Thiết lập phản ứng real time PCR phát hiện và phân biệt vi khuẩn gram + và gram

1 TÓM TẮT Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Bé Hương Giảng viên hướng dẫn: TS Trần Nhật Phương Đề tài: “Thiết lập phản ứng Real time PCR phát phân biệt vi khuẩn Gram [+] Gram [-]” thực từ tháng 09/2018 đến tháng 01/2019 phòng thí nghiệm Cơng ty TNHH Dịch Vụ Thương Mại Nam Khoa Đề tài thực gồm nội dung sau: - Nội dung 1: Cấy phân lập chủng vi khuẩn môi trường đĩa thạch phù - hợp Nội dung 2: Ly trích DNA vi khuẩn Nội dung 3: Thiết lập phản ứng Real-time PCR sử dụng màu huỳnh quang - Eva green Nội dung 4: Ghi nhận đỉnh chảy vi khuẩn Gram [+] Gram [-] Khảo sát mẫu vi khuẩn kiểm chủng Qua thực nghiệm, thu số kết sau: Đỉnh chảy vi khuẩn Gram [+]: 91oC Đỉnh chảy vi khuẩn Gram [-]: 90oC MỤC LỤC Table of Contents DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT PCR Polymerase Chain Reaction DNA DeoxyRibonucleide Acid dNTP Deoxiribonucleotide triphosphat BA Blood Agar MC Mac Conkey Agar CAXY Chocolate Agar BHI Brain Heart Infusion DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Sơ đồ 3.1 Quy trình phân biệt vi khuẩn Gram [+] Gram [-] Bảng 4.1 Bảng ghi nhận đỉnh chảy nhóm vi khuẩn Gram [+] Biểu đồ 4.1 Đường biểu diễn khuếch đại chủng vi khuẩn Gram [+] Bảng 4.2 Bảng ghi nhận đỉnh chảy nhóm vi khuẩn Gram [-] Biểu đồ 4.2 Đường biểu diễn khuếch đại chủng vi khuẩn Gram [-] DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Hình dạng vi khuẩn Hình 2.2 Cấu trúc vách tế bào vi khuẩn Gram [+] Hình 2.3 Cấu trúc vách tế bào vi khuản Gram [-] Hình 2.4 Nguyên tắc kỹ thuật nhuộm Gram dựa vào khác vách tế bào vi khuẩn Gram [+] Gam [-] Hình 2.5 Quy trình nhuộm Gram Hình 2.6 Cầu khuẩn Gram [+] Trực khuẩn Gram [-] Hình 2.7 Nguyên tắc kỹ thuật Real-time PCR Hình 2.8 Cơ chế hoạt động SYBR GREEN Hình 2.9 Cơ chế hoạt động Tapman probe Hình 2.10 Cơ chế hoạt động probe lai Hình 3.1 Cấy phân lập E coli môi trường MC Staphylococcus aureus môi trường BA CHƯƠNG 1.1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Vi khuẩn loài sinh vật bậc thấp, tồn gần nơi, tăng trưởng nhanh điều kiện thích hợp, khơng thể qua sát mắt thường kích thước vi khuẩn nhỏ Vi khuẩn nhà khoa học chia làm loại: Gram [+] Gram [-] Vi khuẩn Gram [+] với màng dày nguy hiểm với người Cơ thể có khả sản sinh hợp chất, công màng ngồi vi khuẩn Gram dương từ tiêu diệt chúng Còn vi khuẩn Gram âm, chúng có tới hai lớp màng Đặc biệt màng bọc nang Nó khơng cản thuốc nhuộm Gram mà cản kháng nguyên thể thuốc kháng sinh Vì vậy, vi khuẩn Gram âm nguy hiểm vi khuẩn Gram dương Hai nhóm vi khuẩn Gram [+] Gram [-] phân biệt cách nhuộm Gram, đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đan Mạch tìm cách phân biệt chúng, Hans Christian Gram Đây bước nghiên cứu vi khuẩn học, đóng vai trò quan trọng phác đồ điều trị bệnh nhiễm khuẩn Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử ngày phát triển, kỹ thuật nhuộm Gram khơng phương pháp phổ biến phòng thí nghiệm vi sinh, có loại vi khuẩn mà nhà khoa học gọi vi khuẩn thứ ba, không phản ứng rõ ràng với phương pháp nhuộm Gram Chlamydia, Legionelles, Pseudomonas, … Từ hạn chế nêu kỹ thuật nhuộm Gram, thực đề tài “Thiết lập phản ứng Real time PCR phát phân biệt vi khuẩn Gram [+] Gram [-]” 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài nhằm mục tiêu thiết lập phản ứng Real time PCR để phát vả phân biệt vi khuẩn Gram [+] Gram [-] 1.3 Ý nghĩa đề tài Kỹ thuật Real-time PCR khắc phục mặt hạn chế kỹ thuật nhuộm Gram, với ưu điểm sau: độ xác cao, sai sót khơng phụ thuộc nhiều vào thao tác người thực CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan vi khuẩn 2.1.1 Định nghĩa Vi khuẩn đơn bào khơng có màng nhân, thuộc nhóm Procaryote, quan sát kính hiển vi Là nhóm diện đông sinh giới, vi khuẩn diện khắp nơi đất, nước dạng cộng sinh với sinh vật khác, có đầy đủ đặc điểm vi sinh vật khả tự tổng hợp chất dinh dưỡng để phát triển nhân lên Tổng sinh khối vi khuẩn Trái đất nhiều tất loài thực vật động vật cộng lại 2.1.2 Đặc điểm Vi khuẩn loài vi sinh vật xuất trái đất, 3.5 tỷ năm trước Đó vi sinh vật hóa thạch để lại vết tích tầng đá cổ, giống với vi khuẩn lam ngày Có kích thước nhỏ bé, phân bố khắp nơi Trái đất có nhiều chủng loại Trong q trình tiến hóa lâu dài vi khuẩn tạo cho chế điều hòa trao đổi chất để thích ứng với điều kiện sống khác nhau, kể điều kiện bất lợi Vi khuẩn thiếu bào quan lục lạp ty thể, chúng khơng có nhân thực tế bào nhân chuẩn Thay vào đó, nhân tế bào gồm chuỗi ADN khơng có thành phần protein khơng có màng nhân Vi khuẩn có màng tế bào thành tế bào, thường làm peptidoglycan Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh Phương thức sinh sản vi khuẩn sinh sản vơ tính cách nhân đơi tế bào, số lượng tế bào tăng lên theo cấp số nhân 2.1.3 Phân loại vi khuẩn Để phân loại khuẩn, nhà khoa học vào hình thái đặc tính sinh học 2.1.3.1 Phân loại theo hình dạng vi khuẩn Mỗi loại vi khuẩn có hình dạng kích thước định, vách tế bào vi khuẩn định Hình thái tiêu chuẩn quan trọng đóng vai trò định hướng, đồng thời kết hợp với với yếu tố khác tính chất sinh vật hoá học, kháng nguyên vi khuẩn khả gây bệnh để phân loại vi khuẩn Vi khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau, chia làm nhóm sau: - Cầu khuẩn (cocci): vi khuẩn hình cầu, hình bầu dục hình nến Khi vi khuẩn hình cầu đứng giáp thường khơng tròn mà chỗ tiếp giáp thường dẹt lại - Trực khuẩn (bacillus): vi khuẩn hình que, hai đầu tròn vng, đầu phình to - Xoắn khuẩn (spirillum): vi khuẩn hình sợi lượn sóng di động 10 Hình 2.1 Hình dạng vi khuẩn A-Trực khuẩn; B-Liên cầu khuẩn; C-Tụ cầu khuẩn; D-Song cầu khuẩn; E-Xoắn khuẩn; F-Phẩy khuẩn 2.1.3.2 Phân loại theo trình trao đổi chất Dựa vào nguồn cacbon nguồn lượng, người ta phân loại vi khuẩn thành kiểu sau: - Vi khuẩn quang tự dưỡng Vi khuẩn hóa tự dưỡng Vi khuẩn quang dị dưỡng Vi khuẩn hóa dị dưỡng 2.1.3.3 Phân loại theo hình thức hô hấp Dựa vào phản ứng với oxy, vi khuẩn xếp vào nhóm: - Vi khuẩn hiếu khí: mọc có diện - oxy Vi khuẩn kị khí: mọc khơng có oxy Vi khuẩn hiếu khí/kị khí tùy ý: mọc có hay khơng có diện oxy 2.1.3.4 Phân loại theo bắt màu thuốc nhuộm Một công cụ quan trọng để phân loại vi khuẩn nhuộm Gram Nhuộm Gram giúp phân vi khuẩn thành nhóm: Gram [+] 30 - MgCl2 3mM - H2O 31 3.3 Phương pháp nghiên cứu Chủng vi khuẩn Cấy phân lập vi khuẩn Ly trích DNA vi khuẩn Khuếch đại gen 16S DNA kỹ thuật Real-time PCR sử dụng màu chèn Eva green Chạy chương trình phân tích đường cong chảy (melt curve) Phân tích kết theo đỉnh chảy Ghi nhận đỉnh chảy theo nhóm Sơ đồ 3.1 Quy trình phân biệt vi khuẩn Gram [+] Gram [-] 3.3.1 Cấy phân lập Cấy phân lập để kiểm tra trình giữ chủng, chủng vi khuẩn có tốt hay khơng Chủng giữ cryotube có nắp vặn chứa BHI+20% Gly, bảo quản -80oC Các bước thực hiện: - Dùng cồn khử trùng bề mặt làm việc, đợi khô đốt đèn cồn Dùng bút ghi lên đáy hộp petri tên mẫu, ngày cấy, người cấy 32 - Đốt que cấy lửa đèn thao tác lấy mẫu Cấy phân lập chiều Sau cấy đặt úp petri lại, gói lại đặt vào tủ ấm 35-37 oC 1618 Hình 3.1 Cấy phân lập E coli môi trường MC Staphylococcus aureus môi trường BA 3.3.2 Ly trích DNA vi khuẩn - Bước 1: Dùng que cấy bắt 1-2 khuẩn lạc hòa vào 500µl TE 1X, - vortex tạo thành dung dịch huyền phù đồng Bước 2: Đun bể ủ nhiệt 95oC – 10 phút Bước 3: Chuyển nhanh vào đá giữ phút Bước 4: Ly tâm 13000 vòng/phút phút Bước 5: Hút chuyển dịch chứa DNA vi khuẩn cần sang eppendoft giữ -20oC sử dụng 3.3.3 Kỹ thuật real-time PCR sử dụng màu chèn Eva green - Sau ly trích, dịch ly trích DNA vi khuẩn sử dụng cho phản ứng Real-time PCR sữ dụng màu chèn Evagreen khuếch đại - vùng gen 16S Chuẩn bị PCR master mix: • Taq polymerase • Mồi xi, mồi ngược • MgCl2 33 - • dNTP: dATP, dTTP, dCTP, dGTP • Dung dịch đệm • Nước Phân phối PCR mix theo số lượng mẫu với thể tích 15µl Hút chuyển 5µl dịch DNA vi khuẩn tương ứng cho PCR mix Ly tâm lắng khoảng giây để thành phần lắng xuống Thiết lập chu trình nhiệt máy Real-time PCR sau: 95 oC 15 phút, sau lặp lại 40 chu kỳ với bước: biến tính 95 oC 15 giây, gắn mồi 53oC 30 giây, tổng hợp DNA 72oC phút (đọc tín hiệu bước này) Cuối phản ứng trì 72oC phút 3.3.4 Chạy chương trình đường cong chảy (melt curve) Để phân biệt vi khuẩn Gram [+] Gram [-] ta dựa vào tính chất đặc trưng giúp phân biệt thành phần số lượng nucleotide đoạn gen 16S vi khuẩn nhiệt độ chảy (melting T o, Tm), nhiệt độ làm cho 50% sợi đôi DNA bị biến tính thành sợi đơn Tm = 4oCx(G+C) + 2oCx(A+T) Sự khác thành phần GC nhóm vi khuẩn => Tm khác - Chạy chương trình đường cong nóng chảy 72oC – 95oC Mỗi mơt bước nhiệt tăng 0.2oC giữ giây, đọc tín hiệu 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Ghi nhận đỉnh chảy theo nhóm vi khuẩn 4.1.1 Ghi nhận đỉnh chảy theo nhóm vi khuẩn Gram [+] Thực khảo sát đại diện nhóm vi khuẩn Gram [+], sử dụng chủng chuẩn: Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes Thực bước ly trích DNA Bắt 1-2 khuẩn lạc hòa vào eppendoft có chứa sẵn 200μl dung dịch TE 1X, vortex tạo huyền phù đồng Sốc nhiệt 95 oC 10 phút, chuyển nhanh vào đá giữ phút Sau đó, ly tâm 14000 vòng/phút phút, hút chuyển 100μl dịch chứa DNA vi khuẩn cần sang eppendoft giữ -20oC sử dụng Sauk ly trích, dịch ly trích DNA vi khuẩn sử dụng cho phản ứng Real-time PCR sử dụng màu chèn Evagreen khuếch đại vùng gen 16S Thực rã đông tube PCR mix eppendoft chứa dịch ly trích, spin giây để tạo dịch đồng Phân phối mix theo số lượng mẫu với thể tích 15μl Hút chuyển 5μl dịch ly trích DNA vi khuẩn tương ứng cho tube Chứng (-) có 15μl PCR mix Thực xong mẫu phải đóng nắp lại tránh ngoại nhiễm đánh số thứ tự cho tube Ly tâm lắng khoảng giây để tất dung dịch nằm đáy tube Chuyển tube vào máy Real-time PCR theo số thứ tự đánh số, kiểm tra đóng nắp tube thật kỹ Thiết lập chu trình nhiệt cho máy Real-time PCR máy tính Lưu file liệu v máy tính Sau kết thúc trình Real-time PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để phân tích Ở chủng vi khuẩn Gram dương ta ghi nhận kết sau: 35 Enterococcus Streptococcus Bacillus Biểu đồ 4.1 Đường biểu diễn khuếch đại chủng vi khuẩn Gram [+] Biểu đồ 4.2 Biểu đồ biểu diễn đỉnh chảy chủng vi khuẩn Gram [+] Từ biểu đồ trên, ta ghi nhận đỉnh chảy chủng vi khuẩn Gram [+] 36 Bảng 4.1 Bảng ghi nhận đỉnh chảy nhóm vi khuẩn Gram [+] STT Tên vi khuẩn Đỉnh chảy (oC) Bacillus cereus 91 Enterococcus faecalis 91.1 Streptococcus pyogenes 90.75 Giá trị đỉnh chảy trung bình chủng vi khuẩn đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram [+]: 90,95oC 4.1.2 Ghi nhận đỉnh chảy theo nhóm vi khuẩn Gram [-] Thực khảo sát đại diện nhóm vi khuẩn Gram [+], sử dụng chủng chuẩn: Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes Thực bước chủng vi khuẩn Gram [+], ta ghi nhận kết sau: Biểu đồ 4.3 Đường biểu diễn khuếch đại chủng vi khuẩn Gram [-] 37 1.6 1.4 1.2 dF/dT 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 ºC 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 Biểu đồ 4.4 Biểu đồ đỉnh chảy chủng vi khuẩn Gram [-] Từ biểu đồ trên, ta ghi nhận đỉnh chảy chủng vi khuẩn Gram [-] Bảng 4.2 Bảng ghi nhận đỉnh chảy nhóm vi khuẩn Gram [-] STT Tên vi khuẩn Đỉnh chảy (oC) Acinetobacter baumannii 90.25 Escherichia coli 90.35 Haemophilus influenzae 90.25 Giá trị đỉnh chảy trung bình chủng vi khuẩn đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram [-]: 90.28oC 4.1.3 So sánh giá trị đỉnh chảy nhóm vi khuẩn Gram [+] Gram [-] 38 1.6 1.4 1.2 dF/dT 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 ºC 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 Biểu đồ 4.5 Biểu đồ biểu diễn đỉnh chảy khác vi khuẩn Gram [+] Gram [-] Dựa vào thành phần nucleotide khác vùng bảo tồn đoạn gen 16S => nhóm vi khuẩn Gram [+] Gram [-] có nhiệt độ nóng chảy (T m) khác Sau chạy chu trình Melt curve, ta ghi nhận đỉnh chảy nhóm: Đỉnh chảy nhóm vi khuẩn gram [+] khoảng 91oC Đỉnh chảy nhóm vi khuẩn Gram [-] khoảng 90oC Đây kết ghi nhận dựa chủng vi khuẩn đại diện cho nhóm 4.3 Khảo sát mẫu thực Thực khảo sát 21 mẫu thực (mẫu vi khuẩn gửi kiểm chủng), chủng giữ tube có chứa dung dịch BHI + 20% Glycerol, giữ -80oC Cấy phân lập vi khuẩn môi trường thạch đĩa Cấy xong lập úp đĩa 39 ủ 35-37oC 16-18h Bắt 1-2 khuẩn lạc thực ly trích DNA, khuếch đại gen 16S DNA kỹ thuật Real-time PCR sử dụng màu chèn Evagreen Chạy chu trình phân tích đường cong chảy, ta ghi nhận kết sau: 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 dF/dT 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 ºC 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 Biểu đồ 4.6 Biểu đồ biểu diễn đỉnh chảy 21 mẫu vi khuẩn kiểm chủng Từ biểu đồ trên, ta nhận thấy phân chia đỉnh chảy thành nhóm khác Để kiểm tra lại kết này, ta thực nhuộm Gram với 21 mẫu vi khuẩn Bảng 4.3 Bảng ghi nhận đỉnh chảy kết nhuộm Gram 21 mẫu vi khuẩn STT Mã vi khuẩn Kết nhuộm Gram Đỉnh chảy (oC) 055 - 89.35 075 - 89.90 078 + 90.00 080 - 90.00 085 - 90.00 166 - 90.25 168 - 90.15 40 295 + 90.10 299 + 91.75 10 306 + 92.00 11 308 + 92.15 12 309 + 92.10 13 312 + 92.00 14 319 + 90.00 15 341 - 89.35 16 359 - 90.25 17 364 - 89.40 18 379 - 89.75 19 383 - 89.85 20 436 - 89.35 21 475 - 89.65 Dựa vào kết nhuộm Gram, ta tách biểu đồ biểu diễn đỉnh chảy 21 mẫu vi khuẩn thành nhóm Ta có mẫu vi khuẩn cho kết vi khuẩn Gram [+], 13 mẫu lại vi khuẩn Gram [-] 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 dF/dT 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 ºC 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 41 Biểu đồ 4.7 Biểu đồ biểu diễn đỉnh chảy mẫu vi khuẩn Gram [+] Đỉnh chảy mẫu vi khuẩn Gram [+], có mẫu nằm khoảng 91 oC, mẫu lại nằm khoảng 90oC => Chỉ có mẫu có kết đỉnh chảy 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 dF/dT 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 ºC 85 86 87 88 89 90 91 92 Biểu đồ 4.8 Biểu đồ biểu diễn đỉnh chảy 13 mẫu vi khuẩn Gram [-] 93 94 95 96 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đây kết bước đầu, cho thấy kỹ thuật có triển vọng kỹ thuật Real-time khác cách thực đơn giản, chi phí thấp 5.2 Kiến nghị Nếu có thời gian dài hơn, thực khảo sát vùng gen dài kết xác 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), Sinh học phân tử (khái niệm – phương pháp ứng dụng), NXB Giáo dục [2] Lê Duy Thành (2009), Cơ sở sinh học phân tử, NXB Giáo dục [3] Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng [4] Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [5] Nguyễn Lân Dũng (2010), Vi sinh vật học, NXB Giá dục Việt Nam [6] Nguyễn Thị Liên (2014), Giáo trình Vi sinh vật học đại cương, NXB Nơng nghiệp [7] Phạm Hùng Vân (2009), PCR Real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp, NXB Y học, Thành phố Hồ Chí Minh [8] Quản Lê Hà (2006), “Chương 10 Độc tính vi khuần thực phẩm bị nhiễm khuẩn” Trong Lê Ngọc Tú (chủ biên), Độc tố học an toàn thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [9] Lakna Panawala (2017), “Difference Between Gram Positive and Gram Negative Bacterial” [10] Nora M Carroll (2000), “Detection of and Discrimination between GramPositive and Gram-Negative Bacteria in Intraocular Samples by Using Nested PCR”; 38(5): 1753-1757 [11] Paulo Jose Martins Bispo (2011), “Detecction and Gram Discrimination of Bacterial Pathogens from Aqueous and Vtreous Humor Using Real-time PCR Assays”; 52(2): 873-81 [12] Richard J Reece (2004), “Analysis of Genes and Genomes” 44 [13] Sven Klaschik (2003), “Real-time PCR for Detection and Differentiation of Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria”; 40(11): 4304-4307 ... Gram, thực đề tài Thiết lập phản ứng Real time PCR phát phân biệt vi khuẩn Gram [+] Gram [-]” 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài nhằm mục tiêu thiết lập phản ứng Real time PCR để phát vả phân biệt vi. .. nhuộm Gram mà cản kháng nguyên thể thuốc kháng sinh Vì vậy, vi khuẩn Gram âm nguy hiểm vi khuẩn Gram dương Hai nhóm vi khuẩn Gram [+] Gram [-] phân biệt cách nhuộm Gram, đặt theo tên nhà vi khuẩn. .. nhuộm Gram Nhuộm Gram giúp phân vi khuẩn thành nhóm: Gram [+] 11 Gram [-], dựa vào thành phẩn cấu tạo tính chất bắt màu vách tế bào vi khuẩn Vi khuẩn Gram [+] : bắt màu tím Vi khuẩn Gram [-]: bắt