Đánh giá khả năng sống sót trong dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang alginat tinh bột chitosan chứa lactobacillus acidophilus

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HOA ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HĨA MƠ PHỎNG CỦA VI NANG ALGINAT – TINH BỘT – CHITOSAN CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI-2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HOA Mã sinh viên: 1301156 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HÓA MÔ PHỎNG CỦA VI NANG ALGINAT – TINH BỘT – CHITOSAN CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Đàm Thanh Xuân DS Nguyễn Thị Ngọc Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI-2018 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực tổ Vi sinh – Bộ môn Công nghiệp Dược Trong suốt q trình thực khóa luận, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ từ thầy cơ, gia đình bạn bè Trước tiên, với tất kính trọng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân, người thầy tiếp lửa cho đường nghiên cứu khoa học Người thầy tận tình hướng dẫn, động viên tạo điều kiện thuận lợi từ ngày đến tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Thị Ngọc, TS Bùi Thị Thúy Luyện tận tình hướng dẫn, giải đáp thắc mắc giúp đỡ thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược, người quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực nghiệm làm đề tài nghiên cứu môn Đồng thời xin cảm ơn Viện Công nghiệp Thực phẩm giúp đỡ phép đo hoạt độ nước Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng ban tồn thể thầy cô, cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội dạy bảo giúp đỡ suốt năm học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân người bạn đáng mến - người bên tôi, động viên khích lệ tơi học tập sống Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2018 Sinh viên Lê Thị Hoa MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 Đại cương probiotic 1.1.1 Lịch sử phát triển probiotic 1.1.2 Khái niệm probiotic 1.1.3 Các chủng probiotic phổ biến 1.1.4 Các hệ bào chế chế phẩm probiotic 1.2 Vi khuẩn lactic .4 1.2.1 Đặc điểm chung vi khuẩn lactic 1.2.2 Loài Lactobacillus acidophilus 1.3 Tổng quan vi nang 1.3.1 Khái niệm .7 1.3.2 Cấu tạo, thành phần 1.3.3 Đặc điểm vi nang .7 1.3.4 Phương pháp vi nang hóa .8 1.3.5 Vi nang hóa phương pháp tách pha đơng tụ 1.4 Một số thành phần sử dụng vi nang probiotic 11 1.4.1 Alginat 11 1.4.2 Chitosan 13 1.5 Một số nghiên cứu vi nang alginat – tinh bột – chitosan 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị .15 2.1.1 Chủng vi sinh vật 15 2.1.2 Nguyên vật liệu, hóa chất .15 2.1.3 Thiết bị dụng cụ .15 2.1.4 Một số môi trường sử dụng 16 2.1.5 Một số dung dịch sử dụng 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Khảo sát số đặc tính vi nang Alg – TB – Chi chứa Lactobacillus acidophilus 17 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ VSV vi nang Alg – TB – Chi dịch tiêu hóa mơ 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu .18 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 18 2.3.2 Phương pháp nhân giống 18 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 18 2.3.4 Phương pháp tạo vi nang chứa Lactobacillus acidophilus kỹ thuật đông tụ hóa muối 19 2.3.5 Phương pháp đông khô 20 2.3.6 Phương pháp xác định hàm ẩm 20 2.3.7 Phương pháp xác định hoạt độ nước vi nang .20 2.3.8 Phương pháp xác định hình ảnh vi nang kính lúp soi 20 2.3.9 Phương pháp định tính đo phổ hồng ngoại (IR) 21 2.3.10 Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV 21 2.3.11 Phương pháp khảo sát khả bảo vệ VSV vi nang Alg – TB – Chi môi trường dịch dày mô 22 2.3.12 Phương pháp đánh giá khả giải phóng VSV vi nang mơi trường dịch tiêu hóa mơ 23 2.3.13 Phương pháp xử lý kết 23 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Khảo sát số đặc tính vi nang Alg – TB – Chi chứa Lactobacllus acidophilus .25 3.1.1 Khảo sát cảm quan bên vi nang Alg – TB – Chi trước sau đông khô 25 3.1.2 Khảo sát số thông số vi nang Alg – TB – Chi chứa L acidophilus 30 3.1.3 Khảo sát mật độ L acidophilus vi nang Alg – TB – Chi sau đơng khơ q trình bảo quản 32 3.2 Đánh giá khả bảo vệ VSV vi nang Alg – TB – Chi dịch tiêu hóa mô 34 3.2.1 Khảo sát vi nang Alg – TB – Chi môi trường dịch dày mô 35 3.2.2 Đánh giá khả giải phóng VSV vi nang Alg – TB – Chi mơi trường dịch tiêu hóa mơ 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Alg Alginat ATCC American Type Culture Collection (Trung tâm giữ giống quốc gia Hoa Kỳ) AW Hoạt độ nước CFU Colony-Forming Units (Số đơn vị khuẩn lạc) Chi Chitosan CT Công thức DĐVN V Dược điển Việt Nam V FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) IR Phổ hồng ngoại kl/tt Khối lượng/thể tích L acidophilus Lactobacillus acidophilus LAB Lactic acid bacteria (Vi khuẩn lactic) M Mẫu MRS de Man, Rogosa, Sharpe (Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic) MT Môi trường TB Tinh bột VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật WHO World Health Organization (Tổ chức y tế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên vật liệu hóa chất sử dụng 15 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 16 Bảng 2.3 Bảng thiết kế công thức vi nang 19 Bảng 3.1 Đường kính vi nang M1 M2 trước sau đông khô 28 Bảng 3.2 Hoạt độ nước vi nang Alg – TB – Chi sau đông khô 30 Bảng 3.3 Hàm ẩm vi nang Alg – TB – Chi theo thời gian (%) 30 Bảng 3.4 Mật độ L acidophilus vi nang Alg – TB – Chi sau đơng khơ q trình bảo quản 32 Bảng 3.5 Khả sống sót L acidophilus ủ vi nang Alg – TB – Chi Antibio dịch tiêu hóa mơ (CFU/g) 40 Bảng 3.6 Khả sống sót L acidophilus ủ vi nang Alg – TB – Chi Antibio dịch tiêu hóa mơ (Log CFU/g) 40 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Hình 1.2 Hình ảnh mơ tả cấu trúc alginat 11 Hình 1.3 Mơ hình “Vỉ trứng”, vị trí ion Ca2+ gel tạo gel calci alginat 12 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học chitin chitosan 13 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình bào chế vi nang 26 Hình 3.2 Hình ảnh vi nang M1, M2 trước sau đơng khơ 27 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hàm ẩm (%) vi nang Alg – TB – Chi theo thời gian 31 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV bao gói sau đơng khơ trình bảo quản 33 Hình 3.5 Hình ảnh vi nang M2 (Alg – TB – Chi) sau lắc dịch dày mơ 36 Hình 3.6 Hình ảnh so sánh phổ IR chitosan, vi nang M1 vi nang M2 sau lắc dịch tiêu hóa mơ 36 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả giải phóng VSV vi nang Alg – TB – Chi Antibio dịch tiêu hóa mô (Log CFU/g) 41 ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic biết đến nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho người ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị cho người bị suy thận, giảm cholesterol máu,…[32] Tuy nhiên nhóm VSV dễ bị ảnh hưởng yếu tố pH, nhiệt độ, độ ẩm… Khi sử dụng theo đường uống, pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật yếu tố làm giảm số lượng VSV sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân hệ vi sinh đường ruột Trên giới có nhiều nghiên cứu tạo chế phẩm nhằm đảm bảo cung cấp đủ số lượng vi sinh vật đem lại tác dụng mong muốn Trong đó, phương pháp vi nang hóa tỏ ưu việt, giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất tế bào có thay đổi nhiệt độ, pH hay có mặt chất ức chế môi trường làm tế bào kéo dài khả tồn [50] Trong nghiên cứu gần đây, tác giả sử dụng vi nang calci – alginat – chitosan để bao gói vi sinh vật [34], [37], [40], [48] Việc sử dụng alginat chitosan làm vật liệu bao gói vi nang probiotic có nhiều ưu điểm bật an tồn, khơng độc, vi nang tạo thành có độ đồng cao Chitosan giúp bảo vệ, làm tăng khả sống sót vi sinh vật, hạn chế tác động acid dịch vị muối mật vi sinh vật qua đường tiêu hóa [40] Xuất phát từ lý thực đề tài “Đánh giá khả sống sót dịch tiêu hóa mơ vi nang alginat – tinh bột – chitosan chứa Lactobacillus acidophilus” với mục tiêu sau: Khảo sát số đặc tính vi nang alginat – tinh bột – chitosan chứa Lactobacillus acidophilus Đánh giá khả bảo vệ VSV vi nang alginat – tinh bột – chitosan dịch tiêu hóa mơ a Vi nang M2 sau lắc b Vi nang M2 sau lắc Hình 3.5 Hình ảnh vi nang M2 (Alg – TB – Chi) sau lắc dịch dày mơ Hình 3.6 Hình ảnh so sánh phổ IR chitosan, vi nang M1 vi nang M2 sau lắc dịch tiêu hóa mơ Chú thích: M1: Vi nang Alg – TB M2-1h: Vi nang M2 sau lắc Chi: Chitosan M2-2h: Vi nang M2 sau lắc 36 Nhận xét bàn luận: Sau lắc môi trường dịch dày mô phỏng, vi nang trương nở làm tăng kích thước khơng bị rã Sau ly tâm, dịch acid trong, khơng có cắn Về cảm quan, tiêu dịch acid mẫu khơng có hạt tinh bột, khơng có tế bào L acidophilus Như vậy, việc lắc acid không ảnh hưởng đến khung mạng lưới calci alginat nên vi nang giữ nguyên cấu trúc bảo tồn khả nhốt giữ [11] Về hình dạng vi nang, theo hình 3.5, ban đầu mẫu vi nang M2 có màu trắng, chắc, bề mặt nhăn nheo, xù xì, hình dạng méo mó, khơng cầu Sau lắc dịch dày mô phỏng, mẫu vi nang M2 sau lắc có màu trắng, chắc, bề mặt nhăn nheo, xù xì, khơng cầu xảy trương nở Sau giờ, vi nang M2 trương nở ít, khó quan sát Sau giờ, vi nang M2 trương nở nhiều hơn, dễ quan sát Mặc dù có tượng trương nở bề mặt vi nang M2 sau nhăn nheo, xù xì, vi nang chưa trương nở hồn tồn Dễ dàng nhận thấy kích thước vi nang tăng dần theo thời gian lắc thành phần vi nang M2 có tinh bột Tinh bột tá dược bảo vệ sử dụng với lượng lớn công thức vi nang M2 (10% tinh bột) Khi lắc dịch dày mô phỏng, hạt tinh bột hấp thụ nước, trương nở làm tăng kích thước Hiện tượng trương nở giải thích sau: ion hóa trị I có dịch dày mô H+, Na+ thay ion Ca2+ có vi nang calci alginat, làm ion Ca2+ mơ hình “vỉ trứng”, độ bền gel calci alginat giảm [17] Các phân tử nước qua màng gel, vào khoảng trống cấu trúc vi nang, kết vi nang trương nở theo thời gian Dù vậy, lượng ion H+, Na+ dịch dày mơ nên khơng thể thay tồn ion Ca2+ có vi nang vi nang lắc xảy tượng trương nở mà không xảy tượng rã theo chế hòa tan gel Vì mẫu vi nang lắc với thời gian lắc lâu có tượng trương nở nhiều quan sát dễ dàng mẫu vi nang lắc dịch dày mô Ở nhiệt độ thường, liên kết hợp chất có dao động, hấp thụ xạ hồng ngoại làm thay đổi dao động Có loại dao động phân tử dao động hóa trị dao động biến dạng Năng lượng cần cho dao động biến dạng bé lượng cần cho dao động hóa trị tương ứng Kết đo IR (hình 3.6) cho thấy, phổ IR 37 chitosan quan sát thấy đỉnh hấp thụ 3392 cm-1, đỉnh đặc trưng cho dao động hóa trị liên kết O-H N-H [19] Theo Ernö Pretsch cộng “Structure Determination of Organic Compounds”, dao động hóa trị liên kết O-H hấp thụ xạ hồng ngoại vùng 3650 - 3200 cm-1, tạo đỉnh có cường độ trung bình Các liên kết N-H có nhóm NH2 dao động hóa trị đỉnh hấp thụ có cường độ thay đổi vùng 3500 - 3300 cm-1 [19] Trên phổ IR chitosan có đỉnh hấp thụ 2936 cm-1, đỉnh đặc trưng có liên kết C-H no Các liên kết C-H no phân tử hợp chất hữu hấp thụ xạ vùng 3000 - 2840 cm-1, dao động hóa trị tạo đỉnh hấp thụ có cường độ thay đổi tùy thuộc vào số lượng liên kết phân tử [19] Đỉnh hấp phụ 1625 cm-1 thuộc liên kết C=O amid Ngoài phổ IR chitosan có đỉnh 1154 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O ete Quan sát phổ IR vi nang lắc acid giờ, nhận thấy xuất đỉnh hấp thụ vùng 3500 - 3300 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H xuất đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm C=O amid (1636 cm-1 với vi nang M3 đỉnh 1634 cm-1 với vi nang M4) Trên phổ IR vi nang M2 sau lắc xuất đỉnh hấp thụ đặc trưng cho liên kết C-O ete Tóm lại, kết đo phổ IR chitosan vi nang M2 sau lắc dịch dày mô cho thấy xuất đỉnh hấp thụ đặc trưng cho liên kết N-H, liên kết C=O amid liên kết C-O ete Trong phổ IR vi nang M1 (vi nang khơng có chitosan) khơng xuất đỉnh hấp thụ vùng 3500 - 3300 cm-1 (đặc trưng cho liên kết N-H có nhóm NH2) đỉnh hấp phụ vùng 1260–1150 cm-1 (đặc trưng cho liên kết C-O ete) Điều chứng tỏ mẫu vi nang M2 sau lắc dịch dày mơ có chitosan, nhiên đỉnh hấp thụ có dịch chuyển số sóng Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Văn Toàn (2017): tác giả tiến hành ngâm mẫu vi nang Alg – TB – Chi môi trường NaCl pH3, đông khô vi nang sau ngâm tiến hành đo phổ IR Kết cho thấy xuất đỉnh đặc trưng chitosan [10] Tóm lại sau lắc dịch dày mô giờ, vi nang trương nở phần Kết đo IR cho thấy thành phần vi nang M2 sau lắc dịch dày mô có chitosan 3.2.2 Đánh giá khả giải phóng VSV vi nang Alg – TB – Chi mơi trường dịch tiêu hóa mơ 38 Theo nghiên cứu Bùi Thị Kim Lanh, vi nang Alg – TB – Chi có khả bảo vệ L acidophilus mơi trường pH 3,0 có khả giải phóng VSV mơi trường đệm phosphat 6,8 đạt 108 CFU/g [6] Tuy nhiên probiotic bị ảnh hưởng yếu tố đường tiêu hóa pH dày, enzym đường tiêu hóa, muối mật Do thí nghiệm nhằm đánh giá khả sống sót VSV dịch tiêu hóa mơ có bổ sung pepsin pancreatin Mục tiêu: Đánh giá khả sống sót dịch tiêu hóa mơ vi nang Alg – TB – Chi chứa L acidophilus Tiến hành: Chuẩn bị dịch dày mô dịch ruột mô theo PL-258, Dược điển Việt Nam V, hấp tiệt khuẩn, để nguội Pepsin pancreatin thêm sau tiệt khuẩn để giữ hoạt tính enzym Cân xác khoảng 1,00 g vi nang Alg – TB – Chi đem đếm số lượng VSV bao gói theo phương pháp nêu mục 2.3.10 để xác định mật độ VSV trước ủ Đồng thời, cân xác khoảng 1,00 g vi nang Alg – TB – Chi cho bình nón chứa 100,0 ml dung dịch dịch dày mô Ủ vi nang máy lắc 370C, tốc độ 150 vòng/phút Theo dõi trạng thái vi nang trình lắc, sau sử dụng lưới vớt hạt tiệt khuẩn tách dịch acid vi nang Hút 1,00 ml dịch acid tiến hành pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV thất thoát Vi nang sau tách chuyển sang bình nón chứa 100,0 ml dịch ruột mô tiếp tục ủ máy lắc ở 370C, tốc độ 150 vòng/phút Sau giờ, quan sát hình dạng vi nang, hút xác 1,00 ml dịch tiến hành pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV sống sót dịch ruột mô (phương pháp nêu mục 2.3.12) Song song tiến hành với chế phẩm thị trường cấp phép lưu hành Sử dụng chế phẩm Antibio Pro công ty dược phẩm Han Wha, Hàn Quốc sản xuất với dạng bào chế gói bột pha hỗn dịch uống Số lô 1108, ngày sản xuất 29/03/2016, hạn sử dụng 28/03/2019 Mỗi gói chứa 75 mg Lactobacillus acidophilus tương đương với 1x108 CFU/gói Cân xác khoảng 1,00 g chế phẩm, tiến hành pha loãng liên tục theo phương pháp nêu mục 2.3.10 với môi trường đệm phosphat pH 6,8 để xác định số lượng VSV trước ủ Chế phẩm Antibio dạng bột nên vớt hạt vi 39 nang, dùng dịch ruột mơ pH 6,8 để trung hòa đưa dịch dày mơ có chứa chế phẩm Antibio ~ pH 6,8 Lượng dung dịch đệm thêm vào tính tốn tiệt khuẩn từ trước để đảm bảo phù hợp Cụ thể: cân xác khoảng 1,00 g chế phẩm vào 20 ml dịch dày mô tiệt khuẩn, để nguội bổ sung pepsin vừa đủ 0,32% Đem lắc điều kiện nhiệt độ 370C, tốc độ 150 vòng/phút giờ, sau thêm khoảng 80 ml đệm pH 6,8 tiệt khuẩn pancreatin vừa đủ 1% tiếp tục lắc 370C, tốc độ 150 vòng/phút Sau hút xác 1,0 ml dịch tiến hành pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV sống sót dịch ruột mơ Lặp lại thí nghiệm lần lấy kết trung bình Kết trình bày bảng 3.5, bảng 3.6 hình 3.7 Kết Bảng 3.5 Khả sống sót L acidophilus ủ vi nang Alg – TB – Chi Antibio dịch tiêu hóa mơ (CFU/g) Vi nang Alg-TB-Chi Trước ủ (×109) Sau ủ (×108) Mẫu 8,85 6,75 Mẫu 5,02 3,56 Mẫu 4,64 Trung bình 6,17 Mẫu Số lượng VSV thất (×106) 1,17 Antibio Tỷ lệ thất (%) Trước ủ (×108) Sau ủ (×106) 0,01 1,23 3,32 0,65 0,01 1,08 3,05 3,28 0,42 0,01 1,02 3,12 4,53 0,75 0,01 1,11 3,16 Bảng 3.6 Khả sống sót L acidophilus ủ vi nang Alg – TB – Chi Antibio dịch tiêu hóa mơ (Log CFU/g) Vi nang Alg-TB-Chi Mẫu Antibio Trước ủ Sau ủ Trước ủ Sau ủ Mẫu 9,95 8,83 8,09 6,52 Mẫu 9,71 8,55 8,03 6,48 Mẫu 9,67 8,52 8,01 6,49 Trung bình 9,78 8,63 8,04 6,50 40 Log CFU/g 12 10 9.78 8.63 8.04 6.50 Trước ủ Sau ủ Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả giải phóng VSV vi nang Alg – TB – Chi Antibio dịch tiêu hóa mơ (Log CFU/g) Nhận xét bàn luận: Trước lắc dịch dày mô phỏng, vi nang Alg – TB – Chi có bề mặt nhăn nheo, thể chất rắn, Sau lắc dịch dày mô phỏng, vi nang Alg – TB – Chi trương nở phần Sau lắc dịch ruột mơ phỏng, vi nang trương nở hồn tồn, bề mặt xuất vết nứt, vi nang vỡ thành mảnh vụn, mềm nhũn Có thể giải thích tượng sau: Khi tiếp tục lắc dịch ruột mô phỏng, theo thời gian, thay ion Ca2+ ion hóa trị I K+, Na+ diễn mạnh mẽ làm ion Ca2+ mô hình vỉ trứng, độ bền gel giảm dẫn đến phá vỡ cấu trúc nang, vi nang bị nứt vỡ, đồng thời làm thất thoát VSV [34] Thời gian lắc lâu, vi nang vỡ, tạo thành mảnh vụn nhỏ Theo kết bảng 3.4: Sau lắc vi nang môi trường dịch dày mơ phỏng, lượng VSV thất mơi trường (0,75 ×106 CFU/g) q trình lắc, trương nở diễn dẫn đến thất thoát VSV mơi trường ngồi Tuy nhiên lượng nhỏ so với số lượng VSV bao gói ban đầu 6,17×109 (CFU/g), chiếm khoảng 0,01 % tổng số lượng VSV Khi lắc môi trường dịch ruột mô phỏng, mẫu vi nang giải phóng VSV mức cao: dao ng t 3,28ì108 ữ 6,75ì108 41 CFU/g, t 108 CFU/g, đáp ứng yêu cầu tối thiểu chế phẩm probiotic [18], [36] Vi nang có bổ sung chitosan giúp tạo lớp áo polycation bên ngoài, rào cản với ion H+ môi trường acid giúp bảo vệ VSV dịch dày mô [34] Nhiều nghiên cứu rằng, chitosan tạo nên lớp màng bảo vệ, làm hạn chế ảnh hưởng dịch dày đến tế bào VSV, đồng thời giúp giải phóng VSV mơi trường dịch ruột Do đó, sử dụng chitosan vi nang làm tăng khả sống sót tế bào VSV dịch tiêu hóa mô (cùng với pepsin pancreatin) so với tế bào VSV dạng tự [37], [40] Với chế phẩm Antibio, sau lắc dịch tiêu hóa mơ phỏng, số lượng VSV giảm từ 1,11 ×108 CFU/g xuống 3,16×106 CFU/g Trong đó, với vi nang Alg – TB – Chi, số lượng VSV giảm từ 6,17×109 CFU/g xuống 4,53×108 CFU/g Số lượng VSV giải phóng dịch tiêu hóa mơ vi nang Alg – TB – Chi cao nhiều so với chế phẩm Antibio (4,53×108 CFU/g so với 3,16×106 CFU/g) Theo hình 3.7, sử dụng vi nang Alg –TB – Chi làm tăng số lượng VSV bao gói so với chế phẩm thị trường không bao (Antibio), đồng thời giúp bảo vệ VSV tốt dịch tiêu hóa mơ phỏng, làm tăng số lượng VSV sống sót tạo tác dụng mong muốn Tóm lại, sau khảo sát vi nang Alg –TB – Chi dịch tiêu hoá mô thu số kết sau: - Sau lắc dịch dày mô phỏng, vi nang Alg –TB – Chi trương nở phần Số lượng VSV thất mơi trường thấp (0,75 ×106 CFU/g), chiếm khoảng 0,01% so với số lượng VSV trước đem lắc - Sau lắc dịch ruột mô phỏng, vi nang trương nở hoàn toàn vỡ Số lượng VSV giải phóng 4,53×108 CFU/g, đáp ứng u cầu chế phẩm probiotic Kết so sánh với chế phẩm Antibio lưu hành thị trường cho thấy, vi nang Alg –TB – Chi tỏ ưu việt với số lượng vi sinh vật giải phóng dịch tiêu hóa cao nhiều lần 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT I KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài đạt mục tiêu đề ra: Đã khảo sát số đặc tính vi nang Alg – TB – Chi chứa Lactobacllus acidophilus Kết cho thấy: • Trước đơng khơ, vi nang có hình cầu, màu vàng, bề mặt trơn nhẵn, tương đối đồng kích thước trung bình 4296 µm Sau đơng khơ, vi nang có màu vàng, bề mặt xù xì, hình dạng méo mó, kích thước trung bình 3218 µm Việc bổ sung chitosan khơng làm thay đổi hình dạng làm thay đổi màu sắc làm tăng kích thước vi nang Alg – TB – Chi so với vi nang Alg – TB • Hoạt độ nước vi nang sau đơng khơ có giá trị thấp (0,000 0,011) Hàm ẩm vi nang sau đông khô 1,71%, sau tháng bảo quản 1,77% (điều kiện nhiệt độ 40C-80C, độ ẩm tương đối 30%), đáp ứng điều kiện chế phẩm đơng khơ • Mật độ VSV vi nang Alg – TB – Chi sau tháng bảo quản đạt 4,96 109 CFU/g, đáp ứng yêu cầu chế phẩm probiotic Đánh giá khả bảo vệ VSV vi nang Alg – TB – Chi dịch tiêu hóa mơ phỏng, kết cho thấy: • Sau lắc dịch dày mô phỏng, vi nang Alg –TB – Chi trương nở phần Kết đo IR cho thấy thành phần vi nang Alg –TB – Chi sau lắc dịch dày mơ chitosan • Sau lắc dịch tiêu hóa mơ phỏng, số lượng VSV thất thoát thấp (0,01%) Số lượng giải phóng 4,53×108 CFU/g, đạt u cầu chế phẩm probiotic Kết so sánh với chế phẩm Antibio lưu hành thị trường cho thấy, vi nang Alg –TB – Chi tỏ ưu việt với số lượng vi sinh vật giải phóng dịch tiêu hóa cao nhiều lần II ĐỀ XUẤT 43 Bên cạnh kết thu được, để hồn thiện cao tính ứng dụng thực tế, đề tài xin đưa số đề xuất sau: • Khảo sát độ ổn định ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang Alg – TB – Chi • Nghiên cứu khả bảo vệ VSV vi nang probiotic có bổ sung prebiotic • Tiếp tục nghiên cứu bào chế vi nang L acidophilus kết hợp với số probiotic khác (ví dụ Bifidobacterium) để tạo thêm nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu ngày tăng sản phẩm probiotic 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2000), Vi sinh vật học, Hà Nội, Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp, Nguyễn Văn Vinh (2009), "Bàn việc đảm bảo khả sống sót vi sinh vật sản phẩm probiotic", Tạp chí Dược Học, 393, tr 2-4 Nguyễn Mai Hương (2014), Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trình tạo ngun liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Từ Minh Koóng, Đàm Thanh Xuân (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập 2, NXB Y học Hà Nội Bùi Thị Kim Lanh (2017), Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang calci- alginat bao chitosan, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Văn Long (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr 114-130 Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế sinh dược học, Hà Nội, Nhà xuất Giáo dục, tr 291-300 Vũ Quỳnh Phương (2017), Nghiên cứu ảnh hưởng glycerol nồng độ tinh bột đến cấu trúc mật độ vi sinh vật Lactobacillus acidophilus vi nang calci alginat, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội 10 Nguyễn Văn Toàn (2017), Khảo sát ảnh hưởng chitosan đến số tính chất vi nang probiotic alginat-tinh bột, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội 11 Đàm Thanh Xuân cs (2016), "Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics phương pháp đơng tụ", Tạp chí Dược Học, 56(5), tr 61-65 Tiếng Anh 12 Abbas Ali Imani Fooladi, Hamideh Mahmoodzadeh Hosseini, et al (2013), "Probiotic as a Novel Treatment Strategy Against Liver Disease", Hepatitis Montlily, 13(2), pp 7521 13 Ana Blandino, Manuel Macías, et al (1999), "Formation of calcium alginate gel capsules: Influence of sodium alginate and CaCl2 concentration on gelation kinetics", Journal of Bioscience and Bioengineering, 88(6), pp 686-689 14 Anal Anil Kumar, Singh Harjinder (2007), "Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery", Trends in Food Science & Technology, 18(5), pp 240-251 15 Arnaud J -P., Lacroix C., et al (1992), "Effect of agitation rate on cell release rate and metabolism during continuous fermentation with entrapped growing Lactobacillus casei subsp casei", Biotechnology Techniques, 6(3), pp 265-270 16 Claesson MJ, van Sinderen D, et al (2008), "Lactobacillus phylogenomics – towards a reclassification of the genus", Int J Syst Evol Microbiol, 58(12), pp 2945–2954 17 Doumèche B., Küppers M., et al (2004), "New approaches to the visualization, quantification and explanation of acid-induced water loss from Ca-alginate hydrogel beads", Journal of Microencapsulation 21(5), pp 565-573 18 Elizabeth C Verna (2010), "Use of probiotics in gastrointestinal disorders: what to recommend?", Therap Adv Gastroenterol, 3(5), pp 307-319 19 Ernö Pretsch, Philippe Bühlmann, et al (2009), Structure Determination of Organic Compounds, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp 269-335 20 FAO/WHO (2006), Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food 21 Fatih Ozogul, Hamed Imen (2011), "Lactic Acid Bacteria: Lactobacillus spp.: Lactobacillus acidophilus", Lactic Acid Bacteria | Lactobacillus spp.: Lactobacillus acidophilus, pp 91-95 22 Felis G.E., Dellaglio F (2007), " Taxonomy of lactobacilli and bifidobacteria", Curr Issues Intest Microbio, 8(2), pp 44-61 23 Gasbarrini, Giovanni MD, et al (2016), "Probiotics History", Journal of Clinical Gastroenterology, 50, pp 116-119 24 Ghulam Murtaza, Amir Waseem, et al (2011), "Alginate microparticles for biodelivery: A review", African journal of pharmacy and pharmacology, 5(25), pp 2726-2727 25 Goldstein E.J., Tyrrell K.L., et al (2015), "Lactobacillus species: taxonomic complexity and controversial susceptibilities", Clin Infect Dis, 60(2), pp 98-107 26 Gregoria Mitropoulou, Viktor Nedovic, et al (2013), "Immobilization Technologies in Probiotic Food Production", J Nutr Metab 27 Gionchetti P., Rizzello F., et al (2007), "High-dose probiotics for the treatment of active pouchitis", Dis Colon Rectum, 50(12), pp 2075-2082 28 Himanshu K Solanki, Dipak D Pawar, et al (2013), "Development of Microencapsulation Delivery System for Long-Term Preservation of Probiotics as Biotherapeutics Agent", Biomed Res Int 29 Ipek Goktepe, Vijay K Juneja, et al (2006), Probiotics in Food Safety and Human Health, NW 30 James Swarbrick, James C Boylan (2007), Encyclopedia of Pharmaceutical Science and Technology, New York, Informa Healthcare, pp 2315-2327 31 Jankowski T., Zielinska M., et al (1997), "Encapsulation of lactic acid bacteria with alginate/starch capsules", Biotechnology Techniques, 11(1), pp 33-34 32 Kailasapathy K (2002), "Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications", Curr Issues Intest Microbiol, 3(2), pp 39-48 33 Krasaekoopt W., Bhandari B., et al (2003), "Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt", International Dairy Journal, 13(1), pp 313 34 Khosravi Zanjani M.A., Ghiassi Tarzi B., et al (2014), "Microencapsulation of Probiotics by Calcium Alginate-gelatinized Starch with Chitosan Coating and Evaluation of Survival in Simulated Human Gastro-intestinal Condition", Iran J Pharm Res, 13(3), pp 843-852 35 Maltini E., Torreggiani D., et al (2003), "Water activity and the preservation of plant foods", Food Chemistry, 82(1), pp 79-86 36 Maria Kechagia, Dimitrios Basoulis, et al (2013), "Health Benefits of Probiotics: A Review", ISRN Nutr, 2013, pp 1-7 37 Marianade Araújo Etcheparea, Greice Carine Raddatz, et al (2016), "Effect of resistant starch and chitosan on survival of Lactobacillus acidophilus microencapsulated with sodium alginate", LWT - Food Science and Technology, 65, pp 511-517 38 Matthew Bull, Sue Plummer, et al (2013), "The life history of Lactobacillus acidophilus as a probiotic: a tale of revisionary taxonomy, misidentification and commercial success", FEMS Microbiology Letters, 349(2), pp 77-87 39 McFarland Lynne V (2015), "From Yaks to Yogurt: The History, Development, and Current Use of Probiotics", Clinical Infectious Diseases, 60(2), pp 85-90 40 Mohammad Ali Khosravi Zanjani, Babak Ghiassi Tarzi, et al (2014), "Microencapsulation of Probiotics by Calcium Alginate-gelatinized Starch with Chitosan Coating and Evaluation of Survival in Simulated Human Gastrointestinal Condition", Iran J Pharm Res, 13(3), pp 843-852 41 Saad N., Delattre C., et al (2013), "An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field", LWT - Food Science and Technology, 50(1), pp 1-16 42 Nitika Agnihotri, Ravinesh Mishra, et al (2012), "Microencapsulation – A Novel Approach in Drug Delivery: A Review", Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(1), pp 1-20 43 Ozyurt V.H., Ötles S (2014), "Properties of probiotics and encapsulated probiotics in food", Acta Sci Pol Technol Aliment, 13(4), pp 413-424 44 Sabina Fijan (2014), "Microorganisms with Claimed Probiotic Properties: An Overview of Recent Literature", Int J Environ Res Public Health, 11(5), pp 4745 45 Sinha V.R., Singla A.K., et al (2004), "Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs", Int J Pharm, 274(1-2), pp 1-33 46 Susanna Rokka, Pirjo Rantamäki (2010), "Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial applications", European Food Research and Technology, 231(1), pp 1-12 47 Sweta Rathore, Parind Mahendrakumar Desai, et al (2013), "Microencapsulation of microbial cells", Journal of Food Engineering, 116(2), pp 369-381 48 Timothy W Yeung, Elif F ĩỗok, et al (2016), "Microencapsulation in Alginate and Chitosan Microgels to Enhance Viability of Bifidobacterium longum for Oral Delivery", Front Microbiol, 7, pp 494 49 Uberos J., Aguilera-Rodríguez E., et al (2017), "Probiotics to prevent necrotising enterocolitis and nosocomial infection in very low birth weight preterm infants", British Journal of Nutrition, 117(7), pp 994-1000 50 Vivek K B (2013), "Use of encapsulated probiotics in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences, 3(1), pp 188-199 51 William H Sperber (1983), "Influence of Water Activity on Foodborne Bacteria - A Review", Journal of Food Protectiol, 46(2), pp 142-150 52 Wunwisa Krasaekoopt, Bhesh Bhandari, et al (2004), "The influence of coating materials on some properties of alginate beads and survivability of microencapsulated probiotic bacteria", International Dairy Journal, 14(8), pp 737-743 53 Xiang-Chen Meng, Catherine Stanton, et al (2008), "Anhydrobiotics: The challenges of drying probiotic cultures", Food Chemistry, 106(4), pp 1406-1416 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh vi nang Alg – TB kính hiển vi soi Phụ lục 2: Hình ảnh vi nang Alg – TB – Chi kính hiển vi soi Phụ lục 3: Hình ảnh vi nang Alg – TB – Chi sau tạo thành Phụ lục 4: Hình ảnh vi nang Alg – TB – Chi sau lắc dịch dày mô ... tài Đánh giá khả sống sót dịch tiêu hóa mơ vi nang alginat – tinh bột – chitosan chứa Lactobacillus acidophilus với mục tiêu sau: Khảo sát số đặc tính vi nang alginat – tinh bột – chitosan chứa. .. NỘI LÊ THỊ HOA Mã sinh vi n: 1301156 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SĨT TRONG DỊCH TIÊU HĨA MƠ PHỎNG CỦA VI NANG ALGINAT – TINH BỘT – CHITOSAN CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC... VSV vi nang Alg – TB – Chi dịch tiêu hóa mơ 34 3.2.1 Khảo sát vi nang Alg – TB – Chi môi trường dịch dày mô 35 3.2.2 Đánh giá khả giải phóng VSV vi nang Alg – TB – Chi môi trường dịch