Tổng hợp các hạt nano từ tính có đính kháng thể ứng dụng trong chẩn đoán bệnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ PTN CÔNG NGHỆ NANO TRẦN NGỌC TẠO TỔNG HỢP CÁC HẠT NANO TỪ TÍNH CÓ ĐÍNH KHÁNG THỂỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ Thành phố Hồ Chí Minh – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ PTN CÔNG NGHỆ NANO TRẦN NGỌC TẠO TỔNG HỢP CÁC HẠT NANO TỪ TÍNH CÓ ĐÍNH KHÁNG THỂỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH Chuyên ngành: Vật liệu Linh kiện Nano (Chuyên ngành đào tạo thí điểm) LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN HOÀNG HẢI Thành phố Hồ Chí Minh – 2015 72 Hình 4.26 Đồ thị đường chuẩn Albumin Từ mẫu chuẩn suy phương trình:f(x) = 0,1787*x + 0,0216, R2 = 0,9825, qua thiết lập đường chuẩn mối liên hệ độ hấp thu bước sóng 595 nm nồng độ albumin thuộc phần Hiệu suất gắn Albumin đượctrình bày bảng 4.14 Bảng 4.14 Kết gắn Albumin Tên mẫu phủ Albumin Hạt nano (mg) Độ hấp thu 595 nm Albumin /hạt nano ( mg/mg) Albumin phủ (2mg/ml) Nồng độ không dính (mg/ml) Tỷlệ bám dính (%) Ab01 40 0.087 0,038 0,68 0,92 54,00 Ab02 80 0.109 0,04 0,80 1,145 42,75 Ab03 150 0.135 0,065 5,4 1,448 27,60 Ab04 71 0.036 0,068 2,344 0,372 81,40 Ab05 60 0.154 0,069 2,04 1,648 17,60 Ab06 108 0.142 0,069 3,520 1,525 23,75 Ab07 87 0.104 0,068 2,945 1,132 43,40 Ab08 48 0.097 0,068 1,58 1,032 48,40 Ab09 30 0.119 0,064 1,0 1,261 36,95 Ab10 105 0.157 0,060 3,54 1,710 14,50 Ab11 115 0.160 0,067 3,76 1,750 25,00 Ab12 46 0.162 0,068 1,572 1,850 7,50 Ab13 30 0.184 0,067 1,00 1,980 1,00 Ab14 105 0.047 0,034 1,88 0,492 78,84 Ab15 37 0.105 0,067 1,274 1,132 43,40 73 Kết qủa gắn trình bày bảng 4.14 định lượng Albumin bám dính theo phương pháp Bradford, kết luận gắn Albumin lên hạt nano Fe3O4 Trong có mẫu cho tỉ lệ bám dính cao: mẫu Ab04 (hạt từ tạo phương pháp đồng kết tủa, bọc silica cách siêu âm, chức hóa với APTES glutaraldehyde) 81,40%; mẫu Ab14cho kết tỉ lệ bám dính cao 78,84% Tiếp theo kiểm tra tính chất mẫu hạt sau gắn albumin, chụp VSM mẫu F1S1A1G1A sau gắn APTES, xử lý glutaradehyde gắn Albumin, sau so sánh với hạt F1S1A1 Bảng 4.15 Kết VSM mẫu: hạt nano Fe3O4(F1), hạt nano Fe3O4/SiO2 (F1S1) mẫu hạt Fe3O4/SiO2/APTES/Glutaraldehyde (F1S1A1G1) Mẫu Độ từ dư Mr (emu/g) F1 0.135 Độ từ hóa cực đại Mmax (emu/g) 62.8 F1S1A1 F1S1A1G1 0.815 0.703 27,7 26.5 Mr/Mmax Độ kháng từ Hc (Oe) 0.0021 1.35 0.029 0.026 13.9 13.83 80 60 40 F1 M(emu/g) 20 F1S1A1 F1S1A1G1 -20 -40 -60 -80 -15000 -10000 -5000 5000 10000 15000 HC(Oe) Hình 4.27 VSM mẫu:hạt nano Fe3O4(F1), hạt nano Fe3O4/SiO2 (F1S1) mẫu hạt Fe3O4/SiO2/APTES/Glutaraldehyde(F1S1A1G1) Từ kết VSM sau gắn Albumin, độ từ hóa cực đại mẫu 26,5emu/g, giảm so với F1S1 Nguyên nhân sau phủ APTES, xử lý glutaradehyde gắn albumin kích thước hạt tăng lên Tuy nhiên, lực kháng từ tỉ số Mr/Mmax nhỏ, đảm bảo tính siêu thuận từ 74 4.8Đính kháng thể Vibrio Cholerae-01 lên hạt nano Fe3O4/SiO2/APTES[34]  Cơ chế gắn kháng thể Vibrio Cholerae -01: Hình 4.28 Cơ chế gắn kháng thể Vibrio cholerae-01 Bảng 4.16 Độ hấp thu bước sóng 595nm mẫu kháng thể Vibrio Cholerae-01 Kháng thể Vibrio 0,00 4,50 8,00 16,00 25,00 30,00 48,00 64,00 0,232 0,494 0,750 0,780 1,380 1,696 Cholerae-01 (ng/mL) ABS 595 nm 0,000 0,090 Từ mẫu chuẩn ta suy phương trình f(x) = 0.0266*x + 0.0453; R2= 0.9919, từ phương trình suy nồng độ kháng thể Vibrio Cholerae-01 thuộc phần Hiệu suất gắn kháng thể Vibrio Cholerae-01 cho bảng 4.16 75 Hình 4.29Đồ thị đường chuẩn kháng thể Vibrio Cholerae-01 Bảng 4.17Tỷ lệ bám dính kháng thể Vibrio Cholerae-01 số cấu trúc hạt nano Mẫu phủ kháng thể Hạt nano Vibrio (mg) cholerae01 Độ hấp thu 595nm Nồng độ kháng thể Vibrio Cholerae 01 (ng/mL) Kháng thể Vibrio Cholerae-01 không dính (ng/mL) Tỷ lệ bám dính (%) [V.01]-01 30 0,470 65,00 15,27 76,50 [V.01]-02 30 0,698 65,00 27,40 57,84 [V.01]-03 30 1,397 65,00 51,75 20,38 [V.01]-04 30 0,987 65,00 35,59 45,24 [V.01]-05 30 0,482 65,00 16,97 73,89 [V.01]-06 30 1,848 65,00 59,95 7,76 Từ kết theo phương pháp Bradford kết luận gắn kháng thể Vibrio Cholerae -01 lên hạt nano từ 76 KẾT LUẬN Trong luận văn này, hoàn thành mục tiêu đề ra:  Bằng phương pháp đồng kết tủa, phương pháp solvothermal tổng hợp hạt nano ôxít sắt Fe3O4 với nhiều kích thước khác nhau, có dạng hình cầu, độ từ hóa bão hòa cao (62 – 84emu/g)  Tạo cấu trúc lõi vỏ, với phần lõi Fe3O4, phần vỏ SiO2 với độ dày trung bình khoảng 50nm đảm bảo tính siêu thuận từ có độ từ hóa cao, ứng dụng y sinh  Chức hóa thành công bề mặt hạt Fe3O4 với – aminopropyltriethoxylane (APTES) Glutaradehyde Hạt nano từ phân tán đồng đầy đủ đặc tính: siêu thuận từ, độ từ hóa cao, độ tương hợp sinh học cao  Gắn kết thành công Albumin lên hạt nano ôxít sắt từ Kết cho thấy hạt nano phủ APTES, Glutaradehyde có kết bám dính albumin cao (70%)  Với hạt nano ôxít sắt Fe3O4 chức hóa bề mặt như: Bọc SiO2, APTES, Glutaradehyde gắn thành công kháng thể Vibrio Cholerae-01 lên hạt nano từ, từ chẩn đoán bệnh tiêu chảy cấp phương pháp xét nghiệm ELISA  Tuy nhiên, đề tài gặp phải khó khăn như: Máy móc, thiết bị, vật tư, kinh phí thời gian nên số lượng mẫu đo (dựa quy trình chuẩn) thấp Những kiến thức lĩnh vực y – sinh hạn chế nên đòi hỏi nhiều thời gian công sức Những hạn chế hy vọng khắc phục công trình nghiên cứu thời gian tới 77 HƯỚNG PHÁT TRIỂN  Tìm điều kiện để tạo hạt nano từ tính Fe3O4 có kích thước< nm  Với đặc tính hạt nano giúp xây dựng quy trình ổn định, tổng hợp hạt nano với chức sinh học chất lượng tốt Nhờ khả gắn kết với albumin cao, hạt nano ôxít sắt mà tổng hợp mang lại tiềm to lớn để gắn kết với protein khác Tuy nhiên số hạn chế cần phải khác phục: - Sau bọc SiO2 nhiều lõi Fe3O4, cần có biện pháp xử lý tốt để hạt có lõi, lớp SiO2 mỏng độ từ hóa cao - Cần tìm hiểu yếu tốt ảnh hưởng đến kích thước, hình thái, tính chất từ hạt nano Fe3O4 để dễ dàng gắn kháng thể Vibrio Cholerae-01 lên hạt nano từ tính  Tiếp tục nghiên cứu, thử nghiệm dùng hạt nano Fe3O4/SiO2 có phủ APTES, xử lý Glutaraldehyde, gắn kháng thể để chẩn đoán bệnh: Viêm gan B, ung thư, sốt xuất huyết vv phương pháp xét nghiệm ELISA 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]Thân Đức Hiền, Lưu Tuấn Tài (2008), Từ học vật liệu từ, NXB Bách Khoa Hà Nội, Hà Nội [2]Nguyễn Lân Dũng, Vi Sinh vật học Nhà xuất Giáo Dục, 2002: p 453-458 [3]Nguyễn Phú Thùy (2004), Vật Lý Các Hiện Tượng Từ, NXB Đại Học Quốc Gia, Hà Nội [4]Lê Thụy Thảo (2013), Tổng hợp hạt nanô ôxít sắt có cấu trúc lõi/vỏ, Luận văn tốt nghiệp đại học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Tp Hồ Chí Minh [5]Nguyễn Tăng Ấm Bệnh Tả Bách khoa thư bệnh học, Trung tâm quốc gia biên soạn TĐBKVN Hà nội, 1991 [6] Nguyễn Trần Lâm Thanh (2009), Kỹ thuật Elisa chẩn đoán virus Gumboro, Luận văn tốt nghiệp đại học, Đại học Nông lâm, Tp.HCM Tài liệu tiếng Anh [7]Hasan, N.A., Non-toxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 Isolated from a Gulf Coast Case of Human Gastroenteritis Journal of Clinical Microbiology, 2014 JCM.02187-14 [8] Chen, J.P., et al., Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle Int J Nanomedicine, 2012 7: p 5137-49 [9] Ligang Gai, et al., Preparation of core–shell Fe3O4/SiO2 microspheres as adsorbents for purification of DNA PHYSICS D: APPLIED PHYSICS, 2010 43:p 1-8 [10] Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Analytical Biochemistry, 1976 72(1–2): p 248-254 [11] Fricker, J., Drugs with a magnetic attraction totumours Drug Discou Today, 2001 6(8): p p.387-389 [12] Kami, D., et al, Application of Magnetic Nanoparticles to Gene Delivery Int J Mol, 2011(12(6)): p 3705-3722 [13] Coroiu, I., Relaxivities of different superparamagnetic particles for application in NMR tomography Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 1999 201(1–3): p 449-452 79 [14] Daisuke Kami 1, Application of Magnetic Nanoparticles to Gene Delivery Molecular Sciences, 2011 ISSN 1422-0067(Int J Mol Sci [15] Liu, X., et al., Preparation and characterization of amino–silane modified superparamagnetic silica nanospheres Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2004 270(1–2): p 1-6 [16] Yamaura, M., et al., Preparation and characterization of (3aminopropyl)triethoxysilane-coated magnetite nanoparticles Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2004 279(2–3): p 210-217 [17]Wotschadlo, J., et al., Biocompatible multishell architecture for iron oxide nanoparticles Macromol Biosci, 2013 13(1): p 93-105 [18] Ranjbakhsh, E., et al., Enhancement of stability and catalytic activity of immobilized lipase on silica-coated modified magnetite nanoparticles Chemical Engineering Journal, 2012 179(0): p 272-276 [19] Gao, S., et al., Synthesis and Characterization of Fe(10)BO3/Fe3O4/SiO2 and GdFeO3/Fe3O4/SiO2: Nanocomposites of Biofunctional Materials ChemistryOpen, 2013 2(3): p 88-92 [20] Sun, H., et al., Synthesis of size-controlled Fe3O4@SiO2 magnetic nanoparticles for nucleic acid analysis J Nanosci Nanotechnol, 2012 12(1): p 267-73 [21] Hui, C., et al., Core-shell Fe3O4@SiO2 nanoparticles synthesized with welldispersed hydrophilic Fe3O4 seeds Nanoscale, 2011 3(2): p 701-5 [22]Chi, Y., et al., Synthesis of Fe3O4@SiO2-Ag magnetic nanocomposite based on small-sized and highly dispersed silver nanoparticles for catalytic reduction of 4nitrophenol J Colloid Interface Sci, 2012 383(1): p 96-102 [23]Khatiri R., Reyhani A., Mortazavi S.Z., and Hossainalipour M (2013) Immobilization of serum albumin on the synthesized three layers core–shell structures of super-paramagnetic iron oxide nanoparticles Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 19: 1642-1647 [24]BRADFORD M.M (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 72: 248-254 [25]Lei, Z., et al., A novel two-step modifying process for preparation of chitosancoated Fe3O4/SiO2 microspheres Journal of Materials Processing Technology, 2009 209(7): p 3218-3225 80 [26]Can, K., M Ozmen, and M Ersoz, Immobilization of albumin on aminosilane modified superparamagnetic magnetite nanoparticles and its characterization Colloids Surf B Biointerfaces, 2009 71(1): p 154-9 [27] Ranjbakhsh, E., et al., Enhancement of stability and catalytic activity of immobilized lipase on silica-coated modified magnetite nanoparticles Chemical Engineering Journal, 2012 179(0): p 272-276 [28]Han, C., et al., A facile hydrothermal synthesis of porous magnetite microspheres Materials Letters, 2012 70(0): p 70-72 [29]Ki Do Kim, et al., Formation and surface Modification of Fe3O4 Nanoparticles by Co – Precipitation and Sol-gel Method J Ind Eng Chem, 2007 13 [30]Can, K., M Ozmen, and M Ersoz, Immobilization of albumin on aminosilane modified superparamagnetic magnetite nanoparticles and its characterization Colloids Surf B Biointerfaces, 2009 71(1): p 154-9 [31]Liu, X., et al., Preparation and characterization of amino–silane modified superparamagnetic silica nanospheres Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2004 270(1–2): p 1-6 [32] Charles Janeway, Paul Travers (2001), Immunobiology, Garland Publishing New York and London [33] Petrere M, A.Gennaro, N.J Burriesci Mat Sci (1982), 17,429 [34] Zai-Gang Chen, Dian-Yong Tang (2007), “Antigen–antibody interaction from quartz crystal microbalance immunosensors based on magnetic CoFe2O4/SiO2 composite nanoparticle-functionalized biomimetic interface”, Bioprocess Biosyst Eng 30,243–249 81 PHỤ LỤC Phụ lục : Kết qủa VSM mẫu hạt trần 82 83 84 85 86 [...]... tài: Tổng hợp các hạt Nano từ tính có đính kháng thể ng dụng trong chẩn đoán bệnh đặc biệt ở đây chúng tôi đưa ra phương pháp mới là đính kháng thể Vibrio Cholerae (01) để chẩn đoán bệnh tiêu chảy cấp Chúng tôi nghiên cứu chế tạo hạt nano siêu thuận từ có tính chất phục vụ cho đề tài này, và nghiên cứu phủ các lớp Polymer lên bề mặt hạt nano từ tính sao cho có thể 13 đính được các kháng thểVibrio... trị sử dụng các hạt nano siêu thuận từ có thể làm gia tăng thêm nhiệt ở vị trí cục bộ thông qua sự dao động của mômen từ bên trong các hạt nano Tương tự như các lý thuyết ứng dụng khác của các hạt nano từ, khi các hạt đến các mô bệnh với sự giúp đỡ của từ trường ngoài hoặc thông qua gắn các nhóm chức năng đặc biệt, các hạt nano có tỉ lệ hấp thụ cao hơn nhiều so với các hạt từ khối Do vậy, các tế bào... kháng thể, mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện được một kháng nguyên duy nhất Dung dịch chứa các hạt nano từ này sẽ hút các loại vi khuẩn, virus gây bệnh khi được trộn lẫn với huyết tương, huyết thanh của người, sau đó sẽ được tách chiết và phân tích để chẩn đoán bệnh 1.5 Chế tạo hạt nano từ tính bao bọc trong một chất khác Hạt nano từ tính thường được bao bọc trong một vỏ (có thể là polymer hữu cơ) có. .. căn bệnh truyền nhiễm tương ứng loại kháng nguyên đó Nếu ta gắn được kháng thể trên các hạt nano từ tính thì có thể dùng từ trường ngoài tập trung các kháng thể lại và sẽ tăng được mật độ các kháng thể lên hàng trăm lần, nghĩa là tăng mật độ kháng nguyên lên hàng trăm lần Khi đó, bằng phép phân tích Elisa cũng có thể phát hiện ra các căn bệnh truyền nhiễm tương ứng Với ý nghĩa trên tôi chọn đề tài: Tổng. .. trên cơ thể (thông thường dùng điều trị các khối u ung thư), những ứng dụng này được gọi là dẫn truyền thuốc bằng hạt từ tính Hạt nano từ tính có tính tương hợp sinh học được gắn kết với thuốc điều trị Lúc này hạt nano có tác dụng như một hạt mang Thông thường hệ thuốc /hạt tạo ra một chất lỏng từ và đi vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn Khi các hạt đi vào mạch máu, người ta dùng một gradient từ trường... các hạt này sẽ liên kết với nhau nhờ các enzym protease trong khối u Khối hạt liên kết này sẽ phát ra các tín hiệu từ mạnh, qua đó thông báo vị trí khối u qua cộng hưởng từ hạt nhân Bằng cách sử dụng các hạt nano hoặc các đầu dò nano có gắn kháng thể để tìm kiếm các tế bào ung thư, các virus, vi khuẩn gây bệnh ở mức độ nano mét nên cực kỳ nhạy nhờ vào phương pháp liên kết đặc hiệu kháng nguyên – kháng. .. công bố[8-9] (a) (b) Hình 1.1 Kết quả TEM của hạt nano Fe3O4 từ tài liệu tham khảo:(a)[27]; (b)[8] - Tình hình Nghiên cứu trong nước: Nhiều tác giả trong nước rất quan tâm đến việc tổng hợp các hạt nano từ tính để phục vụ cho việc ứng dụng trong y – sinh học như : 1 Nghiên cứu tổng hợp các hạt nanô từ phục vụ cho việc nghiên cứu chẩn đoán và điều trị bệnh tronglĩnh vực y sinh học.Chủ nhiệm đề tài TS... Sự định hướng ng của c các hạt siêu thuận từ khi có từ trường ng và khi từ t trường bị ngắt 1.4 Một ột số ứng dụng của hạt nano từ tính trong y – sinh học 1.4.1 Dẫn truyền thuốc[11 11] Khi vào trong cơ thể, , thuốc thu chữa bệnh sẽ phân bố không tập p trung nên các tế t bào mạnh khỏe bị ảnh hưởng ng do tác d dụng phụ của thuốc Chính vì thế việcc dùng các hạt h từ 23 tính như là hạt mang thuốc đến vị... (độ cảm từ) được phân loại chúng thành các vật liệu từ chính sau: nghịch từ, thuận từ, sắt từ, phản sắt từ, feri từ[ 1] 17 Bảng 1.2 Phân loại các loại vật liệu từ Loại vật liệu từ Độ cảm từ (χ) Nghịch từ Nhỏ và âm (cỡ -10-5 ) Sự sắp xếp các mômen từ nguyên tử Ví dụ Au (χ ~ 2,74.10-6) Cu (χ ~ 0,77.10-6) Các nguyên tử không có mômen từ Thuận từ Nhỏ và dương (cỡ 10-3÷10-5) Các nguyên tử có mômen từ định... Từ trường ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào được đánh dấu Các tế bào không được đánh dấu sẽ không được giữ lại và thoát ra ngoài 1.4.6 Chẩn đoán bệnh[ 13] Các hạt nano ôxít sắt siêu thuận từ đã phủ lớp tương thích sinh học thì được tiêm vào cơ thể bị ung thư Các hạt này đi liền vào khối u thông qua các lỗ ở tế bào nội mô của mạch máu nuôi dưỡng khối u Khi đã vào trong khối u các ... phát bệnh truyền nhiễm tương ứng Với ý nghĩa chọn đề tài: Tổng hợp hạt Nano từ tính có đính kháng thể ng dụng chẩn đoán bệnh đặc biệt đưa phương pháp đính kháng thể Vibrio Cholerae (01) để chẩn. .. ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ PTN CÔNG NGHỆ NANO TRẦN NGỌC TẠO TỔNG HỢP CÁC HẠT NANO TỪ TÍNH CÓ ĐÍNH KHÁNG TH ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH Chuyên ngành: Vật liệu Linh kiện Nano (Chuyên ngành đào tạo thí... thư), ứng dụng gọi dẫn truyền thuốc hạt từ tính Hạt nano từ tính có tính tương hợp sinh học gắn kết với thuốc điều trị Lúc hạt nano có tác dụng hạt mang Thông thường hệ thuốc /hạt tạo chất lỏng từ