Đánh giá khả năng sống sót trong dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang nhỏ giọt alginat tinh bột bao chitosan chứa lactobacillus acidophilus

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THANH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HĨA MƠ PHỎNG CỦA VI NANG NHỎ GIỌT ALGINAT – TINH BỘT BAO CHITOSAN CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THANH MÃ SINH VIÊN: 1301368 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HĨA MƠ PHỎNG CỦA VI NANG NHỎ GIỌT ALGINAT – TINH BỘT BAO CHITOSAN CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Đàm Thanh Xuân DS Nguyễn Thị Ngọc Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dƣợc HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực hoàn thành tổ Vi sinh - Bộ mơn Cơng nghiệp Dược Trong thời gian thực khóa luận, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cơ, bạn bè gia đình Với tất kính trọng lòng biết ơn, tơi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Đàm Thanh Xuân DS Nguyễn Thị Ngọc, người thầy ln tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ từ ngày hồn thành khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn thầy cô giáo anh chị kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dƣợc Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho thời gian học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè động viên, ủng hộ tơi q trình học tập sống Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2018 Sinh viên Đỗ Thị Thanh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến 1.1.3 Các hệ bào chế chế phẩm probiotic 1.2 Loài Lactobacillus acidophilus 1.2.1 Đặc điểm hình thái điều kiện ni cấy 1.2.2 Vai trò 1.2.3 Các chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus 1.3 Tổng quan vi nang hóa 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Đặc điểm vi nang 1.3.3 Ưu điểm vi nang 1.3.4 Nhược điểm vi nang 1.3.5 Phương pháp vi nang hóa 1.3.6 Phương pháp nhỏ giọt đông tụ 1.4 Một số thành phần sử dụng vi nang probiotic 1.4.1 Alginat 1.4.2 Tinh bột 10 1.4.3 Chitosan 11 1.5 Một số nghiên cứu sử dụng vi nang calci alginat phối hợp với tinh bột chitosan 12 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu thiết bị 14 2.1.1 Chủng vi sinh vật 14 2.1.2 Hóa chất 14 2.1.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 14 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 15 2.1.5 Các dung dịch sử dụng nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp giai đoạn 16 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan dịch tiêu hóa mơ 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 16 2.3.2 Phương pháp nhân giống 17 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy 17 2.3.4 Phương pháp tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan giai đoạn 17 2.3.5 Phương pháp đông khô 18 2.3.6 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV 18 2.3.7 Phương pháp xác định hàm ẩm 19 2.3.8 Phương pháp xác định hoạt độ nước vi nang 20 2.3.9 Phương pháp xác định hình ảnh kích thước vi nang 20 2.3.10 Phương pháp định tính chitosan vi nang đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) 20 2.3.11 Phương pháp đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV dịch tiêu hóa mơ 20 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 21 3.1 Tạo vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp giai đoạn 21 3.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan dịch tiêu hóa mơ 21 3.2.1 Định tính chitosan vi nang Alg-TB bao chitosan sau thử nghiệm dịch dày mô 34 3.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang Alg-TB bao chitosan dịch tiêu hóa mơ 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Alg : Alginat ATCC : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) B bifidum : Bifidobacterium bifidum B longum : Bifidobacterium longum CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units) Chi : Chitosan FAO : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) kl/tt : Khối lượng/thể tích L acidophilus : Lactobacillus acidophilus L casei : Lactobacillus casei L gasseri : Lactobacillus gasseri L rhamnosus : Lactobacillus rhamnosus LAB : Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacterium) MRS : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe) MT : Môi trường SGF : Dịch dày mô (Simulated Gastric Fluid) SIF : Dịch ruột mô (Simulated Intestinal Fluid) TB : Tinh bột VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật WHO : Tổ chức y tế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên liệu hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Hoạt độ nƣớc vi nang Alg-TB bao chitosan sau đông khô trình bảo quản 26 Bảng 3.2 Độ ẩm vi nang Alg-TB bao chitosan sau đơng khơ q trình bảo quản 27 Bảng 3.3 Số lƣợng tế bào L acidophilus vi nang Alg-TB bao chitosan sau đông khô trình bảo quản 29 Bảng 3.4 Số lƣợng VSV sống sót vi nang sau đơng khơ, dịch acid sau ủ SGF vi nang sau ủ SIF 37 Bảng 3.5 Số lƣợng VSV sống sót ban đầu sau ủ dịch tiêu hóa mơ chế phẩm Antibio Pro 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Hình 1.2 Cấu trúc alginat Hình 1.3 Sự hình thành cấu trúc calci alginat 10 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử chitin chitosan 11 Hình 3.1 Vi nang Alg-TB bao Chi quan sát camera thƣờng 22 Hình 3.2 Vi nang Alg-TB bao Chi dƣới kính lúp soi có độ phóng đại 10X 22 Hình 3.3 Hình ảnh so sánh phổ IR chitosan nguyên liệu (CS) với vi nang đƣợc tạo thành theo phƣơng pháp giai đoạn 24 Hình 3.4 Hoạt độ nƣớc vi nang Alg-TB bao chitosan sau đơng khơ q trình bảo quản 26 Hình 3.5 Độ ẩm trung bình mẫu vi nang Alg-TB bao Chi sau đơng khơ q trình bảo quản 28 Hình 3.6 Số lƣợng VSV trung bình mẫu vi nang Alg-TB bao chitosan sau đông khô trình bảo quản 30 Hình 3.7 Hình ảnh so sánh phổ IR chitosan nguyên liệu với vi nang M1, M2 M3 33 Hình 3.8 Vi nang trƣớc sau ủ SGF (có bổ sung pepsin) 36 Hình 3.9 Vi nang sau ủ SGF (có bổ sung pepsin) sau ủ SIF (có bổ sung pancreatin) 36 Hình 3.10 Số lƣợng VSV đƣợc giải phóng sau ủ dịch tiêu hóa mơ vi nang Alg-TB bao chitosan chế phẩm Antibio Pro 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus biết đến vi khuẩn có lợi, sử dụng nhiều làm nguyên liệu chế phẩm probiotic Khi đưa vào thể người, probiotic mang lại tác dụng kích thích tiêu hóa, ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, tăng cường miễn dịch, giảm cholesterol máu,… [36] Lactobacillus acidophilus phải đạt số lượng đầy đủ sau uống để phát huy tác dụng có lợi Tuy nhiên, trình chế biến bảo quản, vi khuẩn dễ bị yếu tố mơi trường bên ngồi độ ẩm, nhiệt độ, áp suất, pH, hydrogen peroxid, oxy hòa tan,… tác động gây giảm số lượng vi khuẩn sống sót [29] Nhiều nghiên cứu thực nhằm tăng cường khả chống chịu vi khuẩn trước điều kiện bất lợi môi trường Phương pháp tạo vi nang calci alginat – tinh bột đông khô phương pháp đơn giản, sử dụng phổ biến nay, có khả bao gói lượng lớn vi khuẩn, cải thiện số lượng VK sau đông khô, bảo vệ VK thời gian bảo quản qua môi trường khắc nghiệt đường tiêu hóa [35] Việc bổ sung thêm chitosan bao bên ngồi giúp tạo lớp áo bảo vệ vi nang tốt tác động acid dày [41] Phương pháp có ưu điểm an tồn, khơng độc, bào chế đơn giản, vi nang tạo thành có độ đồng cao Xuất phát từ lí trên, đề tài “Đánh giá khả sống sót dịch tiêu hóa mô vi nang nhỏ giọt alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus” thực với mục tiêu sau: Tạo vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp giai đoạn Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang calci alginat tinh bột bao chitosan dịch tiêu hóa mô CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng probiotic 1.1.1 Định nghĩa Lịch sử nghiên cứu probiotic manh nha từ năm cuối kỉ 19, nhà vi sinh vật học phát khác biệt hệ VSV đường tiêu hóa người khỏe mạnh người bệnh Thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, “biotic” có nghĩa “sự sống” “probiotic” có nghĩa “dành cho sống” Lilly Stillwell (1965) sử dụng thuật ngữ để mô tả “các chất tiết VSV nhằm kích thích phát triển VSV khác” Sau đó, thuật ngữ phát triển rộng rãi Theo đó, Parker (1974), đề xuất probiotic “sinh vật chất góp phần vào cân vi sinh vật đường ruột” [15] Đến năm 2002, Tổ chức Y tế giới (WHO) tổ chức Nông lương giới (FAO) đưa định nghĩa ngắn gọn hoàn chỉnh probiotic sau: “Probiotic vi sinh vật sống mà đưa vào thể với lượng đủ lớn đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [27] Định nghĩa probiotic Hiệp hội khoa học quốc tế Probiotics Prebiotics (ISAPP) áp dụng sử dụng hầu hết ấn phẩm khoa học Đối với chế phẩm probiotic, hiệu phụ thuộc vào liều lượng khả tồn trình vận chuyển qua điều kiện có tính acid dày, không bị thủy phân enzym muối mật ruột non [26], [36] Tuy nhiên, trình chế biến, bảo quản sử dụng, probiotic bị ảnh hưởng nhiều điều kiện bất lợi trình sản xuất, mơi trường bên ngồi mơi trường đường tiêu hóa [24] Vì vậy, để mang lại hiệu quả, vi sinh vật phải ổn định chế phẩm suốt trình bảo quản, trì số lượng sống sót mức tối thiểu 107-109 CFU/g [14] 1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến Các tính chất quan trọng chủng giống để sử dụng sản xuất probiotic bao gồm: đề kháng với acid dày (pH 1-4), kháng acid mật, bám dính chất nhầy và/hoặc tế bào biểu mơ người dòng tế bào, hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn nấm gây bệnh bám dính vào bề mặt, hoạt tính hydrolase muối mật, tăng cường khả tồn chế phẩm sinh học [51] Bàn luận: Bản chất cation chitosan (pKa ≈ 6,5) định nhóm –NH3+, chất anion alginat (pKa ≈ 3,4–3,7) kết diện nhóm –COO- Bản chất cation chitosan dẫn đến proton nhóm amin dung dịch có tính acid đến trung tính, chitosan bị hòa tan mơi trường acid Đó chìa khóa giải thích đặc tính sinh học chitosan, nhóm NH3+ chitosan dễ dàng liên kết với bề mặt tích điện âm màng nhầy, giúp tăng cường thuốc phân cực vận chuyển bề mặt biểu mô Khi bao vi nang calci alginat – tinh bột chitosan, phức hợp ion alginat chitosan hình thành tương tác nhóm carboxyl alginat với nhóm amin chitosan tạo thành lớp màng bề mặt vi nang [20], khiến chitosan khơng bị hòa tan thử nghiệm mơi trường có pH 3,0 Sự dịch chuyển nhẹ số sóng kết tương tác tĩnh điện Do đó, chitosan vi nang khơng bị hòa tan mơi trường dịch dày mô pH 3,0 Kết phù hợp với nghiên cứu Zanjani Theo Zanjani, pH dày ion Ca2+ trao đổi điện tích với ion H+ môi trường acid, làm ion Ca2+ khớp vào khoảng trống theo mơ hình “hộp trứng”, VSV thoát khỏi vi nang bị ảnh hưởng trực tiếp acid dày Vi nang có sử dụng chitosan, bổ sung lớp áo polycation bên tạo rào cản ion H+ môi trường acid Kết luận: Ủ dịch dày mơ khơng làm thất chitosan vi nang Sự có mặt chitosan tạo phức hợp bền vững với alginat, phức hợp làm giảm độ rỗng, tăng độ bền vững bảo toàn cấu trúc vi nang môi trường acid, làm giảm rò rỉ vi sinh vật, giúp bảo vệ VSV môi trường acid dày 3.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang Alg-TB bao chitosan dịch tiêu hóa mơ Chitosan bao bên vi nang tạo thành lớp áo, hạn chế tác động bất lợi acid dày, vào đến ruột, vi nang cần giải phóng VSV để đạt số lượng tối thiểu 106-107 CFU/g (theo tiêu chuẩn FAO/WHO chế phẩm probiotic) Do đó, nghiên cứu thiết kế để kiểm tra khả sống sót L acidophilus 34 bao gói vi nang Alg-TB bao chitosan dịch dày mơ khả giải phóng VSV khỏi vi nang dịch ruột mô a Mục tiêu: Khảo sát khả bảo vệ L acidophilus vi nang Alg-TB bao chitosan dịch dày khả giải phóng VSV dịch ruột mơ b Tiến hành: Tạo vi nang Alg-TB bao chitosan chứa L acidophilus, đông khô vi nang (phương pháp nêu mục 2.3.4, 2.3.5) Chuẩn bị dịch dày dịch ruột mô (phương pháp nêu mục 2.3.11) Cân xác 1,00 g vi nang đơng khơ vào bình nón chứa 100 ml dịch dày mô (SGF) pH 3,0 hấp tiệt khuẩn để nguội Mẫu vi nang ủ máy lắc 37ºC, tốc độ 75 vòng/phút Sau thời gian ủ, đánh giá trạng thái vi nang Tách riêng vi nang dịch acid Dịch acid xác định số lượng VSV sống sót phương pháp pha lỗng liên tục (phương pháp nêu mục 2.3.6) Vi nang chuyển vào bình nón có chứa dịch ruột mô (SIF) pH 6,8 hấp tiệt khuẩn Lắc vi nang giờ, tốc độ 75 vòng/phút, nhiệt độ 37ºC Sau giờ, đánh giá trạng thái vi nang xác định số lượng VSV sống sót phương pháp pha loãng liên tục Tiến hành so sánh mẫu vi nang với chế phẩm Antibio Pro thị trường (số lô 1108, ngày sản xuất: 29/03/2016, hạn sử dụng: 28/03/2019) Cân xác 1,00 g bột pha hỗn dịch chế phẩm, cho vào 20 ml dịch dày mô pH 3,0 hấp tiệt khuẩn, ủ máy lắc 37ºC, tốc độ 75 vòng/phút Sau thời gian ủ, bổ sung thêm 80 ml dịch ruột mô pH 6,8 tiếp tục lắc 37ºC, tốc độ 75 vòng/phút Đếm số lượng VSV sống sót sau ủ dịch tiêu hóa mơ chế phẩm phương pháp pha loãng liên tục c Kết quả: Kết hình ảnh vi nang trước sau ủ dịch tiêu hóa mơ thể hình 3.8 hình 3.9 35 Hình 3.8 Vi nang trƣớc sau ủ SGF (có bổ sung pepsin) Hình 3.9 Vi nang sau ủ SGF (có bổ sung pepsin) sau ủ SIF (có bổ sung pancreatin) 36 So sánh cảm quan bên vi nang sau giai đoạn thử nghiệm Vi nang đông khơ ban đầu chất khơ, cứng, giòn, bề mặt nhăn nhúm Sau ủ dịch dày mơ phỏng, vi nang trương nở, hình cầu đồng Tiếp tục ủ dịch ruột mô phỏng, vi nang trương nở to nứt vỡ thành mảnh to, thể chất mềm nhũn Số lượng VSV sống sót thời điểm ban đầu sau ủ dịch tiêu hóa mơ vi nang chế phẩm Antibio Pro thể bảng 3.4 bảng 3.5 Bảng 3.4 Số lƣợng VSV sống sót vi nang sau đơng khơ, dịch acid sau ủ SGF vi nang sau ủ SIF Số lƣợng VSV (log CFU/g) Mẫu Mẫu Mẫu Trung bình Trong vi nang sau đông khô Trong dịch acid sau ủ dịch dày mô (SGF) Trong vi nang sau ủ dịch ruột mô (SIF) 9,55 9,12 9,61 9,48 3,78 3,60 3,95 3,79 7,54 7,28 7,70 7,54 Bảng 3.5 Số lƣợng VSV sống sót ban đầu sau ủ dịch tiêu hóa mơ chế phẩm Antibio Pro Số lƣợng VSV (log CFU/g) Chế phẩm Antibio Pro Ban đầu 8,03 Sau ủ dịch tiêu hóa mơ 6,25 37 Hình 3.10 Số lƣợng VSV đƣợc giải phóng sau ủ dịch tiêu hóa mơ vi nang Alg-TB bao chitosan chế phẩm Antibio Pro Bàn luận: Thời điểm ban đầu sau đông khơ, vi nang chất khơ, cứng, giòn, bề mặt nhăn nhúm Sau ủ dịch dày mơ phỏng, vi nang trương nở, hình cầu đồng Điều giải thích sau: Thứ nhất, vi nang Alg-TB bao chitosan sử dụng tinh bột với nồng độ cao (10%), tiếp xúc với nước dịch dày mơ phỏng, tinh bột nhanh chóng hấp thụ nước tăng thể tích, làm vi nang trương nở lên Thứ hai, tương tác chitosan alginat giúp tạo lớp áo polycation bao phủ bên vi nang, với phương pháp tạo vi nang giai đoạn, lượng chitosan tương tác với alginat bị hạn chế chitosan bám bề mặt, khuếch tán thêm vào vi nang gắn với mạng gel bị hạn chế so với quy trình giai đoạn Do đó, lượng nhỏ ion H+, Na+ dịch dày mơ thâm nhập vào vi nang, thay ion Ca2+ mơ hình “hộp trứng”, làm giãn chuỗi liên kết, dẫn đến trương nở vi nang Sau ủ dịch ruột mô phỏng, vi nang trương nở to nứt vỡ thành mảnh nhỏ Lý giải cho tượng sau: Các ion Ca2+ liên kết với nhóm –COO- đơn vị polyguluronat alginat Trong giai đoạn đầu trình trương nở, lượng nhỏ ion Ca2+ có mặt đơn vị polyguluronat trao 38 đổi với ion H+, Na+ dịch dày, dẫn đến trương nở Trong giai đoạn sau, ion H+, Na+ thâm nhập sâu trao đổi với ion Ca2+ diễn mạnh mẽ hơn, dẫn đến trương nở mạnh tan rã cấu trúc vi nang [13] Kết bảng cho thấy, thời điểm sau đông khô, số lượng VSV mẫu vi nang đạt log CFU/g Sau ủ dịch dày mơ phỏng, có lượng nhỏ VSV rò rỉ khỏi vi nang sống sót với số lượng trung bình 3,79 log CFU/g Cụ thể 3,78 log CFU/g với mẫu 1, mẫu mẫu 3,60 3,95 Lý giải cho điều vi nang sau ủ dịch dày mô bị giãn chuỗi liên kết, trương nở, nên có lượng nhỏ VSV bị thất bên ngồi Tuy nhiên, tương tác alginat với lớp chitosan làm giảm độ rỗng vi nang làm giảm rò rỉ probiotic bao gói bên vi nang Do đó, có rò rỉ VSV khỏi vi nang số lượng VSV thất khơng đáng kể Sau ủ dịch ruột mô phỏng, kết số lượng VSV mẫu vi nang log CFU/g, cụ thể 7,54; 7,28 7,70 tương ứng với mẫu 1, 2, Điều cho thấy số lượng VSV giải phóng môi trường dịch ruột mô đạt 107 CFU/g, đáp ứng tiêu chuẩn FAO/WHO chế phẩm probiotic Trong dịch mật, phản ứng trao đổi ion xảy vi nang hấp thu muối mật, bao chitosan làm giảm khả thấm muối mật vào vi nang Do vậy, lớp chitosan cung cấp bảo vệ tốt dung dịch muối mật Kết phù hợp với nghiên cứu Mohammad Ali Khosravi Zanjani cộng (2014), tác giả đánh giá tồn của L casei dạng tự dịch dày mô Sau 120 phút, tỷ lệ sống L casei tự giảm từ 2,51×1011 xuống 1,10×103 CFU/ml, so sánh với L casei bao gói vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan, số lượng VSV giảm 6,30×107 CFU/ml sau Như vậy, vi nang calci alginat - tinh bột với lớp phủ chitosan cung cấp bảo vệ tốt cho VSV So sánh với chế phẩm Antibio Pro thị trường, với dạng bào chế bột pha hỗn dịch Thời điểm ban đầu số lượng VSV 8,03 log CFU/g, sau ủ dịch tiêu hóa mơ phỏng, số lượng sống sót giảm 6,25 log CFU/g Số lượng VSV trước sau ủ dịch tiêu hóa mơ chế phẩm thấp so với mẫu vi nang Alg-TB bao chitosan bào chế theo phương pháp giai đoạn Điều cho thấy vi nang Alg-TB bao chitosan cho khả bao gói trì số lượng VSV điều 39 kiện bảo quản tốt so với dạng bột, khả bảo vệ VSV khỏi tác động có hại acid dày giải phóng VSV ruột tốt so với dạng bột Nhận xét chung: Vi nang Alg-TB bao lớp chitosan bên để tạo thành lớp áo bảo vệ VSV tác động acid dày Khi ủ vi nang dịch dày mô phỏng, vi nang trương nở khơng bị thất chitosan Có lượng nhỏ VSV bị rò rỉ khỏi vi nang sau ủ SGF Sau ủ vi nang dịch ruột mô phỏng, vi nang trương nở to nứt vỡ thành mảnh lớn, số lượng VSV giải phóng đạt 107 CFU/g Khi so sánh vi nang Alg-TB bao chitosan với chế phẩm Antibio Pro thị trường, kết cho thấy khả bao gói, bảo vệ VSV khỏi tác động bất lợi acid dày, giải phóng VSV ruột vi nang Alg-TB bao chitosan chiếm ưu so với chế phẩm Antibio Pro 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài giải số mục tiêu sau: Tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus theo phƣơng pháp giai đoạn  Đã tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus phương pháp giai đoạn  Kết đánh giá vi nang sau đông khô:  Thể chất vi nang : Vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan sau đông khô có màu vàng, hình gần cầu, đường kính khoảng 2-3 mm, kích thước đồng Hạt có bề mặt tương đối nhẵn, thể chất khô, cứng, dễ tách rời  Định tính có mặt chitosan vi nang: Kết đo phổ IR cho thấy có xuất chitosan vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan  Độ ổn định vi nang trình bảo quản Vi nang sau đơng khơ có giá trị hoạt độ nước 0,1; hàm ẩm nhỏ 1%; mật độ VSV đạt khoảng 109 CFU/g, đáp ứng yêu cầu WHO/FAO chế phẩm probiotic Sau tháng bảo quản vi nang điều kiện nhiệt độ 2-8ºC, hoạt độ nước 0,1 Sau tháng bảo quản, hàm ẩm vi nang tăng nhẹ nằm giới hạn cho phép 5%, mật độ VSV giảm đạt mức cao > 108 CFU/g Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang Alg-TB bao chitosan dịch tiêu hóa mơ  Khi ủ vi nang dịch dày mơ phỏng, vi nang trương nở rò rỉ lượng nhỏ VSV Đo phổ hấp thụ IR thấy tồn chitosan vi nang Sau ủ vi nang dịch ruột mô phỏng, vi nang trương nở to nứt vỡ thành mảnh lớn, số lượng VSV giải phóng đạt 107 CFU/g  So sánh khả bảo vệ VSV dịch tiêu hóa mơ vi nang AlgTB bao chitosan với chế phẩm Antibio Pro thị trường với dạng bào chế bột pha hỗn dịch Kết cho thấy khả bao gói, bảo vệ VSV khỏi tác động bất lợi acid dày, giải phóng VSV ruột vi nang Alg-TB bao chitosan chiếm ưu so với chế phẩm Antibio Pro 41 ĐỀ XUẤT Do thời gian thực khóa luận hạn chế nên chúng tơi xin đưa đề xuất sau: - Tiếp tục nghiên cứu bào chế vi nang L acidophilus kết hợp với số probiotic khác để tạo thêm nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu ngày tăng sản phẩm probiotic - Tiếp tục nghiên cứu khả sống sót VSV vi nang Alg-TB bao chitosan dịch tiêu hóa mơ có bổ sung chất dinh dưỡng 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học Đỗ Quốc Cường (2009), Nâng cao chất lượng sữa chua phương pháp vi gói vi khuẩn lactic, Trường đại học Kỹ thuật công nghệ TP.HCM Nguyễn Lân Dũng (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, pp 221-228 Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp (2009), "Bàn việc đảm bảo khả sống sót vi sinh vật sản phẩm probiotic", Tạp chí dược học, 393, pp 2-5 Bùi Thị Kim Lanh (2017), Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang calci - alginat bao chitosan, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Văn Long (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, NXB Y học, Hà Nội, pp 112-128 Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế sinh dược học, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Văn Toàn (2017), Khảo sát ảnh hưởng chitosan đến số tính chất vi nang probiotic alginat - chitosan, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội 10 Đàm Thanh Xuân, Nguyễn Ngọc Chiến (2017), "Nghiên cứu khả bảo vệ Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 vi nang alginat - tinh bột bao chitosan", Số 492, Tạp chí dược học, pp 10-11, 28 11 Đàm Thanh Xuân, Nguyễn Ngọc Chiến cộng (2016), "Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics phương pháp đông tụ", Tạp chí Dược học, 481, pp 61-65 12 Đàm Thanh Xuân, Lê Ngọc Khánh (2016), "Đánh giá vai trò tinh bột sữa gầy đến trình tạo vi nang probiotic chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4356", Tạp chí Dược học, Bộ Y Tế, 56(487), pp 8-11 Tài liệu tiếng Anh 13 Adhiyaman Rajendran, Sanat Kumar Basu (2009), "Alginate-Chitosan Particulate System for Sustained Release of Nimodipine ", Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 8(5), pp 433-440 14 Alex van Belkum, Edward Nieuwenhuis E (2007), "Life in commercial probiotics", FEMS Immunol Med Microbiol, 50, pp 281-283 15 Amara A.A., Shibl A (2015), "Role of Probiotics in health improvement, infection control and disease treatment and management", Saudi Pharmaceutical Journal, 23(2), pp 107-114 16 Anal Anil Kumar, Singh Harjinder (2007), "Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery", Trends in Food Science & Technology, 18(5), pp 240-251 17 Anderson J W., Gilliland S E (1999), "Effect of fermented milk (yogurt) containing Lactobacillus acidophilus L1 on serum cholesterol in hypercholesterolemic humans", J Am Coll Nutr, 18(1), pp 43-50 18 B Vivek K (2013), "Use of encapsulated probiotics in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences, 3(1), pp 188-189 19 Bhardwaj T R., Kanwar M., et al (2000), "Natural gums and modified natural gums as sustained-release carriers", Drug Dev Ind Pharm, 26(10), pp 1025-38 20 Caetano Liliana A., António Almeida J., et al (2016), "Effect of Experimental Parameters on Alginate/Chitosan Microparticles for BCG Encapsulation", Mar Drugs, 14(5), pp 90 21 Chan Eng-Seng, al et (2011), "Effects of starch filler on the physical properties of lyophilized calcium–alginate beads and the viability of encapsulated cells", Carbohydrate Polymers, 83, pp 225-232 22 Chandramouli V1, Kailasapathy K., et al (2004), "An improved method of microencapsulation and its evaluation to protect Lactobacillus spp in simulated gastric conditions", J Microbiol Methods, 56(1), pp 27-35 23 Christopher Martoni, Jasmine Bhathena, et al (2007), "Investigation of Microencapsulated BSH Active Lactobacillus in the Simulated Human GI Tract", J Biomed Biotechnol, 2007, pp 13684 24 Delattre N., Saad C., et al (2013), "An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field", An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field, 50(1), pp 1-16 25 Ernö Pretsch, al et (2009), Structure determination of organic compounds: tables of spectral data, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp 269-335 26 FAO/WHO (2006), "Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the evaluation of probiotics in food" 27 FAO/WHO (2001), "Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria [Report of a joint FAO/WHO expert consultation]" 28 Fatih Ozgul, Imen Ahmed (2011), Lactic Acid Bacteria | Lactobacillus spp.: Lactobacillus acidophilus, Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition) pp 91-95 29 Favaro-Trindade C S., Grosso C R (2002), "Microencapsulation of L acidophilus (La-05) and B lactis (Bb-12) and evaluation of their survival at the pH values of the stomach and in bile", J Microencapsul, 19(4), pp 485-94 30 Ghulam Murtaza, Amir Waseem, et al (2011), "Alginate microparticles for biodelivery: A review", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(25), pp 2726-2737 31 Gombotz Wayne R., Wee SiowFong (1998), "Protein release from alginate matrices", Advanced Drug Delivery Reviews, 31(3), pp 267-285 32 Grant Gregor T., Edwin R MON/~]S., et al (1973), "Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: the egg-box mode", FEBS letters, 32(1), pp 195-198 33 Iyer C., Phillips M., et al (2005), "Release studies of Lactobacillus casei strain Shirota from chitosan‐coated alginate‐starch microcapsules in ex vivo porcine gastrointestinal contents", 41, pp 493–49 34 Jolanta Kumirska, Małgorzata Czerwicka, et al (2010), "Application of Spectroscopic Methods for Structural Analysis of Chitin and Chitosan", Mar Drugs, 8(5), pp 1567–1636 35 Kailasapathy K (2002), "Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications", Curr Issues Intest Microbiol, 3(2), pp 39-48 36 Kailasapathy K., James Chin (2000), "Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp.", Immunology and Cell Biology, 78(1), pp 70-88 37 Marguerite Rinaudo (2006), "Chitin and chitosan: Properties and applications", ScienceDirect, 31, pp 603-632 38 Mariana de Araújo Etchepare, Greice Carine Raddatz, et al (2016), "Effect of resistant starch and chitosan on survival of Lactobacillus acidophilus microencapsulated with sodium alginate", ScienceDirect, 65, pp 511-517 39 Mary Ellen Sanders, Louis MA Akkermans, et al (2010), "Safety assessment of probiotics for human use", Gut Microbes, 1(3), pp 164–185 40 Maziade P J., Pereira P., et al (2015), "A Decade of Experience in Primary Prevention of Clostridium difficile Infection at a Community Hospital Using the Probiotic Combination Lactobacillus acidophilus CL1285, Lactobacillus casei LBC80R, and Lactobacillus rhamnosus CLR2 (Bio-K+)", Clin Infect Dis, 15(60), pp 144-147 41 Mohammad Ali Khosravi Zanjani, Babak Ghiassi Tarzi, et al (2014), "Microencapsulation of Probiotics by Calcium Alginate-gelatinized Starch with Chitosan Coating and Evaluation of Survival in Simulated Human Gastrointestinal Condition", Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 13(3), pp 843–852 42 Mokarram R.R., Mortazavi S.A., et al (2009), "The influence of multi stage alginate coating on survivability of potential probiotic bacteria in simulated gastric and intestinal juice", 42, pp 1040-1045 43 Morgan C., Vesey G (2009), "Freeze-drying of microorganisms" Encyclopedia of Microbiology, pp 162–173 44 Nussinovitch A., Zvitov-Marabi R (2008), "Unique shape, surface and porosity of dried electrified alginate gels", Food Hydrocolloids, 22, pp 364–372 45 Olav Smidsrød, Glover R.M., et al (1973), "The relative extension of alginates having different chemical composition", Carbohydrate Research, 27(1), pp 107-118 46 Parada José Luis, Caron Carolina Ricoy, et al (2007), "Bacteriocins from lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives", Brazilian Archives of Biology and Technology, 50(3), pp 512-542 47 Paulraj Kanmani, Kumar Satish R (2011), "Effect of cryopreservation and microencapsulation of lactic acid bacterium Enterococcus faecium MC13 for long-term storage", Biochemical Engineering Journal, 58-59, pp 140-147 48 Ramos Phillippe E, Muñiz-Alario M, et al (2013), "Development of alginate beads for probiotic encapsulation: influence of different parameters in the beads size", ENGIHR Conference, pp 146-150 49 Rokka Susanna, Rantamäki Pirjo (2010), "Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial applications", European Food Research and Technology, 231(1), pp 1-12 50 Rowe Raymond C, Sheskey Paul J, et al (2009), Handbook of Pharmaceutical Excipients 6th ed., Pharmaceutical Press, London, pp Pharmaceutical Press, London 51 Sabina Fijan (2014), "Microorganisms with Claimed Probiotic Properties: An Overview of Recent Literature", Int J Environ Res Public Health, 11(5), pp 4745–4767 52 Satu Vesterlund, Kari Salminen, et al (2012), "Water activity in dry foods containing live probiotic bacteria should be carefully considered: A case study with Lactobacillus rhamnosus GG in flaxseed", International Journal of Food Microbiology, 157, pp 319–321 53 Sébastien Gouin (2004), "Microencapsulation: industrial appraisal of existing technologies and trends", Trends in Food Science & Technology, 15(7–8), pp 330-347 54 Serna-Cock Liliana, Vallejo-Castillo Vladimir (2013), "Probiotic encapsulation", African Journal of Microbiology Research, 7(40), pp 47434753 55 Sinha VR, Singla AK, et al (2004), "Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs", International journal of pharmaceutics, 274(1), pp 1-33 56 Sriamornsak Pornsak, Thirawong Nartaya, et al (2008), "Cryo-scanning electron microscopy (cryo-SEM) as a tool for studying the ultrastructure during bead formation by ionotropic gelation of calcium pectinate", International Journal of Pharmaceutics, 352, pp 115–122 57 Talwalkar A., Kailasapathy K (2004), "A Review of Oxygen Toxicity in Probiotic Yogurts: Influence on the Survival of Probiotic Bacteria and Protective Techniques", Comprehensive review in food science and food safety, 3(3), pp 117 - 124 58 Thomas Heidebach, Petra Först, et al (2010), "Influence of casein-based microencapsulation on freeze-drying and storage of probiotic cells", Journal of Food Engineering, 98, pp 309–316 59 Wang K.Y., Li S N., et al (2004), "Effects of ingesting Lactobacillus- and Bifidobacterium- containing yogurt in subjects with colonized Helicobacter pylori", Am J Clin Nutr, 80(3), pp 737-41 60 Zuidam N J., Shimoni E (2009), Overview of Microencapsulates for Use in Food Products or Processes and Methods to Make Them, Springer, The Netherlands, pp 3-26 ... THỊ THANH MÃ SINH VI N: 1301368 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SĨT TRONG DỊCH TIÊU HĨA MƠ PHỎNG CỦA VI NANG NHỎ GIỌT ALGINAT – TINH BỘT BAO CHITOSAN CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... đơn giản, vi nang tạo thành có độ đồng cao Xuất phát từ lí trên, đề tài Đánh giá khả sống sót dịch tiêu hóa mơ vi nang nhỏ giọt alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus ...  Đánh giá độ ổn định vi nang trình bảo quản 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang calci alginat tinh bột bao chitosan dịch tiêu hóa mơ  Định tính chitosan vi nang Alg-TB bao