TÁCH CHIẾT và xác ĐINH HOẠT độ PEPSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSSON

BÀI 3: TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐINH HOẠT DỘ PEPSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSSON I   II MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Tách enzyme pepsin từ dày heo Xác định hoạt độ enzyme thô NGUYÊN TẮC Enzyme pepsin giải phóng từ màng nhầy dày động vật tự phân mơi trường acid lỗng Dung dịch sau tự phân chứa pepsin dạng hòa tan thành phần protein khác Sự tinh enzyme thực sau thu nhận chế phẩm enzyme thô nhờ vào tác nhân gây tủa Trong môi trường acid, pepsin (pepsin A, EC 3.423.1) phân giải Hemoglobin thành Tyrosine Tryptophane hòa tan TCA Xác định hàm lượng Tyrosine Tryptophane nhờ vào thuốc thử Folin – Ciocalteu III TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM Thu nhận enzyme từ dày bò muối Dạ dày heo giết mổ, xử lý thô sau bảo quản điều kiện nhiệt độ thấp với có mặt chloroform 5% Thời gian tối đa cho trình bảo quản 48 Cân khối lượng niêm mạc m1 (g) Tự phân enzyme: Tách lớp niêm mạc thô từ dày, xay nhỏ với máy xay sinh tố dung dịch HCl 0.5% (tỉ lệ 1:2 theo khối lượng) Sau cho vào chậu thuỷ tinh lớn, đậy kín, để yên nhiệt độ 40 – 42oC bể ổn nhiệt với thời gian 24 - 28 Tiến hành lọc dung dịch qua vải lọc (từ 2- lần), loại bỏ tạp chất cách lọc qua bơng Thu dung dịch có enzyme thơ dùng tiến hành thử hoạt tính + Thu chế phẩm pepsin thô: Tiến hành thu kết tủa pepsin dung dịch muối NaCl 25% với tỷ lệ 1:4, cho từ từ dung dịch muối vào kết hợp với khuấy đảo liên tục để tránh sinh nhiệt hỗn hợp Thời gian từ – 10 phút, nhiệt độ khoảng 5oC Tiến hành ly tâm với tốc độ 6000v/phút 15 phút Với tác nhân tủa muối trung tính cần qua thẩm tích để giải phóng bớt lượng muối hỗn hợp Sau tiến hành sấy khơ máy sấy khơng khí, nhiệt độ 30 – 40oC khoảng –2 Cân khối lượng chế phẩm m2 (g) 2 Lập đường chuẩn Tyrosine Bảng 1: Lập đường chuẩn Tyrosine kết đo OD Ống Tyrosine chuẩn 1mM (ml) HCl 0,2 N (ml) NaOH 0,5 N (ml) Folin pha loãng lần (ml) 0,2 4,8 0,4 4,6 0,6 4,4 0,8 4,2 10 Lượng tyrosine (mol ) 0,2 0,4 0,6 0,8 Lắc mạnh sau – 10 phút OD660nm ? ? ? ? ? ? (1mol =103mmol = 106mol) Ống ống kiểm chứng (KC) Các ống khác ống thí nghiệm (TN) Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) mẫu chế phẩm enzyme Bảng 2: Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) mẫu chế phẩm enzyme kết đo OD Ống (mẫu thí Ống (mẫu Chất dùng Hiện tượng nghiệm) kiểm chứng) Hb 2% 25oC (ml) Xuất kết tủa TCA 5% (ml) 10 nâu Enzyme pepsin (ml) 0,1 Nước (ml) 0,9 Giữ 10 phút Không cần giữ Thời gian o 35,5 C 10 phút Ống xuất kết TCA 5% (ml) 10 tủa nâu với lượng lớn ống Sau 30 phút đem lọc lấy dung dịch Hút 5ml dung dịch lọc từ hai ống nghiệm chuyển sang ống Thu dịch nghiệm vàng Ống nghiệm NaOH 0,5 N (ml) 10 Lắc mạnh Dung dịch bị đổi Folin pha loãng lần sang màu xanh (ml) Màu ống đậm màu ống Lắc đều, để yên sau 5-10phút ? ? OD  = 660 nm Xác định hoạt độ đông tụ sữa Chuẩn bị ống nghiệm: mẫu, PCN, PDD Hút ống ml sữa Cho vào ống PCN PDD tương ứng 0,1ml dịch chiết Enzyme Pepsin công nghiệp Enzyme Pepsin dày Quan sát thời gian đông tụ IV GIẢI THÍCH THÍ NGHIỆM Tác dụng chất cho vào q trình xác định hoạt tính pepsin: Khi cho TCA 5% vào ống nghiệm chứa Hb 2% 25 oC TCA làm Hb kết tủa ống xuất kết tủa nâu, ống khơng có TCA nên khơng bị kết tủa TCA kết tủa Hb ống để cho enzyme vào enzyme khơng chất để phân giải, ống khơng có TCA cho enzyme vào enzyme phân giải Hb tạo chất tan TCA Sau cho Enzyme pepsin nước vào hai ống để lúc sau tiếp tục cho TCA vào ống kết tủa nâu xuất TCA cho vào lúc sau có tác dụng tủa Hb enzyme dư Dịch lọc từ hai ống bổ sung NaOH Folin để đo OD Ta bổ sung môi trường NaOH 0.5N Folin xảy phản ứng màu với Tyrosine môi trường kiềm V KẾT QUẢ Thu nhận enzyme từ dày bò muối Hiệu suất chiết tách tính cơng thức Sau ly tâm không thu tủa enzyme dày Nguyên nhân: enzyme tách chiết để lâu nên bị phân hủy, sau ly tâm ta khơng thu tủa enzyme Ta có khối lượng m1 nên khơng thể tính hiệu suất thu nhận enzyme muối 2 Lập đường chuẩn Tyrosine Hình 1: Mẫu Tyrosin đo OD  Kết đo OD Ống Tyrosine chuẩn 1mM (ml) OD660nm 0 0,2 0,051 0,4 0,113 0,6 0,156 0,8 0,229 0,310 Đường chuẩn Tyrosin 0.35 OD 660nm 0.3 0.25 f(x) = 0.32x - 0.02 R² = 0.99 0.2 0.15 0.1 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Tyrosin 0.7 0.8 0.9 1.1 Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) mẫu chế phẩm enzyme Hình 2: Sau bổ sung dung dịch Hb 2%, TCA 5%, Pepsin, Nước Hình 4: Dịch lọc từ ống nghiệm sau 30 phút  Kết đo OD Hình 3: Bổ sung TCA 5% vào ống sau 10 phút Hình 5: Dịch lọc sau thêm NaOH 0,5N Folin để đo OD Chất dùng Ống ODTN (mẫu thí nghiệm) Ống ODKC (mẫu kiểm chứng) OD  = 660 nm 0,045 Dựa vào phương trình đường chuẩn tyrosin y = 0,3039x – 0,0088 Và kết ODTN (mẫu thí nghiệm) = 0,045 Ta có lượng tyrosin x = (0,045+0,0088)/0.3039 = 0,177 (µmol) a: Tỉ lệ thể tích mẫu thí nghiệm (16/5=3,2) v: Thể tích dung dịch đem xác định (0,1ml) t : Thời gian thuỷ phân 10 phút 1,82: số giá trị cường độ màu 25OC Xác định hoạt độ đông tụ sữa Ống mẫu Ống Ống PCN PDD Hình 6: sữa đông tụ sau cho enzyme pepsin vào Kết quả: sữa bị đông tụ sau thời gian t = 275 giây Xác định hoạt độ đông tụ sữa pepsin dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ dung dịch sữa loại béo có nồng độ xác định Cơng thức tính: F: hoạt độ đơng tụ sữa E: lượng enzyme tham gia (mg) t: thời gian (phút giây) Thời gian động tụ sữa enzyme công nghiệp: t=6s  Hoạt độ đông tụ sữa: Thời gian đông tụ sữa enzyme dày :t = phút 57s = 597s  Hoạt độ đông tụ sữa: VI KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ Trả lời câu hỏi 1) Giải thích phải chiết pepsin môi trường acid ? Pepsin hoạt động ổn định môi trường axit 37 - 42°C pH 1.5 – 2.0 Pepsin hoạt động tối đa pH 2.0 không hoạt động pH 6.5 trở lên để giữ ngun hoạt tính enzyme sau tách chiết phải thực mơi trường acid Ngồi pepsin có dày với pH acid nên cần giữ chúng môi trường acid để enzyme khơng bị biến tính Pepsin dày tiết dạng tiền pepsin pepsinogen môi trường acid pepsinogen chuyển thành pepsin có hoạt tính phân giải protein 2) Mơ tả chế phẩm thu Chế phẩm tự nhiên có dạng bột màu trắng hay vàng, vơ định hình có mùi nước thịt, vị chua Người ta thêm vào chế phẩm chất tinh bột hay dextrin để bảo quản Điều kiện giữ chế phẩm cần khơ, kín (trong lọ màu) nhiệt độ 5oC Nhận xét: Không thu khối lượng enzyme tử muối nên khơng tính hiệu suất thu hồi Hoạt độ đông tụ sữa pepsin dày thấp nhiều so với enzyme công nghiệp ... thích phải chiết pepsin mơi trường acid ? Pepsin hoạt động ổn định môi trường axit 37 - 42°C pH 1.5 – 2.0 Pepsin hoạt động tối đa pH 2.0 khơng hoạt động pH 6.5 trở lên để giữ nguyên hoạt tính... trị cường độ màu 25OC Xác định hoạt độ đông tụ sữa Ống mẫu Ống Ống PCN PDD Hình 6: sữa đơng tụ sau cho enzyme pepsin vào Kết quả: sữa bị đông tụ sau thời gian t = 275 giây Xác định hoạt độ đông... kiểm chứng (KC) Các ống khác ống thí nghiệm (TN) Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) mẫu chế phẩm enzyme Bảng 2: Xác định hoạt tính pepsin (hoạt tính chung) mẫu chế phẩm enzyme kết đo OD