Nghiên cứu phương pháp cố định kháng thể ứng dụng trong phân tích nồng độ hCG beta ở người bằng phương pháp huỳnh quang

Nghiên cứu phương pháp cố định kháng thể ứng dụng trong phân tích nồng độ hCG beta ở người bằng phương pháp huỳnh quang Trong khuôn khổ đề tài đã nghiên cứu, một số kết luận đã được rút ra như sau: Đã tìm ra được phương pháp cố định kháng thể hCG lên bề mặt giếng (polystyren) ở các điều kiện tối ưu là phương pháp vật lý (cơ chế hấp phụ vật lý) dựa trên phương pháp đo phổ huỳnh quang. Đã khảo sát và xác định được các điều kiện tối ưu để cố định hCG lên bề mặt polystyrene cho tín hiệu huỳnh quang tốt nhất đó là: nồng độ hCG cố định 2,5µgmL, thời gian cố định 20 giờ. Đã kiểm tra và đánh giá độ lặp của phép phân tích đối với mẫu hCG chuẩn (nồng độ 1030 ngmL) cho giá trị độ lệch chuẩn S = 17090,25 và hệ số biến thiên CV = ± 3,37%. Đã kiểm tra đánh giá độ bền của kháng thể hCG cố định trên bề mặt giếng polystyrene đối với mẫu hCG chuẩn (nồng độ 1030 ngmL) cho giá trị độ lệch chuẩn S ≤ 24513,6 hệ số biến thiên CV ≤ ± 5% trong thời gian 30 ngày. Đã tiến hành xác định các giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) dựa trên độ lệch chuẩn của tín hiệu dung dịch mẫu trắng. Kết quả thu được: LOD = 3405,4; LOQ = 4975,5. Đã khảo sát độ đặc hiệu với các chuẩn kháng nguyên khác như PAPPA, AFP, free BhCG và thu được giá trị cường độ huỳnh quang thấp hơn giới hạn phát hiện đã xác định, cho thấy kít chế tạo được có độ chọn lọc và độ đặc hiệu cao. Đã xây dựng đường chuẩn với 6 mẫu chuẩn hCG có nồng độ tăng dần (0 ngmL; 10,6 ngmL; 106 ngmL; 1030 ngmL; 5180 ngmL; 10100 ngmL) thu được phương trình đường chuẩn: y=3,55+ 0,66(1e(x8,64) )+1,59(1e(x871,73) ) Với hệ số hồi quy là R2 = 0,9975 Đã ứng dụng phương pháp cố định (hấp phụ vật lý) và phương pháp phân tích (phương pháp huỳnh quang) đã nghiên cứu để phân tích nồng độ hCG ở 19 mẫu huyết thanh của 19 thai phụ và thu được kết quả có độ lệch trung bình: % độ lệch trung bình = 6,3 %

NGHIÊN CứU PHƯƠNG PHáP Cố ĐịNH KHáNG THể ứNG DụNG TRONG PHÂN TíCH NồNG Độ HCG BETA NG-ời BằNG PHƯƠNG PHáP HUỳNH QUANG DANH MC T VIT TT AFP : Alpha foeto protein ADN : Axit deoxiribonucleic BSA : Bovine serum albumin DTBS : Dị tật bẩm sinh DTTA : Dietilentriamintetraaxetic axit ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ECL : Electrode Chemi Luminescence hCG : Human chorionic gonadotropin HRP : Horseradish peroxidase IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry LOD : Giới hạn phát LOQ : Giới hạn định lƣợng NTAA : 1-(2-naphthoyl)-3,3,3-trifluoroacetylacetone PS : Polystyren PBS : Photphat buffer solution PAPP-A : Pregnancy-associated plasma protein A RIA : Radio Immuno Assay RNA : Axít ribonucleic STV : Streptavidin TNT : Trinitrotoluen TMB : 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine TMBDI : 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine diimine TPA : Tripropylamin MỤC LỤC MỞ ĐẦU I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI II MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU III ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU IV PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU V NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG I TỔNG QUAN I.1 TỔNG QUAN VỀ CẢM BIẾN SINH HỌC (BIOSENSOR) I.1.1 Khái niệm vài nét lịch sử I.1.2 Cấu tạo chung cảm biến sinh học I.1.3 Đối tượng phân tích cảm biến sinh học I.1.4 Đầu thu sinh học I.1.5 Tác nhân cố định I.1.6 Bộ phận chuyển đổi tín hiệu I.1.7 Ứng dụng cảm biến sinh học I.2 TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH PROTEIN 11 I.2.1 Cố định hóa học 11 I.2.2 Cố định sinh học 12 I.2.3 Cố định vật lý (Hấp phụ vật lý) 13 I.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THẬT PHÂN TÍCH DỊ 15 I.3.1.Tổng quan kỹ thuật phân tích điện hóa 15 I.3.2 Tổng quan kỹ thuật phân tích trắc quang 16 I.3.3 Tổng quan kỹ thuật áp điện (piezoelectric) 17 I.3.4 Tổng quan kỹ thuật vi 18 I.4 TỔNG QUAN VỀ hCG VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hCG 18 I.4.1 Vai trò, ý nghĩa hCG 18 I.4.2 Các phương pháp phân tích hCG 20 I.4.2.1 Phương pháp UV-VIS (kỹ thuật ELISA) 20 I.4.2.2 Phương pháp điện hóa phát quang (ECL: Electrode Chemi Luminescence) 22 I.4.2.3 Phương pháp huỳnh quang 23 CHƢƠNG II: TIẾN TRÌNH THỰC NGHIỆM 28 II.1 CÁCH LẤY MẪU HUYẾT THANH CHO XÉT NGHIỆM 28 II.1.1 Chuẩn bị dụng cụ 28 II.1.2 Các bước tiến hành 28 II.2 CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ HCG TRÊN BỀ MẶT GIẾNG POLYSTYREN 30 II.2.1 Chuẩn bị 30 II.2.1.1 Chuẩn bị dung dịch đệm photphat 0,01M pH = 4,9 (PBS 1X) 30 II.2.1.2 Chuẩn bị dung dịch BSA 1% (Pha 14mL vào ống dung tích 15mL) 31 II.2.1.3 Chuẩn bị dung dịch NaN3 5% 31 II.2.1.4 Chuẩn bị dung dịch kháng thể HCG 31 II.2.1.5 Quy trình cố định kháng thể HCG lên bề mặt giếng polystyren 31 II.3 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH KHÁNG NGUYÊN HCG 32 II.4 KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ CỐ ĐỊNH HCG TRÊN BỀ MẶT GIẾNG 34 II.5 KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ HCG TRÊN BỀ MẶT GIẾNG 35 II.6 KHẢO SÁT ĐỘ LẶP CỦA PHÉP PHÂN TÍCH VÀ ĐỘ BỀN CỦA KHÁNG THỂ HCG 35 II.7 XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƢỢNG (LOQ) 35 II.8 KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHÉP PHÂN TÍCH VỚI CÁC KHÁNG NGUYÊN PAPP-A, AFP, FREE B-HCG 36 II.9 XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN 36 II.10 ĐO MẪU THẬT 36 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 III.1 KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ HCG CỐ ĐỊNH TRÊN BỀ MẶT GIẾNG 37 III.2 KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ HCG LÊN BỀ MẶT GIẾNG 39 III.3 KHẢO SÁT ĐỘ LẶP CỦA PHÉP PHÂN TÍCH 40 III.4 KHẢO SÁT ĐỘ BỀN CỦA KHÁNG THỂ CỐ ĐỊNH (HCG) 42 III.5 XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƢỢNG (LOQ) 44 III.6 KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU VỚI CÁC CHUẨN PAPP-A, AFP, FREE B-HCG 45 III.7 XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN VÀ ĐO VỚI MẪU THẬT 47 III.7.1 Xây dựng đường chuẩn 47 III.7.2 Đo với mẫu thật 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH SÁCH HÌNH ẢNH, BẢNG BIỂU, BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Mơ hình cảm biến sinh học Hình 1.2 Cấu tạo chung cảm biến sinh học Hình 1.3 Các phƣơng pháp cố định đầu thu sinh học Hình 1.4 Cơ định Lectin-FITC bề mặt biotin-streptavidin-biotin 13 Hình 1.5 Cố định vật lý 14 Hình 1.6 Oxi hóa khử glucose cảm biến sinh học 16 Hình 1.7: Cấu trúc phân tử hc-mơn hCG 19 Biểu đồ 1.1: Nồng độ hc-mơn hCG theo tuổi thai 20 Hình 1.8: Sơ đồ mơ tả bƣớc phân tích hCG theo phƣơng pháp ELISA 21 Hình 1.9: Phản ứng hóa phát quang (chemiluminescence) TMB với HRP 22 Hình 1.10 Sơ đồ quy trình họat động kỹ thuật điện hóa phát quang 23 Hình 1.11 Quy trình hoạt động phƣơng pháp huỳnh quang: 24 Hình 1.12 Quy trình phân tích hCG dựa vào phổ huỳnh quang phức Eu3+ NTAA 26 Biểu đồ 3.1 Cƣờng độ huỳnh quang mẫu chuẩn giếng đƣợc cố định với nồng độ hCG khác 38 Biểu đồ 3.2: Cƣờng độ huỳnh quang mẫu chuẩn ứng với thời gian cố định khác 40 Biểu đồ 3.3: Cƣờng độ huỳnh quang 10 mẫu chuẩn hCG (nồng độ 1030 ng/mL) 41 Biểu đồ 3.4 Tín hiệu huỳnh quang lặp mẫu chuẩn hCG nồng độ 1030 ng/mL tuần 43 Hình 3.1 Tín hiệu huỳnh quang 10 mẫu trắng 44 Hình 3.2 Tín hiệu huỳnh quang chuẩn PAPP-A, AFP, free β-hCG 46 Hình 3.3: Tín hiệu huỳnh quang mẫu chuẩn 47 Biểu đồ 3.5 Đƣờng chuẩn mẫu chuẩn hCG 48 Hình 3.3: Tín hiệu đo huỳnh quang 19 mẫu huyết 50 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các phản ứng hóa học sử dụng cố định hóa học 12 Bảng 1.2: Một số chất huỳnh quang hay sử dụng cảm biến sinh học 25 Bảng 1.3: Phổ huỳnh quang lantanoit với NTAA 26 Bảng 3.1 Cƣờng độ huỳnh quang mẫu chuẩn phụ thuộc vào nồng độ kháng thể hCG cố định bề mặt giếng 37 Bảng 3.2 Cƣờng độ huỳnh quang mẫu chuẩn phụ thuộc vào thời gian cố định kháng thể hCG bề mặt giếng 39 Bảng 3.3 Cƣờng độ huỳnh quang 10 mẫu chuẩn hCG có nồng độ 1030 ng/mL 41 Bảng 3.4 Kết cƣờng độ huỳnh quang 10 mẫu chuẩn D tuần 42 Bảng 3.5 Giá trị cƣờng độ huỳnh quang 10 mẫu trắng (mẫu A) 45 Bảng 3.6 Kết cƣờng độ huỳnh quang chuẩn PAPP-A, AFP, free HCG 46 Bảng 3.7 Kết cƣờng độ huỳnh quang đo đƣợc với mẫu chuẩn hCG 48 Bảng 3.8: Hệ số phƣơng trình hồi quy phi tuyến 49 Bảng 3.9 Kết so sánh nồng độ Hcg đo theo kit chế tạo phòng thí nghiệm đo theo kit chuẩn IVD 19 mẫu máu thật 50 MỞ ĐẦU I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Human chorionic gonadotropin (hCG) hc-mơn nội tiết tố đƣợc sinh q trình mang thai Hc-mơn có vài trò giúp phôi thai bám vào thành tử cung Đối với ngƣời mang thai nồng độ hCG máu thay đổi lớn suốt thai kỳ, gắn liền với phát triển thai nhi.Việc định lƣợng hCG ngồi ý nghĩa xác nhận việc có mang thai hay khơng, giúp chẩn đốn số tƣợng bất thƣờng nhƣ thai tử cung, xẩy thai hay theo dõi bất thƣờng khác thai nhi Các nghiên cứu gần mối liên hệ hàm lƣợng hCG dị tật bẩm sinh thai nhi liên quan đến bất thƣờng nhiễm sắc thể (nhƣ bệnh Down, Edwards, Patau) Việc sàng lọc dị tật bẩm sinh (DTBS) cho thai nhi trƣớc sinh thông qua định lƣợng số hCG đƣợc tiến hành thƣờng quy nƣớc tiên tiến, cho thấy vai trò quan trọng hCG ngƣời mang thai Ngoài ra, với phụ nữ không mang thai, nồng độ hCG tăng bất thƣờng máu dấu ung thƣ buồng trứng Vì vậy, việc định lƣợng hCG thƣờng quy phụ nữ khơng mang thai giúp xác định sớm ung thƣ, tăng khả điều trị khỏi giảm tỉ lệ tử vong ung thƣ buồng trứng gây Nhƣ việc định lƣợng xác nồng độ hCG (thƣờng thơng qua thành phần hCG Beta) máu có vai trò ý nghĩa quan trọng phụ nữ mang thai nói riêng, với y học nói chung Trong thập niên gần đây, phân tích hóa sinh trở thành lĩnh vực nghiên cứu bùng nổ, minh chứng rõ báo cáo khoa học liên quan đến lĩnh vực ln có số lƣợng lớn Các nghiên cứu tiến vƣợt bậc việc nâng cao độ nhạy, độ xác, độ đặc hiệu phép phân tích từ cấp độ nguyên tử, phân tử, đại phân tử đến tế bào, cho phép ứng dụng không lĩnh vực y học mà có ứng dụng rộng rãi lĩnh vực khác nhƣ hóa học, mơi trƣờng hay thực phẩm Trong đó, cảm biến sinh học hƣớng nghiên cứu mới, có tiềm tƣơng lai, giúp phép phân tích trở nên đơn gian, gọn nhẹ, tiết kiệm mà xác Việc chế tạo cảm biến sinh học phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật cố định đầu thu sinh học lên bề mặt đế (điện cực, màng hay giếng polymer), kỹ thuật định trực tiếp đến độ nhạy, độ bền, độ lặp lại phép phân tích Trong kỹ thuật cố định phổ biến gồm: 1) liên kết hóa học, 2) tƣơng tác sinh học 3) hấp phụ vật lý kỹ thuật thứ có ƣu điểm hai phƣơng pháp đơn giản, khơng đòi hỏi q trình biến tính đầu thu sinh học Hơn nữa, việc lựa chọn kỹ thuật dò chế tạo cảm biến sinh học đóng vai trò quan trọng định đến độ nhạy cảm biến Phƣơng pháp đo phổ huỳnh quang đƣợc xem phƣơng pháp có độ nhạy độ xác cao, nghiên cứu gần cho phép việc ứng dụng phân tử phát huỳnh quang đánh dấu đầu thu sinh học trở lên dễ dàng thuận lợi nhiều Vì việc áp dụng phổ huỳnh quang phân tích sinh hóa ngày đƣợc nhóm nghiên cứu quan tâm Với lí chúng tơi lựa chon đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp cố định kháng thể ứng dụng phân tích nồng độ hCG beta ngƣời phƣơng pháp huỳnh quang” II MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Mục đích đề tài bao gồm: 1) Tìm điều kiện tối ƣu để cố định kháng thể hCG lên bề mặt giếng polystyren theo phƣơng pháp hấp phụ vật lý 2) Ứng dụng phân tích hCG Beta mẫu chuẩn mẫu thật dựa việc đo tín hiệu huỳnh quang kháng thể dò III ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU - Kháng thể hCG bề mặt giếng polystyrene - Mẫu máu thai phụ giai đọan mang thai thứ hai IV PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phƣơng pháp thu thập, phân tích số liệu: Thu thập số liệu thống kê, tài liệu liên quan có - Phƣơng pháp thực nghiệm: Đƣợc vận dụng thu thập mẫu, tách triết phân tích nồng độ hCG beta có mẫu - Phƣơng pháp quan sát: Đƣợc vận dùng thƣờng xuyên suốt trình nghiên cứu đề tài - Phƣơng pháp phân tích tổng hợp đánh giá V NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu phƣơng pháp cố định kháng thể lên bề mặt giếng đĩa 96 giếng - Xây dựng quy trình phân tích nồng độ kháng thể đƣợc cố định dựa phƣơng pháp huỳnh quang - Ứng dụng phân tích nồng độ hCG thai phụ III.5 XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƢỢNG (LOQ) Việc xác định độ nhạy tín hiệu bƣớc để kiểm tra chất lƣợng giếng sau cố định kháng thể có đạt đƣợc mục đích đề khơng Ở bƣớc chúng tơi tiến hành đo 10 mẫu trắng mong muốn tín hiệu huỳnh quang thu đƣợc hồn tồn tín hiệu Tức là, tín hiệu thu đƣợc thấp Trong bƣớc mẫu trắng chúng tơi sử dụng mẫu chuẩn hCG nồng độ ng/mL quy trình thực khảo sát đƣợc trình bày mục II.7 Hình ảnh dƣới hình ảnh thu đƣợc tín hiệu huỳnh quang thu đƣợc 10 mẫu trắng Hình 3.1 Tín hiệu huỳnh quang 10 mẫu trắng Kết cƣờng độ huỳnh quang 10 mẫu trắng đƣợc thể dƣới Bảng 3.5 dƣới đây: 44 Bảng 3.5 Giá trị cƣờng độ huỳnh quang 10 mẫu trắng (nồng độ ng/ml) Giếng Cƣờng độ huỳnh quang A01 3042 A02 2626 A03 2577 A04 2801 A05 2625 A06 2332 A07 3046 A08 2589 A09 2816 A10 2871 Giá trị trung bình X = 2732,5 Độ lệch chuẩn s = 224,3 Hệ số biến thiên CV = ± 4,1% LOD = X + 3.s = 3405,4 LOQ = X + 10.s = 4975,5 III.6 KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU VỚI CÁC CHUẨN PAPP-A, AFP, FREE B-HCG Việc xem xét độ đặc hiệu chuẩn PAPP-A, AFP, free HCG nhằm mục đích khẳng định: giếng sau đƣợc cố định kháng HCG có tính đặc hiệu HCG, tức giếng chuyên dụng để đo tín hiệu HCG Nhƣ kết cần đạt đƣợc kết hồn tồn khơng lên tín hiệu, hồn tồn tín hiệu thu đƣợc tín hiệu Với 45 chuẩn thực lần đo với bƣớc đƣợc trình bày nhƣ mục II.8 Và chúng tơi thu đƣợc tín hiệu huỳnh quang nhƣ Hình 3.2 giá trị kết dƣới Bảng 3.6: Hình 3.2 Tín hiệu huỳnh quang chuẩn PAPP-A, AFP, free β-hCG Giá trị kết cƣờng độ huỳnh quang chuẩn dƣợc trình bày Bảng 3.6 dƣới đây: Bảng 3.6 Kết cƣờng độ huỳnh quang chuẩn PAPP-A, AFP, free β-hCG Chuẩn PAPP-A Free β-hCG AFP Giếng A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 KQ 2854 2597 2220 2564 2244 3202 2824 2942 2479 KQTB 2557 2670 2748 Bảng 3.6 cho thấy giá trị cƣờng độ huỳnh quang đo đƣợc chuẩn PAPP-A, AFP free β-hCG thấp giá trị giới hạn phát Nhƣ kết luận: Độ đặc hiệu giếng sau cố định kháng thể hCG tốt 46 III.7 XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN VÀ ĐO VỚI MẪU THẬT Nhƣ vậy, giếng thu đƣợc sau cố định kháng thể hCG (nồng độ 2,5µg/mL, thời gian cố định 20h) có độ đặc hiệu, độ lặp độ nhạy tƣơng đối cao (sử dụng đo huỳnh quang với mẫu chuẩn) Cơng việc cuối kiểm tra tính ứng dụng giếng đƣợc tạo việc phân tích nồng độ hCG máu thai phụ Để kiểm tra tính ứng dụng trƣớc tiên chúng tơi xây dựng đƣờng chuẩn, sau tiến hành đo với mẫu máu chuẩn thai phụ giai đọan mang thai thứ (3 tháng thai kỳ) III.7.1 Xây dựng đƣờng chuẩn Chúng sử dụng loại giếng đƣợc cố định kháng thể điều kiện tối ƣu để đo huỳnh quang mẫu kháng thể hCG chuẩn (có nồng độ tăng dần từ 0; 10,6; 106; 1030; 5180 10100 ng/ml) Các bƣớc tiến hành đƣợc trình bày mục II.9 Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc mẫu chuẩn đƣợc thể Hình 3.2, cƣờng độ huỳnh quang phụ thuộc vào cƣờng độ màu tăng dần từ xanh da trời lên màu đỏ: Hình 3.3: Tín hiệu huỳnh quang mẫu chuẩn 47 Các giá trị cƣờng độ huỳnh quang tƣơng ứng với mẫu chuẩn vị trí (A1, A2, A3, A4, A5, A6) đƣợc tổng hợp Bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết cƣờng độ huỳnh quang đo đƣợc với mẫu chuẩn hCG Nồng độ mẫu chuẩn 10.6 106 1030 5180 10100 Vị trí giếng A1 A2 A3 A4 A5 A6 Giá trị huỳnh quang 3535 10830 24536 205648 519170 743152 3.548 4.034 5.715 5.871 (ng/mL) Logarit cƣờng độ huỳnh quang 4.389 5.313 Đƣờng chuẩn phân tích hCG đƣợc xây dựng sở hồi quy phi tuyến, biểu diễn phụ thuộc logarit nồng độ huỳnh quang theo nồng độ mẫu chuẩn Đƣờng chuẩn hCG đƣợc biểu diễn Biểu đồ 3.5: 6.0 Log (AU) 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 2000 4000 6000 8000 10000 Nong Do hCG (ng/ml) Biểu đồ 3.5 Đƣờng chuẩn mẫu chuẩn hCG Đƣờng chuẩn đƣợc hồi quy theo phƣơng trình: 48 Với hệ số y0, A1, A2, t1 t2 tính tốn đƣợc sau hồi quy đƣợc liệt kê Bảng 3.8 Bảng 3.8: Hệ số phƣơng trình hồi quy phi tuyến Phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng: Hệ số hồi quy R2 = 0,9975 III.7.2 Đo với mẫu thật Chúng sử dụng sản phẩm chế tạo đƣợc để phân tích nồng độ hCG 19 mẫu thật thai phụ Các mẫu thật đồng thời đƣợc phân tích kit chuẩn Perkin Elm áp dụng cho chẩn đoán (IVD) để làm 49 kiểm chứng Hình ảnh cƣờng độ huỳnh quang mẫu thật đƣợc biểu diễn Hình 3.3 Hình 3.3: Tín hiệu đo huỳnh quang 19 mẫu huyết Kết đo dựa hai kít chế tạo phòng thí nghiệm kít chuẩn đƣợc liệt kê Bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết so sánh nồng độ hCG đo theo kit chế tạo phòng thí nghiệm đo theo kit chuẩn IVD 19 mẫu máu thật STT Mã mẫu Nồng độ hCG đo theo kit chế tạo Nồng độ hCG đo theo kit chuẩn % Độ lệch IVD 100407 12150 13050 - 6,9% 100694 66900 67100 - 0,3% 102235 29350 31600 - 7,1% 101001 7650 7150 + 7,1% 50 102237 70450 66001 + 6,7% 101408 18300 19500 - 6,1% 101000 26500 28600 -7,3 % 100993 21950 24000 - 8,5% 102273 35700 36650 - 2,6% 10 102483 22300 21851 + 2% 11 101018 36550 39901 - 8,4% 12 100179 26800 28486 - 6,0% 13 101019 37700 39200 - 3,8% 14 100996 42700 39500 + 8,1% 15 100184 15800 17887 - 11,7% 16 100183 10400 11843 - 12,2% 17 100181 48100 50197 - 4,2% 18 100408 42750 41800 + 2,3% 19 100660 26600 27700 - 3,9% % Độ lệch trung bình - 6,3% Dựa vào kết đánh giá phƣơng pháp mục III.3, III.4, III.6 cho thấy phƣơng pháp nghiên cứu tƣơng đối tốt, áp dụng vào phân tích nồng độ hCG beta mẫu huyết ngƣời Bằng chứng kết thu đƣợc đo với 19 mẫu huyết 19 thai phụ đạt: % độ lệch trung bình = - 6,3% 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu, số kết luận đƣợc rút nhƣ sau: Đã tìm đƣợc phƣơng pháp cố định kháng thể hCG lên bề mặt giếng (polystyren) điều kiện tối ƣu phƣơng pháp vật lý (cơ chế hấp phụ vật lý) dựa phƣơng pháp đo phổ huỳnh quang Đã khảo sát xác định đƣợc điều kiện tối ƣu để cố định hCG lên bề mặt polystyrene cho tín hiệu huỳnh quang tốt là: nồng độ hCG cố định 2,5µg/mL, thời gian cố định 20 Đã kiểm tra đánh giá độ lặp phép phân tích mẫu hCG chuẩn (nồng độ 1030 ng/mL) cho giá trị độ lệch chuẩn S = 17090,25 hệ số biến thiên CV = ± 3,37% Đã kiểm tra đánh giá độ bền kháng thể hCG cố định bề mặt giếng polystyrene mẫu hCG chuẩn (nồng độ 1030 ng/mL) cho giá trị độ lệch chuẩn S ≤ 24513,6 hệ số biến thiên CV ≤ ± 5% thời gian 30 ngày Đã tiến hành xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) dựa độ lệch chuẩn tín hiệu dung dịch mẫu trắng Kết thu đƣợc: LOD = 3405,4; LOQ = 4975,5 Đã khảo sát độ đặc hiệu với chuẩn kháng nguyên khác nhƣ PAPP-A, AFP, free B-hCG thu đƣợc giá trị cƣờng độ huỳnh quang thấp giới hạn phát xác định, cho thấy kít chế tạo đƣợc có độ chọn lọc độ đặc hiệu cao Đã xây dựng đƣờng chuẩn với mẫu chuẩn hCG có nồng độ tăng dần (0 ng/mL; 10,6 ng/mL; 106 ng/mL; 1030 ng/mL; 5180 ng/mL; 10100 ng/mL) thu đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn: 52 ( ) ( ) Với hệ số hồi quy R2 = 0,9975 Đã ứng dụng phƣơng pháp cố định (hấp phụ vật lý) phƣơng pháp phân tích (phƣơng pháp huỳnh quang) nghiên cứu để phân tích nồng độ hCG 19 mẫu huyết 19 thai phụ thu đƣợc kết có độ lệch trung bình: % độ lệch trung bình = - 6,3 % 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Quang Huy, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Phạm Văn Chung, Phan Thị Ngà, Mai Anh Tuấn(2011), “Cố định kháng thể lgM kháng vi rút phƣơng pháp cộng hóa trị cho cảm biến miễn dịch điện hóa”, Tạp chí hóa học, T49(2) 172-176 Võ Văn Đức (2010), “Tài liệu tập huấn Sàng lọc chẩn đóan trƣớc sinh”, Trung tâm sàng lọc - chẩn đoán trƣớc sinh sơ sinh, Trƣờng Đại học y dƣợc Huế Tiếng Anh A Penzkofer (2007), “Time-resolved fluorescence spectroscopy” Bahadir, E B., and Sezginturk, M K (2015), “Electrochemical biosensors for hor-mone analyses Biosens Bioelectron.”, 68, 62–71 doi:10.1016/j.bios.2014.12.054 Lelend C Clark Jr., C.L (1962), “Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.” Annals of the New York Academy of Sciencé, 102(Automated and Semi-Automated Systems in Clinical Chemistry): p.29-45 Emma Ericsson(2013), “Biosensor surface chemistry for oriented protein immobilization and biochip patterning”, Linköping Studies in Science and Technology Licentiate Thesis No 1573 Federica Rusmini, Zhiyuan Zhong, and Jan Feijen (2007), “Protein Immobilization Strategies for Protein Biochips”, Department of Polymer Chemistry and Biomaterials (PBM), Institute for Biomedical Technology (BMTI), Faculty of Science and Technology, University of Twente, Enschede, 7500 AE, The Netherlands Holttinen S (1993), et al, “Double-label time-resolved immunofluorometric assay for simultaneous determination of cancer 54 associated antigens CA-50 + CEA Manuscript Kunzelmann, S., Solscheid, C., and Webb, M R (2014), “Fluorescent biosensors: design and application to motor proteins.”, EXS105, 25– 47.doi:10.1007/978-3-0348-0856-9_2 10 Judy Gibbs(2001) “Immobilization Principles – Selecting the Surface”, ELISA Technical Bulletin - No 1, Corning Incorporated, Life Sciences, Kennebunk, Maine 11 Lövgren, T., Hemmilä, I., Pettersson, K., Eskola, J.U., Bertolt, E (1984) “Determination of hormon by time-resolved fluoroimmunoassay.” Talanta 31:909-916 12 Lövgren, T., Leivo, P., Siitari, H., Pettersson, K., (1991) “How to optimize rapid and simple immunoassays”, In: A Vaheri, R.C Tilton, A Bulows (eds), Rapid methods and automation in microbiology and immunology, Springer Verlag, Berlin 84 - 95 13 Marrazza, G (2014) “Piezoelectric biosensors for organophosphate and carbamate pesticides: a review” Biosensors (Basel)4, 301–317 doi:10.3390/bios4030301 14 Maria Teresa Giardi, Elena V.Piletska (2006), “Biotechnological Applications of Photosynthetic Proteins: Biochips, Biosensors and Biodevices”, New York 15 Mazzei, F., Antiochia, R., Botre, F., Favero, G., and Tortolini, C (2014) “Affinity-based biosensors in sport medicine and doping control analysis.” Bioanalysis6, 225–245 doi:10.4155/bio.13.308 16 Mello, L D., Kisner, A., Goulart, M O., and Kubota, L T (2013) “Biosensors for antioxidant evaluation in biological systems” Comb Chem High Throughput Screen.16, 109–120 doi: 10.2174/138620713804806265 17 Marazuela, M.; Moreno-Bondi, M (2002) "Fiber-optic biosensors – an overview".Analytical and Bioanalytical Chemistry 372 (5–6): 664– 55 682 doi:10.1007/s00216-002-1235-9 PMID 11941437 18 R.Hoermann, G.Spoettl, R.Moncayo, K.Mann (1990), “Evidence for the Presence of Human Chorionic Gonadotropin (hCG) and Free β-Subunit of hCG in the Human Pituitary”, J Clin Endocrinol Metab 71: 179186,1990 19 Raj Mohan Joshi (2006), “Biosensors”, D-43 Prithviraj Road, Adarsh Nagar, Delhi-110033 20 Senveli, S U., and Tigli, O (2013) “Biosensors in the small scale: methods and technology trends” IET Nanobiotechnol.7, 7–21 doi:10.1049/iet-nbt.2012.0005 21 Shen, M Y., Li, B R., and Li, Y K (2014) “Silicon nanowire fieldeffect-transistor based biosensors: from sensitive to ultra-sensitive Biosens Bioelectron”.60, 101–111 doi:10.1016/j.bios.2014.03.057 22 Siitari H., HemmiläI., Bakudu S., Mukkala V-M., Lövgren T (1984), “Europium as a label inTime-Resolved Immunofluorometric assays.”, Anal Biochem 137; 335-343 23 Turner, A P (2013), “Biosensors: sense and sensibility.”, Chem Soc Rev.42, 3184–3196 doi:10.1039/c3cs35528d 24 Vigneshvar, C C Sudhakumari, Balasubramanian Senthilkumaran and Hridayesh Prakash(2016), “Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications – An Overview”, VIT University Chennai Campus, Chennai, India, Department of Animal Biology, University of Hyderabad, Hyderabad, India, School of Life Sciences, University of Hyderabad, Hyderabad, India 25 Vo-Dinh, T.; Cullum, B (2000) "Biosensors and biochips: Advances in biological and medical diagnostics" Fresenius' Journal of Analytical 56 Chemistry 366 (6–7): 540–551.doi:10.1007/s002160051549 26 Vollmer, F; Yang, Lang (October 2012) "Label-free detection with high-Q microcavities: a review of biosensing mechanisms for integrated devices" Nanophotonics 1:267-291 Bibcode:2012Nanop 267V doi:10.1515/nanoph-2012-0021 27 Verma, N., and Bhardwaj, A (2015) “Biosensor technology for pesticides – a review” Appl Biochem Biotechnol.175, 3093–3119 doi:10.1007/s12010-015-1489-2 28 Védrine, C.; Leclerc, J.-C.; Durrieu, C.; Tran-Minh, C (2003) "Optical whole-cell biosensor using Chlorella vulgaris designed for monitoring herbicides" Biosensors & bioelectronics 18 (4): 457– 63 doi:10.1016/s0956-5663(02)00157-4 29 Wang, B., Takahashi, S., Du, X., and Anzai, J (2014) “Electrochemical biosensors based on ferroceneboronic acid and its derivatives: a review.” Biosensors (Basel) 4, 243–256 doi:10.3390/bios4030243 30 Wang, J., Chen, G., Jiang, H., Li, Z., and Wang, X (2013) “Advances in nano-scaled biosensors for biomedical applications” Analyst138, 4427– 4435 doi:10.1039/c3an00438d 31 Wang, J (2008) "Electrochemical Glucose Biosensors" Chemical Reviews 108 (2): 814–825 doi:10.1021/cr068123a PMID 18154363 32 X F Wang and B Herman(1996), “Fluorescence Imaging Spectroscopy and Microscopy”, Chemical Analysis Series, Vol.137, Wiley, New York 33 Zhan-Hui Wang, Gang Jin(2003), “Covalent immobilization of proteins for the biosensor based on imaging ellipsometry”, Journal of Immunological Methods 285 (2004) 237–243 34 Nur Atiqah bt Ahmad (2014), “Electrochemiluminescence immunoassay”, Bachelor in Biomedical Science, MSU 57 35 Gruhl, F J., Rapp, B E., and Lange, K (2013) Biosensors for diagnostic applica-tions Adv Biochem Eng Biotechnol.133, 115–148 doi:10.1007/10_2011_130 36 Guo, X (2013) Single-molecule electrical biosensors based on singlewalled carbon nanotubes Adv Mater.25, 3397–3408 doi:10.1002/adma.201301219 37 Ogi, H (2013) Wireless-electrodeless quartz-crystal-microbalance biosensors for studying interactions among biomolecules: a review Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci.89, 401–417 doi:10.2183/pjab.89.4 58 ... phổ huỳnh quang phân tích sinh hóa ngày đƣợc nhóm nghiên cứu quan tâm Với lí lựa chon đề tài: Nghiên cứu phƣơng pháp cố định kháng thể ứng dụng phân tích nồng độ hCG beta ngƣời phƣơng pháp huỳnh. .. phƣơng pháp huỳnh quang phân tử phân tích hCG sử dụng cặp kháng thể có liên kết đặc hiệu với chất phân tích (hCG) , kháng thể dò đƣợc gắn với chất đánh dấu phát huỳnh quang 23 kháng thể cố định. .. Polystyren Cố định kháng thể a) Polystyren Polystyren Ủ mẫu kháng thể dò Xác định tín hiệu từ kháng thể dò b) c) Hình 1.11 Quy trình hoạt động phƣơng pháp huỳnh quang: a) kháng thể cố định đƣợc cố định