với phospholipid nồng độ cao [10][11][12][13]

Các kháng thể LA được xác định bởi khả năng kéo dài các xét nghiệm phụ thuộc phospholipid như APTT, SCT, dRVVT [14]

Xét nghiệm dRVVT screen và dRVVT confirm là các thuốc thử được phát triển nhằm đơn giản hóa và chuẩn hóa việc phát hiện LA trong các đánh giá lâm sàng

Trong 1 lọ dRVVT Screen chế phẩm đông khô chứa nọc rắn Russell, một lượng nhỏ phospholipid, canxi, polybrene, đệm, chất ổn định, chất tạo màu và chất bảo quản

Trong 1 lọ dRVVT Confirm chế phẩm đông khô chứa nọc rắn Russell, một lượng lớn phospholipid, canxi, polybrene, đệm, chất ổn định, chất tạo màu và chất bảo quản

Lượng phospholipid trong hoá chất xét nghiệm dRVVT screen thấp làm cho nó nhạy với LA Lượng phospholipid trong hoá chất dRVVT confirm nhiều hơn làm cho thời gian đông máu ngắn hơn, từ đó khẳng định bệnh nhân

có LA [15][16][17][18]

Nọc rắn Russell, cùng với canxi trực tiếp kích hoạt yếu tố X (trong mẫu xét nghiệm) Do đó, Xét nghiệm dRVVT screen và dRVVT confirm không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bất thường của yếu tố tiếp xúc, yếu tố VII, VIII và

IX hoặc các chất ức chế Heparin được trung hòa bởi polybrene lên đến 1 U/mL Chính vì vậy, xét nghiệm dRVVT screen và dRVVT confirm đánh giá

LA cụ thể hơn hơn APTT [19][20][21][22][23]

1.2.2 Kháng thể Anti Cardiolipin (aCL)

1.2.2.1 Đặc điểm kháng thể aCL

Cardiolipin là một loại phospholipid tích điện âm, chủ yếu khu trú nhiều ở màng bên trong của ty lạp thể Kháng thể chống Cardiolipin (Anti Cardiolipin Antibody – aCL): Đã từ lâu người ta phát hiện thấy aCL trong máu các bệnh nhân bị nhiễm trùng, như bệnh giang mai (thậm chí hiện tại aCL còn được sử dụng trong xét nghiệm lâm sàng bệnh giang mai) Tuy nhiên, aCL cũng được tìm thấy trong máu của bệnh nhân mắc bệnh lý tự miễn, như bệnh lupus ban đỏ hệ thống (SLE) [1] [23] Qua đó cho thấy có thể

có hai loại aCL:

+ aCL gặp trong bệnh giang mai, là loại kháng thể của phospholipid đơn độc (cụ thể là Cardiolipin)

+ aCL khác, gặp trong bệnh tự miễn - là loại kháng thể của phức hợp phospholipid và β2GPI (hoặc protein gắn phospholipid khác)

Năm 1990, Matsuura E đã công bố những thử nghiệm cho thấy: Hiệu giá kháng thể aCL trong bệnh SLE sẽ tăng lên khi bổ sung β2GPI, nhưng trong bệnh giang mai thì hiệu giá aCL lại giảm khi thêm β2GPI

Các nghiên cứu chỉ ra rằng không có sự tương quan giữa aCL ở các bệnh nhiễm trùng với huyết khối; còn ở các bệnh tự miễn thì có sự tương quan giữa aCL với huyết khối Bởi vậy aCL được sử dụng như một tiêu chuẩn chẩn đoán trong xét nghiệm lâm sàng của hội chứng Antiphospholipid [1] [24]

1.2.2.2 Nguyên lý xét nghiệm Anti Cardiolipin

Phát hiện kháng thể kháng aCL-IgM/IgG bằng kỹ thuật hóa miễn dịch phát quang sử dụng các phân tử aCL-IgM/IgG của người đã tinh chế, có gắn các phân tử từ tính Các phân tử aCL-IgM/IgG gắn từ tính sẽ kết hợp với kháng thể kháng aCL có trong huyết tương bệnh nhân Sau đó kháng kháng

thể aCL gắn chất phát quang được bổ sung Phản ứng giữa “aCL (có gắn từ tính) - kháng thể aCL - kháng kháng thể (có gắn chất phát quang)” xảy ra

Phản ứng phát quang được hoạt hóa với H2O2 và chất xúc tác Mức độ phát quang được đo thông qua hệ thống quang học sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể trong mẫu huyết tương của bệnh nhân [10] [23]

1.2.3 Kháng thể Anti β2-Glycoprotein (aGPI)

1.2.3.1 Đặc điểm kháng thể Anti β2-Glycoprotein (aGPI)

β2-glycoprotein (β2GPI) là một loại lipoprotein được tổng hợp từ gan

và phóng thích vào máu Trọng lượng phân tử khoảng 50 KDa, chứa 326 acid amin và nồng độ trong huyết tương khoảng 200 mg/ml Nó dễ dàng gắn vào màng phospholipid tích điện âm Vai trò sinh lý của màng β2GPI chưa thực

sự rõ ràng nhưng β2GPI được coi là một protein đồng yếu tố chủ yếu đối với các kháng thể kháng phospholipid

Kháng thể anti β2-glycoprotein (a-β2GPI) là một tự kháng thể chống lại β-glycoprotein 1, nó gắn vào phần điện tích âm của phospholipid [1][25][26]

1.2.3.2 Nguyên lý xét nghiệm anti β2-glycoprotein

Phát hiện kháng thể kháng β2GPI (IgM/IgG) bằng kỹ thuật hoá miễn dịch phát quang sử dụng các phân tử β2GPI (IgM/IgG) của người, đã được tinh chế, có gắn các phân tử từ tính Các phân tử β2GPI gắn từ tính sẽ kết hợp với kháng thể kháng β2GPI có trong huyết tương bệnh nhân Sau đó kháng

thể kháng β2GPI gắn chất phát quang được bổ sung vào hỗn hợp trên Phản ứng giữa “β2GPI (có gắn từ tính) - kháng thể β2GPI - kháng kháng thể (có gắn chất phát quang)” xảy ra Phản ứng phát quang được hoạt hoá với H2O2

và chất xúc tác Mức độ phát quang được đo thông qua hệ thống quang học sẽ

tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể trong mẫu huyết tương của bệnh nhân [10][23]

1.3 HỘI CHỨNG ANTI PHOSPHOLIPID

1.3.1 Lịch sử phát hiện

Hội chứng anti phospholipid (Antiphospholipid Syndrome - APS) đã được phát hiện và nghiên cứu từ nhiều thập kỷ, đặc biệt trong giai đoạn 1980 -1990 Năm 1958, Conley và Hartmann phát hiện ra kháng đông Lupus – LA trong quá trình nghiên cứu về hội chứng APS Moore và Morh (1950) phát hiện ra mối liên hệ giữa xét nghiệm dương tính giả ở bệnh Giang mai và bệnh tự miễn [1][6]

Ban đầu, những bệnh nhân bị Lupus ban đỏ hệ thống được cho là bị chảy máu kéo dài, nhưng vào năm 1964, Walter Bowie và cộng sự đã nhận thấy một điều ngược lại ở các bệnh nhân này đó là huyết khối Trong một nghiên cứu kéo dài của Johansson và các cộng sự đã cho thấy sự hiện diện song hành của chảy máu và huyết khối ở các bệnh nhân bị Lupus ban đỏ hệ thống – SLE Năm 1975, Nilsson và cộng sự đã phát hiện ra mối liên quan của những bệnh nhân sảy thai nhiều lần với kháng đông lupus Bắt đầu từ năm 1980, APS đã nhận được rất nhiều sự quan tâm của các bác sĩ, các nhà khoa học trong nhiều chuyên khoa khác nhau Trong các năm từ 1980 đến

1983, đã có nhiều báo cáo về các nhóm bệnh nhân bị huyết khối, huyết khối tĩnh mạch hoặc động mạch và sảy thai liên tục [1][6]

1.3.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán

Chẩn đoán xác định hội chứng anti-phospholipid đòi hỏi ít nhất một

tiêu chuẩn lâm sàng và một tiêu chuẩn xét nghiệm [32][33][34][35][36]

a Tiêu chuẩn lâm sàng

- Bằng chứng của huyết khối: Huyết khối tĩnh mạch hoặc huyết khối

động mạch hoặc huyết khối mao mạch, được khẳng định bằng chẩn đoán hình

ảnh hoặc mô bệnh học

- Biến chứng thai sản:

+ Một hoặc nhiều lần thai chết lưu sau 10 tuần không giải thích được

mà hình thái phôi thai bình thường;

+ Một hoặc nhiều lần đẻ non trước 34 tuần;

+ Ba hoặc hơn ba lần sảy thai tự phát trước 10 tuần mà không có bất thường hormon của thai phụ hay sai lệch nhiễm sắc thể của bố, mẹ

b Tiêu chuẩn xét nghiệm

1.3.3 Xếp loại hội chứng Antiphospholipid

Xếp loại hội chứng anti-phospholipid như sau [1][33]:

- Hội chứng anti-phospholipid tiên phát: Hội chứng anti-phospholipid không tìm được nguyên nhân hay bệnh lý phối hợp

- Hội chứng anti-phospholipid thứ phát: Hội chứng anti-phospholipid sau hoặc kèm theo:

+ Tắc mạch từ 3 tổ chức, cơ quan trở lên;

+ Các biểu hiện xảy ra đồng thời hoặc không quá một tuần;

+ Xét nghiệm có kháng thể kháng phospholipid

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

Các loại kháng thể trong hội chứng phospholipid đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thập kỷ 20, nhưng phải đến đầu những năm 1980, các nghiên cứu về hội chứng antiphospholipid và liên quan đến sảy thai liên tiếp ở phụ nữ mới được các nhà y học quan tâm Năm 1983, Meeling Boey và các đồng nghiệp đã báo cáo trong BMJ một loạt bệnh nhân SLE bị huyết khối, sảy thai tái phát và/hoặc giảm tiểu cầu Cũng trong năm này, Graham Hughes và các cộng sự của mình đã có những nghiên cứu bước đầu về kháng thể kháng Cardiolipin ở những bệnh nhân SLE và thấy có mối liên quan đến tình trạng huyết khối và sảy thai liên tiếp ở phụ nữ Từ đó, thuật ngữ hội chứng antiphospholipid bắt đầu được nhắc đến Sau đó một loạt các nghiên cứu về APS ra đời, các tiêu chuẩn và xếp loại APS cũng dần được hoàn thiện và sửa đổi bổ sung liên tục Tỷ lệ xuất hiện các loại kháng thể cũng được nhiều nghiên cứu thống kê lại Qua đó, sự lưu hành của kháng thể kháng phospholipid trong cộng đồng là dưới 1% Sự lưu hành các tự kháng thể tăng lên theo tuổi và kháng thể kháng phospholipid cũng không phải là ngoại lệ, kháng thể kháng phospholipid được báo cáo ở 10 – 20 % ở người già khỏe mạnh [6][37][38][39][40]

Trong các bệnh tự miễn, đặc biệt SLE thì tỉ lệ APS cũng như sự lưu hành của các kháng thể kháng phospholipid là rất cao Theo nghiên cứu Euro – Lupus cho thấy 24% kháng thể kháng cardiolipin (aCL) type IgG, 13% aCL IgM và 15% có kháng thể kháng đông lupus (LA) trong số 1000 bệnh nhân SLE Trong nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng tần suất APS tăng lên từ 10 đến 23% sau 15 - 18 năm trong một nhóm thuần tập lớn bệnh nhân SLE [6]

Trong nhóm bệnh nhân tắc tĩnh mạch không chọn lọc, tần suất của aCL thay đổi từ 3-17% và 3-14% với LA Kháng thể kháng phospholipid gặp

khoảng 18% ở bệnh nhân trẻ dưới 40 tuổi đột quỵ, trái lại, trong nghiên cứu APASS chỉ ra rằng 9,7% bệnh nhân lần đầu đột quỵ có aCL dương tính Ở các bệnh nhân nhồi máu cơ tim, tỉ lệ lưu hành các kháng thể kháng phospholipid thay đổi từ 5-15% Nhiều nghiên cứu mô tả cắt ngang được báo cáo có mối liên quan giữa kháng thể aCL và hoặc LA với tình trạng sảy thai liên tiếp (khoảng 10-20%) [6]

Nghiên cứu của Pengo và cộng sự năm 2005 về kháng thể trong hội chứng APS nhận thấy nguy cơ mắc huyết khối ở những bệnh nhân có nhiều kháng thể dương tính cao hơn so với những bệnh nhân chỉ dương tính với 1 kháng thể Những bệnh nhân có cả ba kháng thể dương tính có nguy cơ mắc huyết khối cao gấp hơn 3 lần so với bệnh nhân có 1 kháng thể dương tính Kết quả được tóm tắt trên Bảng 2.1

Bảng 1.2 Nguy cơ mắc huyết khối ở BN theo dữ liệu về kháng thể aPL

Các loại kháng thể Huyết

khối (n=340) (%)

Không

có Huyết khối (n=278) (%)

Tỷ lệ chênh lệch

Đơn biến

1,2

0,8 0,3 –

2,1 LAC-/aCL-/aGPI+ 4 (1) 4 (1) 0,9 0,2 –

Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu về APS bắt đầu được các nhà sản khoa

và tim mạch quan tâm từ năm 2009 [41][42] Nghiên cứu của Lê Thị Phương Lan, Nguyễn Thị Minh Nguyệt tại Bệnh viện Phụ sản Trung ương giai đoạn 2009-2011 cho thấy 13,7% bệnh nhân có thai kém phát triển và sảy thai liên tiếp có kháng thể kháng phospholipid [42] Năm 2015, nghiên cứu của Cung Thị Thu Thuỷ và cộng sự cho thấy có đến 47,9% bệnh nhân có tiền sử sảy thai liên tiếp dương tính với một trong ba loại kháng thể (LA, aCL, aGPI); 23,4% bệnh nhân dương tính với kháng thể kháng phospholipid lần 2; 24,5% bệnh nhân âm tính với kháng thể sau 12 tuần [2] Ngoài ra, các nghiên cứu về APS tại Việt Nam vẫn đang tiếp tục được tiến hành trên các đối tượng bệnh nhân SLE và các bệnh nhân có chẩn đoán xác định APS

CHƯƠNG 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

501 bệnh nhân được chỉ định xét nghiệm tìm kháng thể kháng phospholipid tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương từ 1/2017 - 12/2018 ( 24 tháng)

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu:

- Bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng nghi ngờ APS hoặc có kết quả xét nghiệm rAPTT kéo dài, được chỉ định các xét nghiệm sàng lọc APS lần đầu tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương

- Mẫu xét nghiệm đảm bảo tiêu chuẩn của phòng xét nghiệm, mẫu được

ly tâm hai lần với tốc độ 2500 vòng/phút trong 10 phút để loại trừ yếu tố tiểu cầu và được xét nghiệm ngay trong vòng 4 giờ đồng hồ kể từ sau khi lấy máu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:

- Bệnh nhân có rối loạn đông máu bẩm sinh như: Hemophilia A, Hemophilia B, Hemophilia C…

- Bệnh nhân đang sử dụng các thuốc chống đông, thuốc kháng vitamin

K, heparin standard, hidroxil chloroquine

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu hồi cứu, tiến cứu, mô tả cắt

ngang, có theo dõi dọc

2.2.2 Chọn mẫu: Theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện thỏa mãn

tiêu chuẩn chọn mẫu

p là tỷ lệ người có kháng thể kháng phospholipid trong những người được chỉ định kiểm tra, chọn p=0.5 để có cỡ mẫu lớn nhất

q là tỷ lệ không có kháng thể kháng phospholipid, q=1-p= 0.5

d là độ chính xác mong muốn, d= 0,05

Thay số vào công thức, tính ra n = 384

2.2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.2.3.1 Bệnh phẩm

Máu ngoại vi:

- 2 ml máu tĩnh mạch chứa trong ống chống đông bằng Natri citrate 3,2% với tỷ lệ máu/chống đông 9/1

Mẫu được ly tâm hai lần với tốc độ 2500 vòng/phút trong 10 phút để

loại trừ yếu tố tiểu cầu

- 2 ml máu tĩnh mạch chứa trong ống chống đông EDTA K2 để làm xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi

2.2.3.2 Phương tiện, dụng cụ nghiên cứu

- Ống chống đông Natri Citrate 3,2%, EDTA K2

- Ống nghiệm các loại, pipetmann, đầu côn, giá xét nghiệm

- Hệ thống máy đông máu ACL Top

- Máy ly tâm của hãng Kubota

- Bình ủ 370C

- Hệ thống máy đếm tế bào tự động DxH 600

- Hệ thống máy miễn dịch tự động Liaison

2.2.3.3 Hóa chất - sinh phẩm

 Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm APTT:

APTT- SP của HemosIL bao gồm: APTT Reagent: 5 lọ x 9 ml dung

dịch đệm, thuốc thử phospholipid tổng hợp, chất kích hoạt silica, chất ổn định

và chất bảo quản; Calcium Choride: 5 lọ x 8 ml dung dịch canxi clorua

(0,025M)

 Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm Fibrinogen:

Fibrinogen-C XL của HemosIL bao gồm: Bovine thrombin: 10 lọ x 5

ml thrombin chiết xuất từ bò đông khô (35 UNIH/ ml ) với albumin, canxi

clorua, đệm và các chất ổn định

 Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm PT:

RecombiPlastin 2G của HemosIL bao gồm: RecombiPlasTin 2G

(RTF): 5 x 20 ml lọ đông khô yếu tố mô tái tổ hợp người (RTF), phospholipid tổng hợp với chất bảo quản, chất ổn định và dung dịch đệm; RecombiPlasTin 2G pha loãng (RTF pha loãng): 5 x 20 ml lọ dung dịch calcium chloride,

polybrene và chất bảo quản

 Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm TT:

Thrombin Time của HemosIL bao gồm: Buffer: 1 lọ x 9 ml hóa chất cô

đặc calcium chloride (0,5 Mol/L), đệm và chất bảo quản; Bovine thrombin: 4

lọ x 5 hóa chất dạng khô thrombin của bò (15 UNIH/lọ) có thành phần bao

gồm albumin của bò và đệm

 Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm D-Dimer:

D-Dimer HS 500 của HemosIL bao gồm: Latex Reagent: 3 lọ x 4 ml

hỗn dịch hạt latex phủ mảnh F(ab’)2 của kháng thể đơn dòng chuột (MA - 8D3) đặc hiệu với kháng nguyên D-Dimer, albumin huyết thanh bò, đệm, chất

ổn định và chất bảo quản; Reaction Buffer: 3 lọ x 6 ml đệm Hepes chứa

albumin huyết thanh bò, đệm, chất ổn định và chất bảo quản

 Hóa chất – sinh phẩm để làm xét nghiệm Lupus AntiCoagulant:

- LA Screen: Chế phẩm đông khô chứa nọc rắn Russell, một lượng

nhỏ phospholipid, canxi, polybrene, đệm, chất ổn định, chất tạo màu và chất bảo quản

- LA Confirm: Chế phẩm đông khô chứa nọc rắn Russell, một lượng

dư phospholipid, canxi, polybrene, đệm, chất ổn định, chất tạo màu và chất bảo quản

 Hoá chất - sinh phẩm để làm xét nghiệm Anti-Cardiolipin:

- Một hộp anti-Cardiolipin IgG bao gồm: Một lọ hạt từ phủ Cardiolipin của bò và β2-Glycoprotein tinh khiết của con người, một lọ dung dịch đệm, một lọ kháng kháng thể IgG gắn chất huỳnh quang, một lọ chất pha loãng

- Một hộp anti-Cardiolipin IgM bao gồm: Một lọ hạt từ phủ Cardiolipin của bò và β2-Glycoprotein tinh khiết của con người, một lọ dung dịch đệm, một

lọ chất kháng kháng thể IgM gắn với chất huỳnh quang, một lọ chất pha loãng

 Hoá chất - sinh phẩm để làm xét nghiệm Anti β2-Glycoprotein I:

- Một hộp Anti β2-Glycoprotein I IgG bao gồm: Một lọ hạt từ phủ β2Glycoprotein tinh khiết của con người, một lọ dung dịch đệm, một lọ kháng kháng thể IgG gắn chất huỳnh quang, một lọ chất pha loãng

Một hộp Anti β2 Glycoprotein I IgM bao gồm: Một lọ hạt từ phủ β2Glycoprotein tinh khiết của con người, một lọ dung dịch đệm, một lọ kháng

-kháng thể IgM gắn chất huỳnh quang, một lọ chất pha loãng

 Hoá chất - sinh phẩm để làm xét nghiệm tổng phân tích tế bào

máu ngoại vi:

Bộ hóa chất gồm 05 hộp: Coulter DxH Diluent, Coulter DxH Retic Pack, Coulter DxH Diff Pack, Coulter DxH Cleaner, Coulter DxH Cell

Lyse

2.2.3.4 Các phương pháp, kỹ thuật thực hiện xét nghiệm

 Các xét nghiệm đông máu được thực hiện theo quy trình chuẩn tại khoa Đông cầm máu, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương và được đánh giá bởi bác sỹ chuyên khoa

- Xét nghiệm APTT thực hiện trên máy ACL Top:

Xét nghiệm APTT trên hệ thống máy xét nghiệm đông máu ACL TOP

700 dựa trên nguyên tắc đo phát hiện điểm đông Kỹ thuật này đánh giá dựa vào sự thay đổi mật độ quang tại điểm cuối quá trình đông máu

+ Phương pháp: Bổ sung một lượng vừa đủ APTT reagent (thành phần

có phospholipid tổng hợp và chất kích hoạt silica) vào mẫu huyết tương nghèo tiểu cầu, ủ ở 37ºC trong một khoảng thời gian nhất định Sau đó calci

được thêm vào để kích hoạt con đường đông máu nội sinh Thời gian tính từ lúc cho calci vào tới lúc hình thành điểm đông

- Xét nghiệm Fibrinogen thực hiện trên máy ACL Top:

Xét nghiệm Fibrinogen trên hệ thống máy xét nghiệm đông máu ACL TOP 700 dựa trên nguyên tắc đo phát hiện điểm đông Kỹ thuật này đánh giá dựa vào sự thay đổi mật độ quang tại điểm cuối quá trình đông máu

+ Phương pháp: Thrombin có tác dụng chuyển fibrinogen thành fibrin, tạo cục đông Dựa vào đó, người ta pha loãng huyết tương của bệnh nhân và

sử dụng một lượng thừa thrombin để chuyển toàn bộ fibrinogen thành fibrin,

đo thời gian đông Thời gian đông phụ thuộc vào hàm lượng fibrinogen trong huyết tương, qua đó tính được nồng độ fibrinogen

- Xét nghiệm PT thực hiện trên máy ACL Top:

Xét nghiệm PT-RP trên hệ thống máy xét nghiệm đông máu ACL TOP

700 dựa trên nguyên tắc đo phát hiện điểm đông Kỹ thuật này đánh giá dựa vào sự thay đổi mật độ quang tại điểm cuối quá trình đông máu

+ Phương pháp: Thời gian Prothrombin (PT) được thực hiện bằng cách cho vào huyết tương bệnh nhân đã được chống đông bằng natri citrate một lượng thuốc thử Thromboplastin 2G chứa yếu tố mô tái tổ hợp người (RTF), phospholipid tổng hợp và calcium nhằm kích hoạt đường đông máu ngoại sinh Thời gian từ lúc cho thuốc thử chứa calcium vào tới lúc hình thành cục đông gọi là thời gian Prothrombin

- Xét nghiệm TT thực hiện trên máy ACL Top:

Thrombin có tác dụng chuyển fibrinogen thành fibrin, tạo cục máu đông Sử dụng thrombin nồng độ thích hợp để đo thời gian hình thành fibrin

sẽ cho phép đánh giá khả năng và tốc độ chuyển fibrinogen thành fibrin

+ Phương pháp: Thời gian Thrombin (TT) được thực hiện bằng cách cho vào huyết tương bệnh nhân đã được chống đông bằng natri citrate một lượng thuốc thử Thrombin chứa albumin từ bò, Calcium chloride và dung dịch đệm nhằm kích hoạt quá trình đông máu Thời gian tính từ lúc cho thuốc thử vào tới lúc hình thành cục đông là thời gian Thrombin

- Xét nghiệm D-Dimer thực hiện trên máy ACL Top:

Xét nghiệm D-Dimer được thực hiện dựa trên phương pháp miễn dịch

đo độ đục trên hệ thống máy đông máu tự động

+ Phương pháp: Khi ủ huyết tương của bệnh nhân với hỗn dịch gồm hạt Latex đã gắn kháng thể đặc hiệu với kháng kháng nguyên D-Dimer, D-Dimer trong huyết tương của bệnh nhân sẽ được gắn kháng thể đặc hiệu ở trên các hạt latex dẫn tới hiện tượng ngưng kết, mức độ ngưng kết tỷ lệ với nồng độ D-Dimer trong huyết tương bệnh nhân và được đo dựa vào sự thay đổi mật độ quang

- Xét nghiệm kháng đông nội sinh thực hiện trên máy ACL Top:

Xét nghiệm mixing test về bản chất thực hiện xét nghiệm giống với xét nghiệm APTT Thực hiện xét nghiệm mixing test là pha trộn huyết tương của bệnh nhân với huyết tương của người bình thường với tỉ lệ 1:1 và chạy xét nghiệm APTT trước và sau khi ủ ở nhiệt độ 37°C trong 2 tiếng để phát hiện kháng đông lưu hành khi bệnh nhân có bất thường đông máu dựa vào khả năng bù của các yếu tố đông máu

- Xét nghiệm Lupus AntiCoagulant trên máy ACL Top:

Đối với mỗi lô hoá chất dRVVT screen và dRVVT confirm mới đều có giá trị chứng được tính bằng giây theo khuyến cáo của CLSI

Máu được chống đông bằng natricitrat 3,2%, ly tâm tách lấy huyết tương nghèo tiểu cầu, ủ ở nhiệt độ 37°C trong vòng 90 đến 150 giây, sau đó trộn với hoá chất dRVVT screen hoặc dRVVT confirm theo tỷ lệ 1:1 Nọc rắn trong hoá chất sẽ kích hoạt yếu tố X cùng calci bắt đầu quá trình đông máu Máy xét nghiệm dùng phương thức phát hiện ánh sáng tán xạ để đo thời gian đông máu huyết tương kết hợp với giá trị chứng theo công thức dưới đây để tính ra kết quả cuối cùng

Công thức tính như sau:

dRVVT Screen Ratio =

dRVVT Confirm Ratio =

Kết quả cuối cùng được tính toán dựa trên tỉ lệ giữa kết quả dRVVT screen và dRVVT confirm:

Normalized dRVVT Ratio =

Dương tính khi tỷ lệ LA screen/LA confirm ( Normalized dRVVT Ratio) ≥ 1,4

- Xét nghiệm Anti Cardiolipin trên máy Acustar:

Các xét nghiệm định lượng Anti Cardiolipin trên hệ thống HemosIL

AcuStar kháng thể kháng phospholipid là các xét nghiệm miễn dịch hoàn toàn

tự động, dựa trên công nghệ hóa sinh Các hạt từ tính được phủ bằng kháng nguyên cardiolipin và ß2- Glycoprotein Các hạt từ tính được phủ kháng nguyên bắt các kháng thể IgG hoặc IgM, nếu có trong mẫu Một loại kháng thể thứ hai có trong hoá chất được đánh dấu isoluminol huỳnh quang sau đó liên kết với các kháng thể bị bắt; dẫn đến sự phát xạ ánh sáng tương ứng với nồng độ của các kháng thể

- Xét nghiệm Anti β2 - glycoprotein trên máy Acustar:

Các xét nghiệm định lượng Anti β2-glycoprotein trên hệ thống HemosIL AcuStar kháng thể kháng phospholipid là các xét nghiệm miễn dịch hoàn toàn tự động, dựa trên công nghệ hóa sinh Các hạt từ tính được phủ bằng ß2GPI Các hạt từ tính được phủ kháng nguyên bắt các kháng thể IgG hoặc IgM, nếu có trong mẫu Một loại kháng thể thứ hai có trong hoá chất được đánh dấu isoluminol huỳnh quang sau đó liên kết với các kháng thể bị bắt; dẫn đến sự phát xạ ánh sáng tương ứng với nồng độ của các kháng thể

- Xét nghiệm đếm số lượng tiểu cầu:

Xét nghiệm được thực hiện trên máy DXH 600 tại khoa Tế bào – Tổ

chức học, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương

Máu toàn phần được pha loãng sau đó đưa vào hệ thống đếm tế bào tự động Số lượng tiểu cầu được đếm theo nguyên lý trở kháng Với số lượng máu được pha loãng biết trước, từ đó tính ra số lượng tiểu cầu trên 1 đơn vị thể tích máu toàn phần

2.3 CÁC TIÊU CHUẨN ÁP DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tiêu chuẩn về giá trị xét nghiệm

Các tiêu chuẩn về giá trị xét nghiệm được tổng hợp trong Bảng 2.1 [10]

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn giá trị xét nghiệm thực hiện trong nghiên cứu

Tỷ lệ LA screen/LA confirm 1,4 Dương tính

8 Anti β2 -

glycoprotein

Kháng thể kháng IgG/IgM < 20U/ml Bình thường Kháng thể kháng IgG/IgM ≥ 20U/ml Dương tính

9 Anti

Cardiolipin

Kháng thể kháng IgG/IgM < 20U/ml Bình thường Kháng thể kháng IgG/IgM ≥ 20U/ml Dương tính

2.3.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán APS

Hiện nay thế giới áp dụng tiêu chuẩn Sydney 2006 trong chẩn đoán APS [33]:

Chẩn đoán hội chứng kháng phospholipid khi có ít nhất một tiêu chuẩn lâm sàng và một tiêu chuẩn xét nghiệm

a Tiêu chuẩn lâm sàng:

- Tắc mạch: Một hoặc nhiều lần tắc động, tĩnh mạch hoặc mạch nhỏ ở bất kỳ cơ quan tổ chức nào Tắc mạch phải được chẩn đoán bằng mô bệnh học

và không có biểu hiện của phản ứng viêm trên thành mạch

- Có một hoặc nhiều lần thai hơn 10 tuần, có hình thể bình thường chết lưu hoặc sảy Hình thể bình thường có thể dựa vào siêu âm

- Một hoặc nhiều lần đẻ non trước 34 tuần, thai có hình thể bình thường, do các nguyên nhân sau: Sản giật, tiền sản giật nặng, bánh rau có dấu hiệu kém phát triển

- Có từ 3 lần sảy thai liên tiếp trở lên, tuổi thai đến 10 tuần, loại trừ những trường hợp bất thường về giải phẫu hoặc nội tiết của mẹ, bất thường nhiễm sắc thể của bố mẹ

b Tiêu chuẩn xét nghiệm:

- Kháng thể lupus Anticoagulant có trong huyết tương

- IgG và/hoặc IgM của kháng thể kháng cardiolipin trong huyết thanh hoặc trong huyết tương với nồng độ trung bình hoặc cao

- IgG và/hoặc IgM của kháng thể β2 Glycoprotein-I trong huyết tương với nồng độ trung bình hoặc cao

Tất cả các kháng thể này đều phải tồn tại ở ít nhất 2 lần xét nghiệm cách nhau ít nhất 12 tuần

a Tiêu chuẩn xếp loại hội chứng APS:

- Hội chứng Anti phospholipid tiên phát: Là hội chứng Anti phospholipid không tìm thấy được nguyên nhân hoặc bệnh lý phối hợp

- Hội chứng Anti phospholipid thứ phát: Là hội chứng Anti phospholipid mắc phải, thứ phát sau một bệnh nào đó như Lupus ban đỏ hệ thống, các bệnh tự miễn, các bệnh cảm ứng do thuốc: Irocainamid, quinidine, penicillin… Các bệnh ác tính: Lơ xê mi, tăng sinh lympho, tăng sinh dòng plasmo, khối u đặc, tăng tiểu cầu tiên phát; các bệnh nhiễm trùng, bệnh lý về

thần kinh, gan, mạch, suy thận [1][28]

2.4 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH XÉT NGHIỆM

- Thu thập mẫu bệnh phẩm từ các khoa lâm sàng

- Xét nghiệm Fibrinogen, PT, APTT, TT, số lượng tiểu cầu, định lượng D-Dimer

- Xét nghiệm phát hiện chất ức chế đường đông máu nội sinh không phục thuộc thời gian nhiệt độ

- Thực hiện các xét nghiệm LA, kháng thể kháng β2glycoprotein, kháng thể kháng cardiolipin

- Thu thập thông tin lâm sàng của bệnh nhân: Tuổi, giới, chẩn đoán

- Thu thập số liệu xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid được làm lại sau 12 tuần ở một số bệnh nhân

- Phân tích và xử lý số liệu

2.5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương,

giai đoạn 2017-2018 Số liệu được thực hiện trên tổng số 501 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ APS hoặc xét nghiệm có rAPTT kéo dài, kháng đông nội sinh dương tính, được chỉ định xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid lần đầu tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương

+ Sự xuất hiện kháng thể kháng phospholipid phân bố ở các nhóm bệnh nhân

+ Đặc điểm một số xét nghiệm đông máu và kháng thể kháng phospholipid: Tỷ lệ dương tính, sự phối hợp các kháng thể, đặc điểm của các xét nghiệm đông máu với sự xuất hiện của kháng thể kháng phospholipid

- Theo dõi diễn biến động học kháng thể kháng phospholipid ở một số bệnh nhân sau 12 tuần: Số liệu được thực hiện trên 48 bệnh nhân được chỉ định lại xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid sau 12 tuần (đã có can thiệp điều trị): So sánh tỷ lệ xuất hiện kháng thể trước và sau 12 tuần

2.6 PHÂN TÍCH, XỬ LÝ SỐ LIỆU

Các dữ liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê y học với phần mềm SPSS 22.0 và Excel 2010

2.7 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích nghiên cứu tình hình và đặc điểm xét nghiệm kháng thể kháng phospholipid được thực hiện tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương nhằm góp phần nâng cao chất lượng xét nghiệm và chẩn đoán bệnh Tất cả các xét nghiệm chỉ được thực hiện với các mẫu bệnh phẩm, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe và thể trạng của người bệnh Nghiên cứu được sự đồng ý của Ban lãnh đạo, hội đồng khoa học và khoa Đông cầm máu, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương Bệnh nhân và gia đình bệnh nhân tự nguyện tham gia vào nghiên cứu, được bảo mật thông tin

cá nhân và sức khỏe