KỸ THUẬT REAL TIME PCR PHÁT HIỆN và PHÂN BIỆT e COLI còn SỐNG và đã CHẾT TRONG THỰC PHẨM

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ THUẬT REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ PHÂN BIỆT E.COLI CÒN SỐNG VÀ ĐÃ CHẾT TRONG THỰC PHẨM Người hướng dẫn: TS BS PHẠM HÙNG VÂN Người thực hiện: PHAN HỒNG VINH Lớp: 14060302 Khố: 18 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ THUẬT REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ PHÂN BIỆT E.COLI CÒN SỐNG VÀ ĐÃ CHẾT TRONG THỰC PHẨM Người hướng dẫn: TS BS PHẠM HÙNG VÂN Người thực hiện: PHAN HOÀNG VINH Lớp: 14060302 Khố: 18 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 iii LỜI CẢM ƠN Vậy thời gian làm khóa luận kết thúc với kỷ niệm cảm xúc tơi, để khóa luận tốt nghiệp hồn thành tốt hơm xin gởi lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến q thầy cơ, gia đình, bạn bè người thân xung quanh tơi tận tình hướng dẫn, giúp đỡ từ kiến thức chuyên môn đến động viên tinh thần suốt thời gian qua từ tơi nhận đề tài khóa luận tốt nghiệp hồn thành Cùng với lòng biết ơn tơi xin gởi lời cảm ơn đến Q thầy cô khoa Khoa học ứng dụng, môn Công nghệ sinh học trường Đại Học Tôn Đức Thắng người truyền lòng nhiệt huyết, lượng kiến thức chun mơn cho tơi vơ bổ ích suốt thời gian học tập trường Bên cạnh tơi xin cảm ơn ban lãnh đạo, phòng ban với anh chị QC & DV Công Ty TNHH Thương Mại & Dịch Vụ Nam Khoa đồng ý tạo điều kiện thuận lợi tốt tơi có hội thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Công Ty Lời cảm ơn sâu sắc xin gởi đến TS BS PHẠM HÙNG VÂN người bên cạnh truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm thực tiễn, dạy bảo, quan tâm giúp đỡ suốt khoảng thời gian làm khóa luận tốt nghiệp Cơng Ty Một lần xin chân thành cảm ơn Thầy chúc Thầy thật nhiều sức khỏe để tiếp tục dẫn dắt hệ Tôi xin cảm ơn Thầy! Cùng với tình cảm u thương lòng biết ơn tơi xin gởi lời cảm ơn đến cha mẹ đấng sinh thành dưỡng dục khơng ngại khó khăn cho thứ tốt đẹp ngày hôm Cảm ơn tất bạn bè người xung quanh động viên giúp đỡ suốt khoảng thời gian vừa qua LỜI CAM ĐOAN CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI CƠNG TY TNHH THƯƠNG MẠI VÀ DỊCH VỤ NAM KHOA Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học TS BS PHẠM HÙNG VÂN Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác nhau, có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngồi ra, luận văn sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Trường đại học Tơn Đức Thắng không liên quan đến vi phạm tác quyền, quyền tơi gây q trình thực (nếu có) TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 02 năm 2019 Tác giả PHAN HỒNG VINH TĨM TẮT An toàn vệ sinh thực phẩm vấn đề quan tâm ta biết thực phẩm có bị nhiễm khuẩn khơng vi khuẩn sống hay chết, đặc biệt vi khuẩn E.coli nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm người nội dung đề tài sử dụng kỹ thuật real-time PCR để phát phân biệt E.coli sống chết thực phẩm Thông qua kỹ thuật nhuộm Gram định danh IDS ta xác định vi khuẩn E.coli trực khuẩn Gram âm có khả sinh Ind thử nghiệm đặc trưng vi khuẩn E.coli Cùng với việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu (cặp mồi định danh E.coli) chất phát huỳnh quang Taqman probe kỹ thuật real-time PCR Kết cho thấy qua chủng vi khuẩn E.coli hai trạng thái sống chết ta thấy nồng độ DNA E.coli sống sau tăng sinh cao nồng độ DNA E.coli sống trước tăng sinh, nói lên sinh trưởng phát triển E.coli, trạng thái chết nồng độ DNA trước sau tăng sinh chứng tỏ khơng có sinh trưởng phát triển có diện vi khuẩn E.coli Như vậy, với kỹ thuật real-time PCR sử dụng việc phát E.coli sống hay chết thực phẩm với mẫu thực nghiệm góp phần cho cơng tác kiểm sốt thực phẩm bị nhiễm khuẩn, ngăn ngừa ngộ độc vi khuẩn E.coli gây ra, giúp phát diện E.coli chết mà phương pháp thông thường phát kết đề tài khóa luận tơi thực Sinh viên thực hiện: PHAN HỒNG VINH Giáo viên hướng dẫn: TS BS PHẠM HÙNG VÂN Đề tài “Kỹ thuật Real-Time PCR phát phân biệt E.coli sống chết mẫu thực phẩm” Thời gian thực đề tài từ tháng 11/2018 đến tháng 02/2019 Địa điểm: Công ty TNHH TM DV Nam Khoa số 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, quận 7, TP Hồ Chí Minh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii LỜI CAM ĐOAN iii TÓM TẮT .iv MỤC LỤC………… …………………………………………………………… v DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ ix DANH MỤC HÌNH .x CHƯƠNG MỞ ĐẦU……… ………………………………………………… 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Nội dung nguyên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu Escherichia coli .3 2.1.1 Phân loại khoa học: 2.1.2 Đặc điểm cấu trúc đặc tính sinh học 2.1.3 Phân loại 2.1.4 khả gây bệnh 2.1.5 chế gây bệnh 2.1.6 Con đường lây lan nguồn gốc lây nhiễm .10 2.1.7 Nguyên tắc phòng bệnh điều trị 11 2.2 Chuẩn đoán, định danh vi khuẩn E.coli 11 2.3 Những nghiên cứu khảo sát ngộ độc thực phẩm E.coli gây 15 10 2.4 Kỹ thuật real- time PCR 18 2.4.1 Kỹ thuật PCR 18 2.4.2 Ứng dụng 21 2.4.3 Real-time PCR .22 2.4.3.1 Hoá chất thuốc thử sử dụng kỹ thuật real-time PCR 23 2.4.3.2 Biểu đồ biểu diễn khuếch đại kỹ thuật real-time PCR 25 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 28 3.1.2 Địa điểm 28 3.2 Vật liệu, dụng cụ thiết bị .28 3.2.1 Mẫu 28 3.2.2 Hoá chất sinh phẩm 28 3.2.3 Thiết bị sử dụng 29 3.3 Phương pháp thực .29 3.3.1 Quy trình trình .29 3.3.2 Giải thích quy trình .30 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32 4.1 So sánh kết cấy thông thường real-time PCR việc phát diện vi khuẩn E.coli 32 4.2 So sánh kết real-time PCR 32 4.3 So sánh bàn luận kết 34 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 27 nguyên DNA đích, phản ứng cạn dần dNTP enzyme Taq polymerase không hoạt động hiệu nữa, nên khơng gia tăng số lượng DNA theo cấp số nhân Giai đoạn gọi “giai đoạn bình ngun” Sau hồn tất tất chu kỳ nhiệt việc phân tích đường biểu diễn khuếch đại (amplification curve) ống phản ứng, chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) thông số vô quan trọng kèm với đường biểu diễn khuếch đại Chu kỳ ngưỡng hay Ct chu kỳ nhiệt mà thời điểm thiết bị real-time ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang Để người làm thí nghiệm xác định cường độ huỳnh quang nền, thiết bị real-time thường ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang xuất ống phản ứng số chu kỳ đầu, gọi chu kỳ (basal cycle), lấy trung bình cộng cường độ huỳnh quang làm cường độ huỳnh quang Đường cắt ngang qua cường độ huỳnh quang gọi đường (base line) Chu kỳ ngưỡng trị số xác định số chu kỳ mà đường cắt đường biển diễn khuếch đại Do tính tốn nên chu kỳ ngưỡng thường số lẻ (ví dụ: Ct = 28.35) số chẵn 28 Biểu đồ 2.1 Biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sánh kích thích vào chu kỳ nhiệt theo sinhocphantu.ogr Có ống phản ứng có Ct sớm có ống phản ứng có Ct xuất muộn hơn, câu hỏi đặt là: lý làm vậy? Câu trả lời xác số lượng DNA đích ban đầu (starting quantity, Sq) có ống phản ứng nhiều hay Nếu ống phản ứng số lượng DNA đích nhiều cần chu kỳ nhiệt để đạt đến số lượng đủ để ống phản ứng cho tín hiệu huỳnh quang mà máy ghi nhận được, số lượng DNA đích cần nhiều chu kỳ nhiệt [3] 29 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Thời gian nghiên cứu Thời gian: Đề tài “Kỹ thuật real-time PCR để phát phân biệt E.coli sống chết mẫu thực phẩm” thực từ tháng 11/2018 đến tháng 02/2019 3.1.2 Địa điểm Địa điểm: Phòng thí nghiệm cơng ty TNHH TM DV Nam Khoa 3.2 Vật liệu, dụng cụ thiết bị 3.2.1 Mẫu Mẫu: lấy từ chủng chuẩn vi khuẩn E.coli phân lập, định danh từ mẫu bệnh phẩm bảo quản mơi trường giữ giống 3.2.2 Hố chất sinh phẩm  TE 1X- pH bao gồm 10 mM Tris mM EDTA điều chỉnh tới pH bảo quản 4oC thời gian sử dụng ngắn -20 oC tới -80 oC cho bảo quản lâu dài  BHI lỏng thành phần bao gồm Difco, Biorad hay Merck có SPS (Sigma) bảo quản oC -8 oC  Môi trường để phân lập vi khuẩn: MC (MacKonkey Agra) - Công ty Nam Khoa Thành phần phản ứng real time PCR  Mix chạy real-time PCR ( dNTPs, Taq polymerase, MgCl 2, buffer) - Công ty Nam Khoa  Primer - Công ty Nam Khoa  Taqman probe - Sigma – Mỹ 30   Mẫu DNA E.coli sau ly trích Chứng nội : Gen 16s rRNA ( có sẵn mẫu tất vi sinh vật có gen 16s rRNA) 3.2.3 Thiết bị sử dụng Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng đề tài Thiết bị Máy khuấy từ gia nhiệt Pipetman loại Máy ly tâm Máy vortex Tủ an toàn sinh học cấp Tủ ấm CO2 Máy real time PCR 3.3 Phương pháp thực Hãng sản xuất KIA- Đức Công ty Nam Khoa Hitachi – Nhật Bản Vepl – Ý Shin saeng – Hàn Quốc N- Biotek BioRad – Mỹ 3.3.1 Quy trình trình Huyền dịch 500µl huyền dịch, đun 100oC 30 phút Cấy MC Đọc kết Ủ 37OC 500µl huyền dịch Ly trích DNA Ly trích DNA Real-time PCR Cấy MC Ủ 37OC Đọc kết Ly trích DNA Ly trích DNA Real-time PCR 31 Phân tích kết Sơ đồ Quy trình Phát phân biệt E.coli sống chết kỹ thuật real-time PCR 3.3.2 Giải thích quy trình  Tạo huyền dịch - Lấy khúm khuẩn lạc E.coli chủng cho vào 1ml BHI lỏng làm tan khuẩn lạc vào BHI ta huyền dịch - Chia huyền dịch thành hai phần nhau: phần đun 100 oC 30 phút với mục đích giết chết E.coli, phần lại giữ nguyên - Lấy dịch huyền phù đem cấy vào môi trường MC với mục đích kiểm tra lại khả sống chết E.coli -Lấy 200 µl dịch huyền phù ly trích DNA trước E.coli tăng sinh - Lấy 200µl dịch huyền phù ủ 37oC sau đem ly trích DNA sau E.coli tăng sinh  Ly trích DNA phương pháp sốc nhiệt - Hút 200 µl huyền phù, ly tâm 14000 vòng/phút phút - Bỏ dịch BHI BHI ức chế phản ứng PCR rửa lại TE - Vortex nhẹ sau đun sơi 100oC 10 phút với mục đích phá màng - Sốc nhiệt -30oC 10 phút với mục đích phá màng tế bào - Ly tâm 1400 vòng/ phút phút ta thu dịch ly trích DNA tổng số  Real-time PCR 32 Phản ứng real-time PCR thực với cặp mồi đặc hiệu để phát DNA vi khuẩn E.coli kênh màu để phân biệt E.coli sống chết Real-time PCR thực theo chu trình nhiệt sau: - Chu kỳ ban đầu biến tính 95oC 15 phút có nhiệm vụ kích hoạt enzyme TaqPolymerase - Bước 40 chu kỳ gồm chu kỳ nhiệt: biến tính 94 o C 30 giây, bắt cặp kéo dài 60oC phút Bảng 3.2 Thể tích mix PCR mẫu thử nghiệm chạy real-time PCR Dịch ly trích DNA (µL) A2 B1 A1 Mix (µL) (15 µL) µL µL µL (15 µL) µL µL µL (15 µL) µL µL µL (15 µL) µL µL µL (15 µL) µL µL µL (15 µL) µL µL µL A1: Dịch ly trích DNA mẫu trước tăng sinh E.coli sống A2: Dịch ly trích DNA mẫu sau tăng sinh E.coli sống B1: Dịch ly trích DNA mẫu trước tăng sinh E.coli chết B2: Dịch ly trích DNA mẫu sau tăng sinh E.coli chết - Đọc kết B2 µL µL µL µL µL µL 33 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 So sánh kết cấy thông thường real-time PCR việc phát diện vi khuẩn E.coli Kết chủng vi khuẩn E.coli chết cấy vào môi trường MC không mọc nên ta phát diện vi khuẩn E.coli, nhiên dựa vào kết real-time PCR ta biết diện E.coli chết thông qua nồng độ DNA biểu đồ khuếch đại Bằng việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu 16s rRNA yếu tố Taqman probe làm chất phát huỳnh quang kỹ thuật real-time PCR cho ta thấy có mặt E.coli mẫu thí nghiệm thơng qua kênh màu cy5 4.2 So sánh kết real-time PCR Qua kết real-time PCR thể qua biểu đồ khuếch đại ta thấy thay đổi nồng độ DNA vi khuẩn E.coli hai trạng thái sống chết trước tăng sinh sau tăng sinh thông qua kênh màu Ct Sau tăng sinh Trước tăng sinh 34 Hình 4.1 Biểu đồ khuếch đại mẫu E.coli sống trước sau tăng sinh Trước tăng tăng sinh Sau tăng sinh Hình 4.2 Biểu đồ khuếch đại mẫu E.coli chết trước sau tăng sinh Bảng 4.1 Kết real-time PCR thể nồng độ DNA MẪU NỒNG ĐỘ VI KHUẨN ECOLI A1 A2 B1 EC 01 10 10 10 EC 02 10 10 102 EC 03 103 105 103 EC 04 104 106 104 EC 05 103 105 103 EC 06 104 106 104 A1: Mẫu vi khuẩn E.coli sống trước tăng sinh A2 : Mẫu vi khuẩn E.coli sống sau tăng sinh B1 : Mẫu vi khuẩn E.coli chết trước tăng sinh B2: Mẫu vi khuẩn E.coli chết sau tăng sinh B2 10 102 103 104 103 104 35 4.3 So sánh bàn luận kết Thực nghiệm chứng minh qua kết mẫu ta thấy nồng độ DNA vi khuẩn E.coli sống sau tăng sinh luôn cao nồng độ DNA vi khuẩn E.coli sống trước tăng sinh đồng thời ta thấy Ct E.coli sau tăng sinh nhỏ E.coli trước tăng sinh chứng tỏ nồng độ DNA sau tăng sinh cao E.coli trước tăng sinh điều nói lên E.coli sống tăng trưởng phát triển Ngược lại nồng độ DNA vi khuẩn E.coli mẫu chết nồng độ DNA trước sau tăng sinh khơng có thay đổi có khơng đáng kể đông thời Ct hai kênh màu chứng tỏ E.coli khơng khả sinh trưởng phát triển Kết mẫu thể thay đổi đạt tỷ lệ 100% 36 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đề tài góp phần xác định diện vi khuẩn E.coli chết có mẫu thực phẩm mà với phương pháp xác định E.coli truyền thống cấy phân lập khơng thể xác định khơng có khả sinh trưởng, không mọc cấy vào môi trường dinh dưỡng dẫn đến ta biết diện E.coli có mẫu Nhưng với kỹ thuật real-time PCR ta biết diện E.coli dù chết có mẫu nồng độ 5.2 Kiến nghị Cần có nghiên cứu năm vi khuẩn E.coli gen mã hóa trực khuẩn Gram âm để đề phòng trường hợp xấu chủng E.coli độc tố cao khơng thể kiểm sốt Nghiên cứu tìm cặp mồi đặc hiệu chuẩn xác cho chủng E.coli khác để phát chúng kỹ thuật real-time PCR Real-time PCR hướng đến phát biết E.coli sống chết có mẫu nhầm biết tình trạng thực tế số lượng nồng độ E.coli có mẫu kể E.coli chết mà phương pháp thông thường xác định từ hạn chế ảnh hưởng E.coli đến sức khỏe người Đề tài hướng đến phát số lượng E.coli sống chết mẫu cách nhanh cho kết chuẩn xác so với phương pháp thường qui khác 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Lê Hồng Hinh (2008), Vi sinh y học, Nhà xuất giáo dục, phần 2, trang 6688 [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đinh Quyến, Phạm Văn Ty (2010), Vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, 2010 [3] Phạm Hùng Vân (2009), PCR Real-time PCR, vấn đề ứng dụng thường gặp, Nhà xuất y học [4] Phạm Văn Doanh, Phạm Thọ Dược, Đặng Oanh, Nguyễn Thị Thu Hà, Trần Văn Tràng, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Vũ Thuận, Trần Đình Sơn, Phạm Thái Hồng, Phạm Thị Hảo (2013) Thực trạng nhiễm Escherichia coli bàn tay người chế biến thức ăn đường phố số yếu tố liên quan Thành phố Pleiku- Gia Lai [5] Trần Linh Thước (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất giáo dục [6] Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng (1997), Đại cương phương pháp kiểm tra vi sinh thực phẩm [7] Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất đại học quốc gia Hà Nội, 11, trang 105-106 Tiếng Anh [8] Cedric N Berger.Oliver Billker, Thomas F Meyer, Alain L Servin, Imad Kansau (2018), Differential recognition of members of the carcinoembryonic antigen family by Afa/Dr adhesins of diffusely adhering Escherichia coli (Afa/Dr DAEC) [9] Chantal Le Bouguénec Alain L Servin (2006), Diffusely adherent Escherichia coli strains expressing Afa/Dr adhesins (Afa/Dr DAEC): hitherto unrecognized pathogens, FEMS Microbiology Letters, Volume 256 38 [10] Christian A Heid, Junko Stevens, Kenneth J Livak and P Mickey Williams (1996), BioAnalytical Technology Department, Genentech Real Time Quantitative PCR [11] Dippold L (2005), Escherichia coli O157:H7 outbreak associated with consumption of ground beef [12] Fairbrother J.M (1982) Escherichia coli infection, Disease of swine seventh edition Wolfe Publishing Ltd Australian, pp.489 – 497 [13] FAO (2011), Preventing E.coli in food [14] Fiona P Brennan, Florence Abram, Fabio A Chinalia, Karl G Richards, and Vincent O’Flaherty (2010),” Characterization of Environmentally Persistent Escherichia coli Isolates Leached from an Irish Soil” vol 76, No7, pp.2175-2180 [15] Heloisa H Nascimento, Lucas EP Silva, Renata T Souza, Neu P Silva and Isabel CA Scaletsky (2014), “Phenotypic and genotypic characteristics associated with biofilm formation in clinical isolates of atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) strains” BMC Microbiology, pp.140-184 [16] Hrudey, S E P.Huck, P M.Gillham, R W & Hrudey, E J (2003), A fatal waterborne disease epidemic in Walkerton, Ontario: comparison with other waterborne outbreaks in the developed world Wat Sci Technol vol47, pp.7–14 [17] Jang W Yoon and Carolyn J Hovde (2008), All blood, No stool: enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 infection, Division of Molecular and Life Science, Hanyang University, Ansan 426-791 [18] Javier A, Adachi Charles D, Ericsson Zhi-Dong Jiang Margaret W, DuPontSanjay R, Pallegar Herbert, DuPont( 2002), Natural History of Enteroaggregative and Enterotoxigenic Escherichia coli Infection among US Travelers to Guadalajara, Mexico The Journal of Infectious Diseases, Volume 185 [19] JD van Elsas,AV Semenov,R Costa,JT Trevors (2011), “Survival of Escherichia coli in the environment: fundamental and public health aspects”,The ISME Journal, vol5, pp.173–183 [20] JG Lawrence,JR Roth (1996) Evolution of coenzyme B12 synthesis among enteric bacteria: evidence for loss and acquisition of a multigene complex Genetics vol 143, pp.11–24 39 [21] Kindle, “Enteropathogenic Escherichia coli“,Escherichia coli: Pathotypes and Principles of Pathogenesis,(Shahista Nisa, Karen M Scanlon, Michael S Donnenberg ), Academic Press, pp.36-54 [22] Kirsty Kemmett, Tom Humphrey, Steven Rushton, Andrew Close, Paul Wigley, Nicola J Williams (2013), A Longitudinal Study Simultaneously Exploring the Carriage of APEC Virulence Associated Genes and the Molecular Epidemiology of Faecal and Systemic E coli in Commercial Broiler Chickens [23] Leila Carvalho Campos ,Luiz Rachid Trabulsi ,Luzinete Alves Da Silva ,Valério Monteiro‐Neto ,Tania Aparecida Tardelli Gomes (2003) Diffusely Adhering Escherichia coli (DAEC) Strains of Fecal Origin Rarely Express F1845 Adhesin [24] Leo Heijnen and Gertjan Medema (2016), Quantitative detection of E.coli, E.coli O157 and other shiga toxin producing E.coli in water samples using a culture method combined with real-time PCR, Journal of water and health [25] Michael A Savageau (1983), "Escherichia coli Habitats, Cell Types, and Molecular Mechanisms of Gene Control", The American Naturalist, vol 122, no 6, pp.732-744 [26] Michael Hornsey, Jonathan W Betts, Jai W Mehat, David W Wareham, Arnoud H M van Vliet, Martin J Woodward , Roberto M La Ragione (2018), Characterization of a colistin-resistant Avian Pathogenic Escherichia coli ST69 isolate recovered from a broiler chicken in Germany [26] Michael P.WeinerGina, L.Costa, Warren Schoettlin, Janice Cline Eric Mathur John C.Bauer (1994), Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by the polymerase chain reaction [27] Nytimes, Previously unknown E coli strain affects more than 1,500 in Europe, Jun 3, 2011 [28] Pablo C, Okhuysen Herbert L, DuPont (2010), Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC): A Cause of Acute and Persistent Diarrhea of Worldwide Importance.The Journal of Infectious Diseases, Volume 202 [29] Paul Dean Brendan Kenny enteropathogenic E coli, pp.101–109 (2009), The effector repertoire of 40 [30] Paul N Goldwater and Karl A Bettelheim (2012), Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS) [31] Richard I Walker, Duncan Steele, Teresa Aguado, Ad Hoc ETEC Technical Expert Committee (2006), Analysis of strategies to successfully vaccinate infants in developing countries against enterotoxigenic E coli (ETEC) disease [32] Russell JB, Jarvis GN (2001) Practical mechanisms for interrupting the oralfecal lifecycle of Escherichia coli Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology [33] S Resta-Lenert, K E Barrett (2003) Live probiotics protect intestinal epithelial cells from the effects of infection with enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) [34] Scientificamerican: E-coli bacteria, found in some China farms and patients, cannot be killed with antibiotic drug of last resort."One of the most serious global threats to human health in the 21st century" could spread around the world, requiring "urgent coordinated global action" November 20, 2015 [35] Sioned Timothy,Khaliq Shafi, A.Howard Leatherbarrow, F.T.W.Jordan and Paul Wigley (2008), Molecular epidemiology of a reproductive tract-associated colibacillosis outbreak in a layer breeder flock associated with atypical avian pathogenic Escherichia coli [36] TA Russo, JR Johnson (2003), “Medical and economic impact of extraintestinal infections due to Escherichia coli: focus on an increasingly important endemic problem”.Microbes and Infection.Vol 5, Issue 5, pp.449-456 [37] Thomas D Schmittgen, Kenneth J Livak (2008), Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method [38] Thi Thu Hao Van, James Chin, Toni Chapman, Linh Thuoc Tran, Peter J Coloe (2008), Safety of raw meat and shellfish in Vietnam: An analysis of Escherichia coli isolations for antibiotic resistance and virulence genes 41 [39] V P Gannon, M Rashed, R K King, E J Thomas (1993), Detection and characterization of the eae gene of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli using polymerase chain reaction [40] Van, T (2007), Detection of enteric bacteria in raw food samples from Vietnam and evaluation of antibiotic resistance, Doctor of Philosophy (PhD), Applied Sciences, RMIT University [41] Veterinary Medical Research Institute of the Hungarian Academy of Sciences (1999), Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals, H-1143 Budapest, Hungdria krt 21, Hungary [42] WHO (2011): Deadly E coli is New Strain of Bacteria [43] WHO meeting, Prevention and control of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infections [44] Yolanda Saenz, Laura Brinas, Elena Domínguez,Joaquim Ruiz, Myriam Zarazaga,Jordi Vila,and Carmen Torres (2004) Mechanisms of Resistance in Multiple-Antibiotic-Resistant Escherichia coli Strains of Human, Animal, and Food Origins [45] Zachary D Blount (2015), The Natural History of Model Organisms:The unexhausted potential of E coli ... loại E. coli gây bệnh đường ruột ( IPEC) biết : EPEC (Enteropathogenic E. coli) : E. coli gây bệnh đường ruột ETEC (Enterotoxigenic E. coli) : E. coli sinh độc tố ruột EIEC ( Enteroinvasive E. coli) : E. coli. .. ruôt EAEC (Enteroaggregative E. coli) : E. coli ngưng tập ruột DAEC (Diffusely adherent E. coli) : E. coli bám dính phân tán EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) : E. coli gây xuất huyết ruột Hai loại E. coli. .. Enterotoxigenic E. coli : Enteroinvasive E. coli : Enteroaggregative E. coli : Enteropathogenic E. coli : Enterohaemorrhagic E. coli : cGMC-cyclic guanosine monophosphate : Heat labile toxin : Meningitidis-associated