báo cáo thí nghiệm hữu cơ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM KHOA KĨ THUẬT HĨA HỌC BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HỮU CƠ TP HCM, tháng 5, năm 2019 MỤC LỤC Trang I/ Mở đầu II/ Định nghĩa .2 III/ Cơ chế IV/ Cấu tạo V/ Các phương pháp định tính định lượng GC: VI/ Quy trình thực 10 VII/ Ứng dụng 11 VIII/ Kết luận 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO 18 I - - - -  II - - MỞ ĐẦU : Phương pháp sắc ký (PPSK) phát minh vào đầu kỷ XX nhà bác học Mikhail Semyonovich Tsvet (Nga) Vào thời điểm PPSK dùng chủ yếu cho việc tách cấu tử khỏi dựa hấp thu hấp phụ chọn lọc cấu tử riêng biệt hỗn hợp chất hấp phụ khác Ưu điểm PPSK đơn giản có khả tách lượng nhỏ chất có tính chất hóa học gần nên PPSK ngày sử dụng phổ biến để tách hỗn hợp khác chất hữu vô Điểm chung PPSK trình tách dựa chuyển dịch hỗn hợp phân tích qua lớp chất bất động trạng thái rắn lỏng tẩm chất mang rắn (pha tĩnh) chuyển dịch thực lưu chất (pha động) Ngoài chức tách, PPSK phương pháp có hiệu cao việc sử dụng để định tính định lượng hỗn hợp nhiều cấu tử Các PPSK phân loại dựa trạng thái pha động Có thể chia thành nhóm sắc ký lỏng (LC) sắc ký khí (GC) Ngồi có sắc ký lưu chất siêu tới hạn (SFC) Lưu ý sắc ký lỏng thực cột lẫn mỏng, sắc ký khí lưu chất siêu tới hạn tiến hành cột Chúng ta sâu tìm hiểu phương pháp sắc ký khí (GC) ĐỊNH NGHĨA: Sắc ký khí (GC- Gas Chromatography) phương pháp sắc ký mà pha động chất khí dạng pha tĩnh chứa cột chất rắn chất lỏng phủ bề mặt chất mang dạng rắn hay phủ lên thành phía cột tạo lớp màng phim mỏng Cơ sở tách sắc kí khí phân bố mẫu hai pha: pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động khí thấm qua tồn bề mặt tĩnh GC chia làm loại: + Sắc kí khí-rắn(GSC- Gas Solid Chromatography): pha tĩnh chất rắn Chất rắn nhồi cột thường silicagel, rây phân tử than hoạt tính Cơ chế tách chủ yếu hấp phụ + Sắc kí khí-lỏng(GLC- Gas Liquid Chromatography): pha tĩnh lỏng Chất lỏng bao bọc quanh bề mặt chất rắn trơ, gọi chất mang, tạo nên lớp phim mỏng Cơ chế tách phân bố mẫu lớp phim mỏng - III - - Mỗi thành phần hỗn hợp pha động qua pha tĩnh tương tác với pha tĩnh lực, lực chất với pha tĩnh khác nhau, chất có lực yếu với pha tĩnh thoát khỏi cột trước chất có lực mạnh với pha tĩnh khỏi cột sau Đó đặc trưng pha động pha tĩnh, trình chia tách xảy thay đổi nhiệt độ pha tĩnh áp suất pha động CƠ CHẾ: Trong sắc ký khí, pha động khí mang, thường khí trơ Pha tĩnh lớp phim phủ bề mặt chất mang rắn đặt cột Các cấu tử theo pha động tương tác với pha tĩnh Sự lực khác cấu tử pha tĩnh làm chúng di chuyển với vận tốc khác pha động hệ thống sắc kí Kết chúng tách thành dải pha động vào lúc cuối trình cấu tử theo trật tự tương tác với pha tĩnh Các cấu tử tương tác yếu trước cấu tử tương tác mạnh sau Detector phát cấu tử vẽ lại tín hiệu cấu tử thành loạt peak sắc ký đồ IV - CẤU TẠO: Cấu tạo hệ thống GC phức tạp Tuy nhiên phần quan trọng hệ thống khí mang, tiêm mẫu, cột đầu dò Hệ thống khí mang: - - - Khí mang cho hệ thống sắc ký khí thường khí trơ (N2, He, H2, Ar, ) Yêu cầu độ tinh khiết cao (tạp chất làm ảnh hưởng đến thiết bị kết phân tích ) Hệ thống cung cấp khí mang gồm điều áp (PRs), đo áp (PG) đo tốc độ dòng (flowmeter ) Tốc độ dòng kiểm sốt điều áp cho phù hợp với loại cột sử dụng Áp suất khí mang ổn định khoảng 10 đến 50 psi ứng với tốc độ dòng 30 – 50 ml/min (cột nhồi) – 25 ml/min (cột mao quản) Tiêm mẫu: - Để đưa mẫu cần phân tích vào cột, ta dùng tiêm mẫu Mẫu tiêm qua lớp silicone septum vào buống hóa (injector) Buồng tiêm thiết kế phù hợp với loại cột sử dụng gồm: buồng tiêm cho cột nhồi buồng tiêm cho cột mao quản Cột: - Gồm có loại cột nhồi cột mao quản sử dụng sắc ký khí + Cột nhồi (packed column): Được làm kim loại, độ dài từ – m, đường kính từ 1-5 mm Được nhồi hạt chất mang rắn phủ pha tĩnh + Cột mao quản (capillary column): Được làm thủy tinh, độ dài từ 10-100 m, đường kính từ 0,1 – 0,8 mm Pha tĩnh phủ mặt cột Cột mao quản có độ phân giải cao hơn, thời gian phân tích ngắn độ nhạy cao cột nhồi Cột mao quản Cột nhồi Đầu dò: - • Đầu dò có chức chuyển tính hiệu nồng đọ chất khỏi cột thành tính hiệu điện Ngồi có chức phát đo độ lớn cấu tử khỏi cột Có loại đầu dò thơng dụng TCD FID TCD (thermal conductivity dectector) : Các điện trở cầu kim loại trơ, có độ dẫn nhiệt tốt Cấu tử mẩu khỏi cột, vào nhánh cột Khi có diện mẫu làm thay đổi nhiệt độ Nhiệt độ phụ thuộc vào độ dẫn nhiệt chất khí bao quanh Khi phân tử hữu thay chất khí mang tính đãn nhiệt thay đổi nhiệt độ cấu tử tăng lên dẫn đến thay đổi điện trở Dựa thay đổi điện trở cầu, gây cân mạch, tạo tín hiệu dạng mũi sắc ký Đặc điểm: + Đơn giản, dùng mẫu hữu vô cơ, khơng phân hủy mẫu + Thời gian cho tín hiệu lớn nhạy • FID (flame-ionization detector) : Nhờ nhiệt độ cao lửa hydro, chất hữu từ cột tách vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy khơng khí để tạo thành ion trái dấu tương ứng Các ion tạo thành chuyển điện cực trái dấu nằm hai phía lửa Dòng ion giảm áp điện trở có số cao (1081012 Ω) độ giảm hiệu điện khuếch đại ghi lại Đặc điểm: - Khơng bị ảnh hưởng vận tốc khí mang - Thời gian chi tín hiệu nhỏ 0,1giây có độ nhạy gấp 1000 detector TCD - Giới hạn phát 10-12g/s - Tuy nhiên có điểm bất lợi phải dùng thêm hệ thống khí đốt, ngồi khí mang khơng dùng mẫu có khí như: SO 2, CO2, H2O, NOx Ngồi cấu tử mẫu bị phân hủy lửa nên dùng trường hợp muốn cho cấu tử qua tiếp thiết bị phân tích khác (ví dụ máy hồng ngoại) - Chỉ đáp ứng với hợp chất hữu cơ, khơng có đáp ứng khí bền nước - Độ ổn định cao bị ảnh hưởng tới thay đổi nhiệt độ tốc độ dòng - Khỏang động học từ 106-107 - Nhiệt độ làm việc tới 4000C - Phân hủy chất đòi hỏi khí: khí mang, hydro, oxi Các phương pháp định tính định lượng GC: V Định tính: Trong phân tích định tính, hai detector nhận diện hợp chất detector khối phổ detector hồng ngoại chuyển hóa Fourier Một peak nhận diện cách so sánh phổ chúng với thư viện phổ lưu giữ máy tính Một phương pháp tinh tế nhận diện thời gian lưu chất với thời gian lưu chất mẫu biết trước (mẫu chuẩn) cột có độ phân cực khác Cách đáng tin cậy so sánh thời gian lưu sắc kí đồ thu mẫu biết trước (mẫu chuẩn) thêm mẫu cần dò tìm vào điều kiện sắc kí Nếu chất cần dò tìm trùng với chất có mẫu chuẩn pic chất mẫu thêm có diện tích hay chiều cao tăng lên so với chưa thêm chất chưa biết vào Sự nhận diện mức thăm dò thực cột, khẳng định thực vài cột loại pha tĩnh khác  Định lượng: Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Đây phương pháp tính thành phần phần trăm mẫu cách đo diện tíchmtừng peak sắc kí đồ Theo cách đem diện tích pic chất quan tâm A cho tổng diện tích peak:  - - - %A = dien tích peak A x100% tong dien tích peak - - Khi phân tích thành phần có điểm sôi sát dãy đồng đẳng, phương pháp dùng để tính tỷ lệ phần trăm khối lượng Phương pháp tất cấu tử rửa giải đáp ứng detector với cấu tử giống Nếu điều kiện thõa mãn phương pháp nhanh hiệu Phương pháp tính theo hệ số hiệu chỉnh: Như biết detector đáp ứng khác chất khác Vì cần phải tính hệ số hiệu chỉnh Nhờ hệ số tính thành phần phần trăm cấu tử mẫu %A = dien.tich.cua A / F ( A) dien.tich.cua Ai / F ( Ai ) Phương pháp lập đường chuẩn: - - - Lập đường chuẩn riêng rẽ cấu tử hỗn hợp cách tiêm thể tích loạt dung dịch hỗn hợp chất chuẩn có nồng độ khác Như loạt nồng độ chất chuẩn phân tích diện tích chúng xác định Một đường chuẩn dựng cho cấu tử với trục nồng độ trục diện tích tương ứng để kiểm tra tuyến tính đáp ứng detector Tiêm thể tích mẫu có cấu tử cần phân tích chạy sắc kí điều kiện chạy chuẩn Từ diện tích thu cấu tử cần phân tích đường chuẩn vừa thiết lập suy nồng độ chúng Từ nguyên tắc nêu, để định lượng chất X, phải thực công việc theo bước sau đây: + Pha dãy mẫu chuẩn chất X, ví dụ C0, C1, C2, , C5 + Pha mẫu phân tích điều kiện dãy mẫu chuẩn + Chọn điều kiện chạy sắc ký (quy trình phân tích GC) + Chạy sắc ký mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu phân tích + Đo chiều cao H hay diện tích S pic sắc ký chất 10 + Dựng đô thị chuẩn H - Cx (hay S – Cx) + Phát chất X nhờ đồ thị chuẩn giá trị Hx hay Sx Dãy mẫu chuẩn X(ppm) H(cm) S(mm2) - - C1 H1 S1 C2 H2 S2 Mẫu phân tích C3 H3 S3 C4 H4 S4 C5 H5 S5 Cx1 Hx1 Sx1 11Equation Section (Next) Phương pháp dùng chuẩn nội: Trong phương pháp định lượng, phương pháp chuẩn nội có độ xác cao độ xác khơng phụ thuộc vào độ lặp lại q trình bơm mẫu Trong phương pháp này, người ta thêm vào mẫu chất chuẩn có nồng độ biết trước gọi chất nội chuẩn ( internal standard) Chất nội chuẩn chất khác với cấu tử mẫu khảo sát ( phải có tính chất hóa lý gần với cấu tử khảo sát) cấu tử có mặt sắc ký đồ Nếu chất nội chuẩn thành phần hỗn hợp phân tích thành phần khối lượng cấu tử khảo sát tính theo cơng thức sau: % cau tu i = si ki mR × ×100 sR k R mmau Trong đó: mR – khối lượng chất nội chuẩn thêm vào mẫu mmẫu – khối lượng mẫu Ki , KR – hệ số hiệu chỉnh cấu tử I nội chuẩn R xác định từ mẫu chuẩn VI Cx2 Hx2 Sx2 Quy trình thực hiện: Xác định mục tiêu phân tích: Chuẩn bị mẫu: 11 Có mẫu có hàm lượng tương tự có mẫu bên cạnh cấu tử mẫu chứa số cấu tử với hàm lượng vết - Có mẫu có cấu tử với nhiệt độ sơi khác khoảng rộng - Mẫu dạng dung dịch có dạng khí dạng rắn - Mẫu chứa nhiều cấu tử phân cực chứa nhiều cấu tử phân cực - Làm mẫu Chọn Detector: - Vấn đề đặt cần biết thông tin mẫu hay cần detector chun biệt dò tìm một nhóm cấu tử đặc biệt mẫu Chọn cột: - - - - Những chọn lựa pha tĩnh, đường kính cột chiều dài cột Chọn pha tĩnh theo nguyên tắc chất có cấu tạo giống tương tác tốt với Các pha tĩnh khơng phân cực sử dụng nhiều Pha tĩnh có độ phân cực trung bình sử dụng hầu hết phép tách mà pha tĩnh không phân cực Đối với hợp chất phân cực cao cột phân cực mạnh cần thiết.Các đồng phân quang học hợp chất có cấu trúc hình học gần giống đòi hỏi pha tĩnh đặc biệt cho phép tách Giữa đường kính cột bề dày lớp phim có mối quan hệ việc ảnh hưởng đến độ phân giải Độ phân giải cao đạt cột hẹp với pha tĩnh mỏng nhất.Sự kết hợp làm giảm thiểu độ trở kháng chuyển khối (số hạn C phương trình Van Deemter) hai pha tĩnh pha động nhờ làm giảm chiều cao đĩa lý thuyết Chọn phương pháp tiêm mẫu - Chế độ tiêm mẫu chia dòng - Chế độ tiêm mẫu khơng chia dòng - Tiêm mẫu cột Chương trình hóa nhiệt độ áp suất VII Ứng dụng: 12 DETERMINATION OF NEUTRAL SUGARS IN GLYCOPROTEINS BY GAS-LIQUID CHROMATOGRAPHY Mục đích: xác định đường trung tính glycoproteins phương pháp sắc ký khí lỏng Mục tiêu: Sử dụng phương pháp sắc khí khí lỏng Thiết bị sử dụng: - Máy sắc ký khí Microtek Model 220 trang bị với lập trình nhiệt FID ( detector ion hóa lửa) Đầu tiêm phun chỉnh sửa kính (8.4cm x 1cm O.D x 0.25cm I.D) Cột ống hình chữ U 4mm I.D x 1.83m Máy sấy ly tâm sinh học VirTis Research Equipment, Model 10-310 x 50mm ống cấy Kimax x 50mm ống dùng cho máy ly tâm sử dụng lần Điều kiện cho sắc ký là: Nhiệt độ cột: vào 1600C, 2100C Chương trình nhiệt: 1.30C/phút Nhiệt độ đầu dò: 3250C Nhiệt độ kim phun: 2250C Nhiệt độ truyền nhiệt: 2350C Hydrogen (tới đầu dò): 50mL/phút Khơng khí (tới đầu dò đốt): 189mL/phút Khơng khí (tới đầu dò làm sạch): 189mL/phút Nitrogen (khí mang): 40mL/phút Tốc độ biểu đồ: 30inch/h Đối tượng mẫu: đường trung tính glycoproteins Chuẩn bị hóa chất mẫu: • • • • Pyridine hồi lưu vòng 1h với ninhydrin chưng cất giữ khô KOH Sodium borohydride lấy từ công ty Fischer Scientific Các mẫu Carbonhydrate chuẩn lấy từ Calbiochem kết tinh lại chạy chuẩn thơng số qua sắc ký khí Orosomucoid chuẩn bị phương pháp Bezkorovainy Winzler 13 o o o o o o o Mẫu Glycoprotein, từ 0.1mg đến 3mg chứa khoảng 0.1μmole đường trung tính làm khô x 50mm ống cấy Và ly tâm hút ẩm đồng thời thủy phân hồn tồn Sau phân tán 50μL nước 50μL 40% w/v huyền phù Dowex 50 X2 (H+) lưới nhựa 200/400 0.02N HCl Sau bọc kín đun nước 40h Mẫu lấy khỏi thủy phân làm nguội, sau thêm vào 50μL chất nội chuẩn chứa 0.0277 tới 0.2771 μmole arabitol, bơm thẳng qua vách ngăn vào mẫu Mẫu khuấy ly tâm phút với 2800 r.p.m để lắng mẫu khỏi vách ngăn vách ống cấy Tháo bỏ vách ngăn thêm vào 0.4mL H2O vào ống Hỗn hợp chuyển sang cột chứa Dowex X8 (HCO3-) Tiến hành rửa giải với ống khử trùng 12mL Những cột gắn vách ngăn nhựa 200/400 với thủy tinh tẩm 50μL 20% w/v huyền phù Dowex X8 (HCO3-) Bông thủy tinh thêm vào để tách Dowex X8 (HCO3-) khỏi Dowex 50 X2 (H+) dùng thủy phân Các ống thủy phân rửa hai lần với 0.3mL nước cất Quá trình rửa giải cột tiếp tục với 1mL 50% w/v huyền phù methanol-nước, kết hợp với máy làm khô sinh học áp suất thấp Dư lượng ống khử trùng hình nón hòa tan 100μL nước chuyển sang x 50mm ống ly tâm polyethylene pipette Lang-Levy 100μL Ống ly tâm rửa với 100μL nước hai lần, chuyển sang x 50mm ống Tiếp mẫu làm khô máy sấy sinh học áp suất thấp Mẫu hòa tan 50μL nước đặt nhiệt độ phòng 1h với 50μL 0.22M NaBH4 Lượng dư NaBH4 xử lý 50μL acetic acid lạnh, mẫu làm khô máy sấy sinh học Borate lấy trimethyl borate dễ bay cách cho 100μL chia thành phần 1:1000 v/v HClmethanol, đem sấy khô máy sấy khô sinh học sau lần thêm Các mẫu thường giữ qua đêm giai đoạn máy hút ẩm 14 o Các mẫu acetyl hóa 15p với nhiệt độ 100 0C với 50μL pyridine 50μL acetic anhydride Sau lấy ra, trộn đặt vào nước 15p Các mẫu làm nguội 1-10 μL tiêm thẳng vào máy sắc ký khí Các mẫu giữ tháng giai đoạn mà khơng bị hư Kết 15 Thí nghiệm áp dụng số hỗn hợp Glycoprotein Hình sắc ký đồ việc phân tích protein orosomucoid, canine submaxillary mucin glycopeptide sinh từ hoạt động trypsin Thành phần loại đường galactose, mannose fucose hỗn hợp tính theo cơng thức: Kết tính tốn: Xác định số RF: RF monosaccharide tính chất nội chuẩn Arabitol Mẫu loại làm khô 48 76oC áp suất Mẫu cân từ 9,5 – 10 mg pha loãng vừa đủ 5mL nước cất 20 µL mẫu chứa micro tube cô đặc đến khô áp suất Sau mẫu khử NaBH4 0,11M acetyl hóa RF monosaccharide xác định theo công thức: 16 RF số monosaccharide: VIII KẾT LUẬN: GC phát triển nhanh thập kỷ sau phát minh vào năm 1952 phần lớn giữ nguyên ngày Tính linh hoạt GC đại mở rộng lĩnh vực ứng dụng Tài liệu chip GC-on-a-chip James Lovelock thực lời nói vào đầu năm 1970 Nó chế tạo chip Magiê oxít, nhỏ 50 x 20 mm Đã có số cố gắng 17 để đưa GC-on-a-chip vào thực tế thất bại Tuy lịch sử hình thành phát triển vỏn vẹn 50 năm, nhiên GC phương pháp phân tích đại bậc ngày Với tính ứng dụng to lớn kỹ thuật nói chung ngành Hóa nói riêng, GC không ngừng phát triển khai thác để ngày tiến TÀI LIỆU THAM KHẢO: Nguyễn Thị Thu Vân “Phân tích định lượng”; Keith D Bartle, Peter Myers “History of gas chromatography, trends in analytical chemistry vol.21”; Lehnhardt, W F., and Richard J Winzler "Determination of neutral sugars in glycoproteins by gas—liquid chromatography." Journal of Chromatography A 34 (1968): 471-479 James W Zubrick “Gas chromatography, The organic chem lab survival manual”; 18 Phạm Luận,“Phương pháp phân tích sắc ký chiết tách”; Và tiểu luận môn học cac anh chị trước… 19 ... Đặc điểm: + Đơn giản, dùng mẫu hữu vô cơ, không phân hủy mẫu + Thời gian cho tín hiệu lớn nhạy • FID (flame-ionization detector) : Nhờ nhiệt độ cao lửa hydro, chất hữu từ cột tách vào detector... hoạt tính Cơ chế tách chủ yếu hấp phụ + Sắc kí khí-lỏng(GLC- Gas Liquid Chromatography): pha tĩnh lỏng Chất lỏng bao bọc quanh bề mặt chất rắn trơ, gọi chất mang, tạo nên lớp phim mỏng Cơ chế tách... cho cấu tử qua tiếp thiết bị phân tích khác (ví dụ máy hồng ngoại) - Chỉ đáp ứng với hợp chất hữu cơ, khơng có đáp ứng khí bền nước - Độ ổn định cao bị ảnh hưởng tới thay đổi nhiệt độ tốc độ dòng