Đánh giá khả năng sống sót trong dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang nhỏ giọt alginat tinh bột bao chitosan chứa lactobacillus acidophilus

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THANH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HĨA MƠ PHỎNG CỦA VI NANG NHỎ GIỌT ALGINAT – TINH BỘT BAO CHITOSAN CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THANH MÃ SINH VIÊN: 1301368 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HĨA MƠ PHỎNG CỦA VI NANG NHỎ GIỌT ALGINAT – TINH BỘT BAO CHITOSAN CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Đàm Thanh Xuân DS Nguyễn Thị Ngọc Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dƣợc HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực hoàn thành tổ Vi sinh - Bộ mơn Cơng nghiệp Dược Trong thời gian thực khóa luận, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cơ, bạn bè gia đình Với tất kính trọng lòng biết ơn, tơi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Đàm Thanh Xuân DS Nguyễn Thị Ngọc, người thầy ln tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ từ ngày hồn thành khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn thầy cô giáo anh chị kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dƣợc Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho thời gian học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè động viên, ủng hộ tơi q trình học tập sống Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2018 Sinh viên Đỗ Thị Thanh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến 1.1.3 Các hệ bào chế chế phẩm probiotic 1.2 Loài Lactobacillus acidophilus 1.2.1 Đặc điểm hình thái điều kiện ni cấy 1.2.2 Vai trò 1.2.3 Các chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus 1.3 Tổng quan vi nang hóa 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Đặc điểm vi nang 1.3.3 Ưu điểm vi nang 1.3.4 Nhược điểm vi nang 1.3.5 Phương pháp vi nang hóa 1.3.6 Phương pháp nhỏ giọt đông tụ 1.4 Một số thành phần sử dụng vi nang probiotic 1.4.1 Alginat 1.4.2 Tinh bột 10 1.4.3 Chitosan 11 1.5 Một số nghiên cứu sử dụng vi nang calci alginat phối hợp với tinh bột chitosan 12 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu thiết bị 14 2.1.1 Chủng vi sinh vật 14 2.1.2 Hóa chất 14 2.1.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 14 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 15 2.1.5 Các dung dịch sử dụng nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp giai đoạn 16 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan dịch tiêu hóa mơ 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 16 2.3.2 Phương pháp nhân giống 17 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy 17 2.3.4 Phương pháp tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan giai đoạn 17 2.3.5 Phương pháp đông khô 18 2.3.6 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV 18 2.3.7 Phương pháp xác định hàm ẩm 19 2.3.8 Phương pháp xác định hoạt độ nước vi nang 20 2.3.9 Phương pháp xác định hình ảnh kích thước vi nang 20 2.3.10 Phương pháp định tính chitosan vi nang đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) 20 2.3.11 Phương pháp đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV dịch tiêu hóa mơ 20 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 21 3.1 Tạo vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp giai đoạn 21 3.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan dịch tiêu hóa mơ 21 3.2.1 Định tính chitosan vi nang Alg-TB bao chitosan sau thử nghiệm dịch dày mô 34 3.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang Alg-TB bao chitosan dịch tiêu hóa mơ 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Alg : Alginat ATCC : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) B bifidum : Bifidobacterium bifidum B longum : Bifidobacterium longum CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units) Chi : Chitosan FAO : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) kl/tt : Khối lượng/thể tích L acidophilus : Lactobacillus acidophilus L casei : Lactobacillus casei L gasseri : Lactobacillus gasseri L rhamnosus : Lactobacillus rhamnosus LAB : Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacterium) MRS : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe) MT : Môi trường SGF : Dịch dày mô (Simulated Gastric Fluid) SIF : Dịch ruột mô (Simulated Intestinal Fluid) TB : Tinh bột VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật WHO : Tổ chức y tế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên liệu hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Hoạt độ nƣớc vi nang Alg-TB bao chitosan sau đông khô trình bảo quản 26 Bảng 3.2 Độ ẩm vi nang Alg-TB bao chitosan sau đơng khơ q trình bảo quản 27 Bảng 3.3 Số lƣợng tế bào L acidophilus vi nang Alg-TB bao chitosan sau đông khô trình bảo quản 29 Bảng 3.4 Số lƣợng VSV sống sót vi nang sau đơng khơ, dịch acid sau ủ SGF vi nang sau ủ SIF 37 Bảng 3.5 Số lƣợng VSV sống sót ban đầu sau ủ dịch tiêu hóa mơ chế phẩm Antibio Pro 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Hình 1.2 Cấu trúc alginat Hình 1.3 Sự hình thành cấu trúc calci alginat 10 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử chitin chitosan 11 Hình 3.1 Vi nang Alg-TB bao Chi quan sát camera thƣờng 22 Hình 3.2 Vi nang Alg-TB bao Chi dƣới kính lúp soi có độ phóng đại 10X 22 Hình 3.3 Hình ảnh so sánh phổ IR chitosan nguyên liệu (CS) với vi nang đƣợc tạo thành theo phƣơng pháp giai đoạn 24 Hình 3.4 Hoạt độ nƣớc vi nang Alg-TB bao chitosan sau đơng khơ q trình bảo quản 26 Hình 3.5 Độ ẩm trung bình mẫu vi nang Alg-TB bao Chi sau đơng khơ q trình bảo quản 28 Hình 3.6 Số lƣợng VSV trung bình mẫu vi nang Alg-TB bao chitosan sau đông khô trình bảo quản 30 Hình 3.7 Hình ảnh so sánh phổ IR chitosan nguyên liệu với vi nang M1, M2 M3 33 Hình 3.8 Vi nang trƣớc sau ủ SGF (có bổ sung pepsin) 36 Hình 3.9 Vi nang sau ủ SGF (có bổ sung pepsin) sau ủ SIF (có bổ sung pancreatin) 36 Hình 3.10 Số lƣợng VSV đƣợc giải phóng sau ủ dịch tiêu hóa mơ vi nang Alg-TB bao chitosan chế phẩm Antibio Pro 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus biết đến vi khuẩn có lợi, sử dụng nhiều làm nguyên liệu chế phẩm probiotic Khi đưa vào thể người, probiotic mang lại tác dụng kích thích tiêu hóa, ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, tăng cường miễn dịch, giảm cholesterol máu,… [36] Lactobacillus acidophilus phải đạt số lượng đầy đủ sau uống để phát huy tác dụng có lợi Tuy nhiên, trình chế biến bảo quản, vi khuẩn dễ bị yếu tố mơi trường bên ngồi độ ẩm, nhiệt độ, áp suất, pH, hydrogen peroxid, oxy hòa tan,… tác động gây giảm số lượng vi khuẩn sống sót [29] Nhiều nghiên cứu thực nhằm tăng cường khả chống chịu vi khuẩn trước điều kiện bất lợi môi trường Phương pháp tạo vi nang calci alginat – tinh bột đông khô phương pháp đơn giản, sử dụng phổ biến nay, có khả bao gói lượng lớn vi khuẩn, cải thiện số lượng VK sau đông khô, bảo vệ VK thời gian bảo quản qua môi trường khắc nghiệt đường tiêu hóa [35] Việc bổ sung thêm chitosan bao bên ngồi giúp tạo lớp áo bảo vệ vi nang tốt tác động acid dày [41] Phương pháp có ưu điểm an tồn, khơng độc, bào chế đơn giản, vi nang tạo thành có độ đồng cao Xuất phát từ lí trên, đề tài “Đánh giá khả sống sót dịch tiêu hóa mô vi nang nhỏ giọt alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus” thực với mục tiêu sau: Tạo vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp giai đoạn Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang calci alginat tinh bột bao chitosan dịch tiêu hóa mô CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng probiotic 1.1.1 Định nghĩa Lịch sử nghiên cứu probiotic manh nha từ năm cuối kỉ 19, nhà vi sinh vật học phát khác biệt hệ VSV đường tiêu hóa người khỏe mạnh người bệnh Thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, “biotic” có nghĩa “sự sống” “probiotic” có nghĩa “dành cho sống” Lilly Stillwell (1965) sử dụng thuật ngữ để mô tả “các chất tiết VSV nhằm kích thích phát triển VSV khác” Sau đó, thuật ngữ phát triển rộng rãi Theo đó, Parker (1974), đề xuất probiotic “sinh vật chất góp phần vào cân vi sinh vật đường ruột” [15] Đến năm 2002, Tổ chức Y tế giới (WHO) tổ chức Nông lương giới (FAO) đưa định nghĩa ngắn gọn hoàn chỉnh probiotic sau: “Probiotic vi sinh vật sống mà đưa vào thể với lượng đủ lớn đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [27] Định nghĩa probiotic Hiệp hội khoa học quốc tế Probiotics Prebiotics (ISAPP) áp dụng sử dụng hầu hết ấn phẩm khoa học Đối với chế phẩm probiotic, hiệu phụ thuộc vào liều lượng khả tồn trình vận chuyển qua điều kiện có tính acid dày, không bị thủy phân enzym muối mật ruột non [26], [36] Tuy nhiên, trình chế biến, bảo quản sử dụng, probiotic bị ảnh hưởng nhiều điều kiện bất lợi trình sản xuất, mơi trường bên ngồi mơi trường đường tiêu hóa [24] Vì vậy, để mang lại hiệu quả, vi sinh vật phải ổn định chế phẩm suốt trình bảo quản, trì số lượng sống sót mức tối thiểu 107-109 CFU/g [14] 1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến Các tính chất quan trọng chủng giống để sử dụng sản xuất probiotic bao gồm: đề kháng với acid dày (pH 1-4), kháng acid mật, bám dính chất nhầy và/hoặc tế bào biểu mơ người dòng tế bào, hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn nấm gây bệnh bám dính vào bề mặt, hoạt tính hydrolase muối mật, tăng cường khả tồn chế phẩm sinh học [51] Bàn luận: Bản chất cation chitosan (pKa ≈ 6,5) định nhóm –NH3+, chất anion alginat (pKa ≈ 3,4–3,7) kết diện nhóm –COO- Bản chất cation chitosan dẫn đến proton nhóm amin dung dịch có tính acid đến trung tính, chitosan bị hòa tan mơi trường acid Đó chìa khóa giải thích đặc tính sinh học chitosan, nhóm NH3+ chitosan dễ dàng liên kết với bề mặt tích điện âm màng nhầy, giúp tăng cường thuốc phân cực vận chuyển bề mặt biểu mô Khi bao vi nang calci alginat – tinh bột chitosan, phức hợp ion alginat chitosan hình thành tương tác nhóm carboxyl alginat với nhóm amin chitosan tạo thành lớp màng bề mặt vi nang [20] 34 ... THỊ THANH MÃ SINH VI N: 1301368 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SĨT TRONG DỊCH TIÊU HĨA MƠ PHỎNG CỦA VI NANG NHỎ GIỌT ALGINAT – TINH BỘT BAO CHITOSAN CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... đơn giản, vi nang tạo thành có độ đồng cao Xuất phát từ lí trên, đề tài Đánh giá khả sống sót dịch tiêu hóa mơ vi nang nhỏ giọt alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus ...  Đánh giá độ ổn định vi nang trình bảo quản 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang calci alginat tinh bột bao chitosan dịch tiêu hóa mơ  Định tính chitosan vi nang Alg-TB bao