KỸ THUẬT REAL TIME PCR PHÁT HIỆN và PHÂN BIỆT e COLI còn SỐNG và đã CHẾT TRONG THỰC PHẨM

An toàn vệ sinh thực phẩm là một vấn đề đang được quan tâm hiện naynhưng làm sao ta có thể biết được thực phẩm đó có bị nhiễm khuẩn không và vikhuẩn đó còn sống hay đã chết, đặc biệt là

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ THUẬT REAL-TIME PCR PHÁT

HIỆN VÀ PHÂN BIỆT E.COLI CÒN

SỐNG VÀ ĐÃ CHẾT TRONG THỰC

PHẨM

Người hướng dẫn: TS BS PHẠM HÙNG VÂN

Người thực hiện: PHAN HOÀNG VINH

Lớp: 14060302

Khoá: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ THUẬT REAL-TIME PCR PHÁT

HIỆN VÀ PHÂN BIỆT E.COLI CÒN

SỐNG VÀ ĐÃ CHẾT TRONG THỰC

PHẨM

Người hướng dẫn: TS BS PHẠM HÙNG VÂN

Người thực hiện: PHAN HOÀNG VINH

Lớp: 14060302

Khoá: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

LỜI CẢM ƠN

Vậy là thời gian làm khóa luận cũng đã kết thúc với bao nhiêu là kỷ niệm vàcảm xúc trong tôi, để khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tốt như hôm nay tôixin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất đến quý thầy cô, gia đình, bạn bè vànhững người thân xung quanh tôi đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi từ kiến thứcchuyên môn đến động viên tinh thần trong suốt thời gian qua từ khi tôi nhận đề tàikhóa luận tốt nghiệp cho đến khi hoàn thành

Cùng với lòng biết ơn đó tôi xin gởi lời cảm ơn đến Quý thầy cô khoa Khoahọc ứng dụng, bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại Học Tôn Đức Thắng nhữngngười đã truyền lòng nhiệt huyết, năng lượng và những kiến thức chuyên môn chotôi vô cùng bổ ích trong suốt thời gian tôi học tập tại trường

Bên cạnh đó tôi cũng xin được cảm ơn ban lãnh đạo, các phòng ban cùng vớicác anh chị QC & DV tại Công Ty TNHH Thương Mại & Dịch Vụ Nam Khoa đãđồng ý và tạo mọi điều kiện thuận lợi và tốt nhất để cho tôi có cơ hội được thựchiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại Công Ty

Lời cảm ơn sâu sắc này tôi xin gởi đến TS BS PHẠM HÙNG VÂN người

đã ở bên cạnh tôi truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm thực tiễn, luôn dạy bảo,quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt khoảng thời gian tôi làm khóa luận tốt nghiệp tạiCông Ty Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn Thầy chúc Thầy thật nhiều sứckhỏe để tiếp tục dẫn dắt các thế hệ tiếp theo Tôi xin cảm ơn Thầy!

Cùng với tình cảm yêu thương và lòng biết ơn tôi xin gởi lời cảm ơn này đếncha mẹ đấng đã sinh thành dưỡng dục không ngại khó khăn đã cho tôi mọi thứ tốtđẹp như ngày hôm nay Cảm ơn tất cả bạn bè và mọi người xung quanh đã độngviên giúp đỡ tôi trong suốt khoảng thời gian vừa qua

LỜI CAM ĐOAN

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI VÀ DỊCH VỤ NAM KHOA

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sựhướng dẫn khoa học của TS BS PHẠM HÙNG VÂN Các nội dung nghiên cứu,kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nàotrước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét,đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau, có ghi rõ trong phầntài liệu tham khảo

Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như sốliệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồngốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình Trường đại học Tôn Đức Thắng không

liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trìnhthực hiện (nếu có)

TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 02 năm 2019

Tác giả

PHAN HOÀNG VINH

TÓM TẮT

An toàn vệ sinh thực phẩm là một vấn đề đang được quan tâm hiện naynhưng làm sao ta có thể biết được thực phẩm đó có bị nhiễm khuẩn không và vi

khuẩn đó còn sống hay đã chết, đặc biệt là vi khuẩn E.coli nguyên nhân hàng đầu

gây ra ngộ độc thực phẩm ở người vì vậy nội dung của đề tài này là tôi sẽ sử dụng

kỹ thuật real-time PCR để phát hiện và phân biệt E.coli còn sống và đã chết trong

thực phẩm

Thông qua kỹ thuật nhuộm Gram và định danh bằng IDS ta xác định được vi

khuẩn E.coli là trực khuẩn Gram âm có khả năng sinh Ind thử nghiệm đặc trưng của

E.coli còn sống trước tăng sinh, nói lên sự sinh trưởng và phát triển của E.coli, còn

ở trạng thái chết thì nồng độ DNA trước và sau khi tăng sinh là bằng nhau chứng tỏ

không có sự sinh trưởng và phát triển nhưng vẫn có sự hiện diện vi khuẩn E.coli.

Như vậy, với kỹ thuật real-time PCR được sử dụng trong việc phát hiện

E.coli còn sống hay đã chết trong thực phẩm với 6 mẫu thực nghiệm góp phần cho

công tác kiểm soát thực phẩm bị nhiễm khuẩn, ngăn ngừa ngộ độc do vi khuẩn

E.coli gây ra, giúp phát hiện sự hiện diện của E.coli đã chết mà phương pháp thông

thường không thể phát hiện được đó chính là kết quả của đề tài khóa luận tôi đãthực hiện

Sinh viên thực hiện: PHAN HOÀNG VINH

Giáo viên hướng dẫn: TS BS PHẠM HÙNG VÂN

Đề tài “Kỹ thuật Real-Time PCR phát hiện và phân biệt E.coli còn sống và đã

chết trong mẫu thực phẩm”

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 11/2018 đến tháng 02/2019

Địa điểm: Công ty TNHH TM và DV Nam Khoa số 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, quận 7, TP Hồ Chí Minh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC………… ……… v

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ ix

DANH MỤC HÌNH x

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU……… ……… 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Nội dung nguyên cứu 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu về Escherichia coli 3

2.1.1 Phân loại khoa học: 3

2.1.2 Đặc điểm cấu trúc và đặc tính sinh học 4

2.1.3 Phân loại 5

2.1.4 khả năng gây bệnh 7

2.1.5 cơ chế gây bệnh 7

2.1.6 Con đường lây lan và nguồn gốc lây nhiễm 10

2.1.7 Nguyên tắc phòng bệnh và điều trị 11

2.2 Chuẩn đoán, định danh vi khuẩn E.coli 11

2.3 Những nghiên cứu và khảo sát về ngộ độc thực phẩm do E.coli gây ra .15

2.4 Kỹ thuật real- time PCR 18

2.4.1 Kỹ thuật PCR 18

2.4.2 Ứng dụng 21

2.4.3 Real-time PCR 22

2.4.3.1 Hoá chất và thuốc thử được sử dụng trong kỹ thuật real-time PCR 23

2.4.3.2 Biểu đồ biểu diễn khuếch đại của kỹ thuật real-time PCR 25

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 28

3.1.2 Địa điểm 28

3.2 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị 28

3.2.1 Mẫu 28

3.2.2 Hoá chất sinh phẩm 28

3.2.3 Thiết bị được sử dụng 29

3.3 Phương pháp thực hiện 29

3.3.1 Quy trình trình hiện 29

3.3.2 Giải thích quy trình 30

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32

4.1 So sánh kết quả cấy thông thường và real-time PCR trong việc phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn E.coli 32

4.2 So sánh kết quả real-time PCR 32

4.3 So sánh và bàn luận kết quả 34

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Kiến nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AAF : Aggregative adhesion firm briae

: Diffusely adherent E.coli

ETEC : Enterotoxigenic E.coli

EIEC : Enteroinvasive E.coli

EAEC : Enteroaggregative E.coli

EPEC : Enteropathogenic E.coli

EHEC : Enterohaemorrhagic E.coli

GMP : cGMC-cyclic guanosine monophosphate

LT : Heat labile toxin

MAEC : Meningitidis-associated E.coli

PCR : Polymerase Chain Reaction

SS : Salmonella shigella agar

ST : Heat Stable Toxin

Stx : Shiga toxin

UPEC : Uropathogenic E.coli

HUS : Haemolytic uraemic syndrome

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng phân tích số vụ và nguyên nhân ngộ độc thực phẩm năm 200 16 Bảng 3.1 Các thiết bị được sử dụng trong đề tài 29 Bảng 3.2 Thể tích giữa mix và mẫu thử nghiệm khi chạy real-time PCR…….31 Bảng 4.1 Kết quả real-time PCR thể hiện nồng độ DNA ……….39

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU Đ

Sơ đồ 1 Quy trình định danh vi khuẩn E.coli 12

Sơ đồ 2 Quy trình Phát hiện và phân biệt E.coli còn sống và đã chết bằng kỹ thuật real-time PCR………29

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Escherichia coli (E.coli ) 3

Hình 2.2 Khuẩn lạc E.coli trên môi trường MC 14

Hình 2.3 Kết quả nhuộm Gram của vi khuẩn E.coli 14

Hình 2.4 Kết quả thử nghiệm sinh hóa bằng IDS 15

Hình 2.5 Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe trong real-time PCR 25 Hình 4.1 Biểu đồ khuếch đại mẫu E.coli sống trước và sau tăng sinh 32

Hình 4.2 Biểu đồ khuếch đại mẫu E.coli chết trước và sau tăng sinh 33

do sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ động vật đã bị nhiễm khuẩn Có nhiều vikhuẩn gây ra ngộ độc thực phẩm nhưng trong đó vi khuẩn thường gặp nhất và chủ

yếu nhất chính là vi khuẩn E.coli, tình trạng ngộ độc thực phẩm đang có xu hướng

ngày tăng cao và ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

Vì thế việc phát hiện ra vi khuẩn E.coli có trong thực phẩm là việc vô cùng quan trọng và quan trọng hơn là có thể biết được E.coli đó còn sống hay đã chết để biết được sự hiện diện của E.coli trong thực phẩm, từ đó đánh giá được chất lượng

của thực phẩm hạn chế tối đa vấn đề ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏecộng đồng vì nó gây ra bệnh tiêu chảy ở trẻ em, viêm màng não, rối loạn tiêu hóa,

khi bị nhiễm E.coli nặng có thể dẫn đến ngộ độc cấp tính, mất nước có thể dẫn đến

tử vong nếu không có sự điều trị kịp thời Vi khuẩn E.coli có mặt ở khắp mọi nơi

trên trái đất, vòng đời của nó khá lâu và sinh sản cực nhanh đồng thời khả năng lâylan bệnh rất cao tuy nhiên chúng có kích thước rất nhỏ nên chúng ta không thể quansát và biết được sự hiện diện của chúng trong thực phẩm, vì thế ta phải sử dụng kỹ

thuật real-time PCR để phát hiện và phân biệt E.coli còn sống và đã chết trong thực

phẩm một cách nhanh chóng, hiệu quả và chính xác ngoài ra kỹ thuật real-time PCRcòn giúp tránh được hiện tượng dương tính giả do DNA tế bào chết gây ra dẫn đếnsai kết quả thí nghiệm Từ đó ta có thể kiểm soát được thực phẩm an toàn làm giảmnguy cơ lây lan bệnh qua con đường thực phẩm, ta sẽ có được những thực phẩm antoàn bảo vệ sức khỏe cho con người và vật nuôi

1.2 Nội dung nguyên cứu

 Nuôi cấy, phân lập và tăng sinh vi khuẩn E.coli

 Thiết lập kỹ thuật real-time PCR để phát hiện E.coli còn sống và đã chết

 Chạy real-time PCR thu nhận kết quả

 Phân tích, so sánh và biện luận kết quả real-time PCR

Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm các dữ liệu, cơ sở khoa học và cách nhận

diện cho quá trình phát hiện E.coli còn sống và đã chết một cách nhanh nhất về sự hiện diện của E.coli trong thực phẩm, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về

E.coli trong các mẫu thực phẩm.

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về Escherichia coli

2.1.1 Phân loại khoa học:

Giới (regnum): Bacteria

Ngành (phylum): Proteobacteria

Lớp (class): Gammaproteobacteria

Bộ (ordo): Enterobacteriales

Họ (familia): Enterobacteriaceae

Chi (genus): Escherichia

Loài (species): E.coli

Danh pháp hai phần: Escherichia coli

 Lịch sử phát hiện Escherichia coli.

Escherichia coli hay còn được gọi là E.coli được Theodor Escherich nhà vi

khuẩn học người Áo phát hiện đầu tiên vào năm 1885 trong quá trình điều trị vànghiên cứu về bệnh tiêu chảy, chúng được tìm thấy ở tã lót của trẻ em Vi khuẩn

E.coli được chọn làm đại diện điển hình cho họ vi khuẩn đường ruột bởi vì nó sống

ký sinh trong ruột già vì thế nó được đặt tên là Bacterium coli.

Sau khi ông Theodor Escherich qua đời năm 1911 thì loài vi khuẩn này đãđược các nhà khoa học đổi tên rất nhiều lần nhưng đến năm 1919 thì được thống

nhất trên toàn thế giới với tên gọi là Escherichia coli ( viết tắt là E.coli) để vinh

danh và tưởng nhớ đến ông người đầu tiên đã tìm ra được loài này [45]

Những nghiên cứu về vi khuẩn E.coli đã có nhiều thành tựu và ứng dụng nổi bật, vi khuẩn E.coli có thể tạo ra một bộ môn học vô cùng quan trọng trong lĩnh vực

vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung bao gồm nhiều kiến thức liên quan đến

vi sinh từ hình thái, sinh lý đến thành phần sinh hóa, sinh học phân tử, di truyền học

ở loài vi khuẩn này

E.coli thường được sử dụng làm mô hình rất quan trọng trong các thí

nghiệm bởi vì tốc độ sinh sản của chúng rất nhanh kỹ thuật nuôi cấy đơn giản, đặc

Hình 2.1: Escherichia coli (E.coli ) Theo www.fao.org/Preventing-E.Coli-in Food

biệt là chủng vi khuẩn E.coli K12 được sử dụng rất nhiều, khi E.coli được thải qua

phân ra bên ngoài thì nó có khả năng sinh trưởng và tạo nên quần thể tự do ở môitrường bên ngoài

Mặc dù chúng ký sinh trong ruột động vật nhưng hầu hết các chủng E.coli

đều vô hại nó giúp cho quá trình tiêu hóa được thuận lợi hơn tuy nhiên vẫn có một

số chủng có độc tính có thể gây ngộ độc thực phẩm và các bệnh đường ruột đặc

trưng là chủng E.coli O157:H7 khi chúng được thải ra bên ngoài từ phân và được quay trở lại vào cơ thể con người Tỷ lệ E.coli trong đường ruột rất cao nên nó được

sử dụng để đánh giá chỉ tiêu an toàn thực phẩm và nguồn nước [11],[32] Ngoài ra

vi khuẩn E.coli còn có khả năng cộng sinh với vật chủ để sản sinh ra vitamin K và

vitamin B12 là hai loại vitamin rất cần thiết cho cơ thể con người và động vật [20]

Mặc dù E.coli đã được nghiên cứu kỹ càng nhất và nhiều nhất nhưng cho đến nay

nó vẫn được các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu và quan tâm sâu sắc nhất vì hầu

như các loại bệnh điều có liên quan đến vi khuẩn E.coli.

2.1.2 Đặc điểm cấu trúc và đặc tính sinh học

Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm có hai đầu tròn, hình que, có kíchthước trung bình từ 0.5 x (2-3)µm, có thể đứng riêng lẻ hoặc có khi xếp chungthành một chuỗi dài Trong môi trường có kháng sinh, môi trường không thuận lợithì hình dáng của vi khuẩn như sợi chỉ, chúng sống kí sinh trong ruột già, đường

tiêu hóa của người và các động vật máu nóng Rất hiếm khi chủng E.coli có vỏ

nhưng hầu hết chúng đều có lông và có khả năng di động bằng tiên mao, chúngkhông tạo bào tử, có thêm vỏ vi khuẩn nếu chủng đó có độc lực [45],[25]

 Tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn E.coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý chúng rất dễ dàng

phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường kể cả là môi trường tổng hợp

rất nghèo chất dinh dưỡng Nhiệt độ mà vi khuẩn E.coli có thể phát triển là từ 5 oCđến 40oC nhưng nhiệt độ tốt nhất là khoảng 37 oC, độ pH tốt nhất là từ 6.4 đến 7.4

Trong điều kiện thích hợp vi khuẩn E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế

hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút Khi cấy vào môi trường lỏng (như môi trường canh

môi trường canh thang Selenit [2],[6].

Trên môi trường thạch thông thường cơ bản thì sau khoảng 8 đến 10 giờ thì

ta có thể quan sát được khuẩn lạc E.coli qua kính lúp Sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm Hình thái khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn E.coli là hình chữ

S nhưng cũng có thể gặp dạng hình R (xù xì) hoặc M (nhầy) có màu trắng đục vàướt Trên các môi trường phân lập khác nhau, các chất chỉ thị màu khác nhau khuẩn

lạc sẽ có màu khác nhau ví dụ như trên môi trường thạch lactose E.coli sẽ có khuẩn

lạc màu vàng, hoặc có thể là màu hồng nếu khuẩn lạc mọc trên môi trườngMacConKey, các đặc điểm hình thái này có thể bị biến đổi khác nhau qua nhiều lần

cấy truyền liên tục Nhưng E.coli không mọc được trên môi trường SS.

Một số chủng E.coli sẽ có tính chất nuôi cấy riêng biệt phù hợp cho từng chủng nó được ứng dụng trong việc sàn lọc nhanh các chủng E.coli ví dụ như vi khuẩn E.coli EAEC tạo thành váng đặc khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton

[5]

 Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn E.coli có thể lên men được nhiều loại đường, hầu hết các vi khuẩn

E.coli đều lên men lactose sinh acid hỗn hợp, sinh Indonl và sinh hơi trừ EIEC, có

khả năng khử nitrate thành nitrite, có enzyme lysindecacboxydase, không phân giảiđược Ure, không sinh H2S, không thủy phân gelatin, không sử dụng citrate Để phân

biệt được vi khuẩn E.coli và một số vi khuẩn đường ruột khác người ta thường sử dụng thử nghiệm IMViC và kết quả của thử nghiệm nếu là E.coli sẽ là (+)(+)(-)(-)

hay (-) (+) (-)(-) [1],[7]

2.1.3 Phân loại

Dựa vào cấu trúc kháng nguyên mà vi khuẩn E.coli được chia thành các type huyết thanh khác nhau Với sự kết hợp của các kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh khách nhau và được ký hiệu là O và K

Kháng nguyên O (Somatic antigen): Nó là kháng nguyên của vách tế bào

được cấu tạo bởi lipopolysaccharide, đối với vi khuẩn E.coli người ta đã xác định

được gần 160 yếu tố kháng nguyên O Đặc tính của kháng nguyên O này là có khả năng chịu được nhiệt độ cao, nó không bị phân hủy khi thủy phân ở 100oC trong 2 giờ và có khả năng kháng cồn vì nó không bị hủy khi tiếp xúc cồn 50% nhưng lại bịhủy bởi formon 5%, chúng rất là độc vì chỉ cần một lượng ít khoảng 0.05mg là có thể đủ để giết chết chuột nhắt trong 24 giờ

Khi kháng nguyên O khi gặp huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứngngưng kết kháng nguyên O Kháng nguyên O giữ vai trò quyết định đối với khảnăng gây bệnh và có tính chất chuyên biệt cho từng loại vật chủ kí sinh [15]

Kháng nguyên giáp mô K (Capsular antigen): Kháng nguyên K được cauastạo bởi polysaccharide hay là protein nó đã được xác định có khoảng 100 yếu tốnằm ngoài kháng nguyên O và được chia làm ba loại khác nhau là: loại A, loại B vàloại L Trong đó loại A tồn tại dưới dạng vỏ ta có thể quan sát được dưới kính hiển

vi quang học thông thường, còn loại B và loại L tồn tại dưới dạng màng rất mỏngnên ta chỉ có thể quan sát được bằng kính hiển vi điện tử Nếu kháng nguyên K chephủ hoàn toàn thân của vi khuẩn thì nó sẽ ngăn cản phản ứng ngưng kết kháng

nguyên O Ngoài ra kháng nguyên K còn giúp cho vi khuẩn E.coli bám vào tế bào

biểu mô trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu của vật chủ

Kháng nguyên lông H (Flagellar antigen): Nó được cấu tạo bởi protein và đã

có hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định Đặc tính của kháng nguyên Hnày là không chịu được nhiệt độ cao, nó sẽ bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50% và cácenzyme proteinase nhưng chúng không bị hủy bởi formol 5% Khi kháng nguyên Hgặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết

Kháng nguyên tiên mao F (Fimbrial antigen): Nó có dạng hình sợi và dàikhoảng 4µm giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột của vật chủ vì thế kháng

nguyên F rất quan trọng trong việc gây ra bệnh của vi khuẩn E.coli [12],[44].

Dựa vào vị trí gây bệnh, đặc điểm gây bệnh, yếu tố độc lực và các gen độc

lực khác nhau mà các chủng E.coli gây bệnh ở người được chia thành hai nhóm

chính: Nhóm thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột ( IPEC- intestinal pathogenic

E.coli) hay E.coli gây tiêu chảy ( DEC-Dierrheagenic E.coli) Nhóm thứ hai là

nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC- extraintestinal pathogenic E.coli) [14].

 Các loại E.coli gây bệnh đường ruột ( IPEC) được biết hiện nay là :

 EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột.

 ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột.

 EIEC ( Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruôt.

 EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột.

 DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán.

 EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột.

 Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột được biết đến hiện nay và quan

trọng nhất là:

 MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não.

 UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu [1],

[21],[29]

2.1.4 khả năng gây bệnh

Mặc dù vi khuẩn E.coli chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 80%) trong số vi khuẩn

hiếu khí trong đường ruột nhưng hầu như chúng vô hại đối với đường tiêu hóa tuynhiên cũng có một số chủng ra gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêmđường mật, nặng hơn có thể gây viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh ngoài racòn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa [36] Theo báo cáo của chương trình quốc giagiám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thường gặp từ năm 1988 đến

1994 thì vi khuẩn E.coli đứng thứ 2 về tỷ lệ phân lập được ở nước ta chỉ sau vi

khuẩn Staphylococcus aureus

2.1.5 cơ chế gây bệnh.

Tùy vào các chủng E.coli khác nhau mà sẽ có các cơ chế gây bệnh khác nhau

 Chủng vi khuẩn ETEC-E.coli : E.coli sinh độc tố ruột.

Là tác nhân gây ra bệnh tiêu chảy giống như vi khuẩn tả, chỉ cần một hoặc haiđộc tố ruột là vi khuẩn ETEC có thể gây bệnh cho vật chủ, hai yếu tố độc lực gâybệnh của ETEC là: khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và sản xuất độc tố, nhưngyếu tố quyết định đến khả năng gây tiêu chảy là do độc tố ruột

Có 2 loại độc tố ruột được sản sinh đó là: Độc tố chịu được nhiệt ST (heatStable Toxin) là nội độc tố và độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile toxin ), LT là

ngoại độc tố gồm hai loại LT I và LT II Một chủng vi khuẩn ETEC-E.coli có thể

sinh ra một trong hai hoặc cả hai độc tố trên Việc chuẩn đoán chủng vi khuẩn nàybằng cách xác định sự có mặt của độc tố ruột chịu được nhiệt ST [31],[41]

 EIEC- E.coli xâm nhập ruột

EIEC gây bệnh chủ yếu là do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng gây viêmloét và hoại tử niêm mạc đại tràng Nó gây ra bệnh bằng cách sinh ra nội độc tố Shigella Có thể xác định chủng vi khuẩn này bằng các thử nghiệm xâm nhập được thực hiện bằng cách nhỏ 1 giọt chất nuôi cấy vào mắt chuột lang [33]

 EAEC-E.coli bám dính kết tập ruột

EAEC thường gây tiêu chảy kéo dài hoặc mạn tính ở trẻ nhỏ, nó cũng là nguyên nhân chủ yếu gây ra nhiễm khuẩn đường tiêu hóa ở khách du lịch Hiện nay cơ chế gây bệnh của nó vẫn chưa được các nhà khoa học làm sáng tỏa hoàn toàn nhưng yếu

tố độc lực chính gây ra bệnh đó là các điểm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion firm briae) yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR Độc tố EAST-1

(enteroaggretive heat-stable toxin-1) này có khả năng phá hủy các tế bào biểu mô, điểm bám dính kết tập AAF được xem là yếu tố quyết định độc lực của chủng vi khuẩn EAEC này Khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton, EAEC sẽ tạo thành một váng đặc trưng trên bề mặt môi trường và tính chất này cũng thường được sử dụng để sàn lọc nhanh các chủng E.coli [28],[40]

 EHEC- E.coli: E.coli gây xuất huyết ruột

Chúng còn được gọi là E.coli sinh độc tố Shiga, đặc chưng của chủng này là vi khuẩn E.coli O157:H7 là nguyên nhân chủ yếu gây ra bệnh lây truyền qua con đường thực phẩm dẫn đến tỷ lệ nhiễm EHEC và tỷ lệ tử vong tăng cao hằng năm Độc tố chính của EHEC là Stx ( Shiga toxin) hay độc tố gây độc lên tế bào Vero VT(Verocytotocyn) nó làm hủy hoại các vi nhung mao và hấp thu các tế bào biểu mô ruột gây nên sự ức chế quá trình tổng hợp nên protein của tế bào biểu mô đại tràng dẫn đến làm chết tế bào gây nên hội chứng HUS (haemolytic uraemic syndrome - hội chứng tan máu) [40],[43]

 DAEC-E.coli bám dính phân tán

DAEC là chủng E.coli gây bệnh được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến trongthời gian gần đây Nó được xác định là một chủng gây bệnh riêng biệt so với các chủng vi khuẩn khác vì nó không có gen độc lực đặc trưng như các chủng khác.DAEC nó là loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC) hay còn được gọi là vi khuẩn gây bệnh cơ hội khi “lạc chỗ” vì chúng có thể là thành viên của hệ vi khuẩn

vô hại bình thường trong đường ruột nhưng khi chúng đi lạc vào máu, dịch tủy não

và đi vào đường tiết niệu thì chúng sẽ gây ra bệnh đặc biệt là những người có đề kháng bị suy giảm [17],[23]

 MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não

Chúng có kháng nguyên vỏ miễn dịch với polysaccharide nhóm B của vi khuẩn Neisseria meningitides Cho đến nay những thông tin về các căn bệnh do vi khuẩn

này gây nên ở trẻ em vẫn chưa được làm rỏ một cách chính xác nhất Theo kết quả nghiên cứu cho thấy tới 80% các trường hợp viêm màng não ở trẻ sơ sinh là do chủng MAEC gây nên

 UPEC E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu

Chúng là nguyên nhân hàng đầu của việc nhiễm trùng đường tiết niệu, yếu tố độc lực quan trọng quyết định đến khả năng gây bệnh của UPEC là P-pili Nhờ Pili này

mà vi khuẩn UPEC E.coli có thể gắn đặc hiệu vào kháng nguyên P là một trong những kháng nguyên nhóm máu Những vi khuẩn này có chứa các gen mã hóa cho các yếu tố độc lực như: yếu tố bám dính, vỏ và các độc tố AFA/Dr gây bám dính phân tán EAST-1 phá hủy tế bào biểu mô [8],[9]

2.1.6 Con đường lây lan và nguồn gốc lây nhiễm

Sự lây nhiễm vi khuẩn E.coli chủ yếu là qua phân tươi của động vật khi được thải ra môi trường bên ngoài, người ta cũng còn phát hiện ra vi khuẩn E.coli có

trong thực phẩm như sữa chưa được tuyệt trùng, thịt, rau củ quả tươi sống từng

được bón phân chưa qua xử lý, ngoài ra thực phẩm bị nhiễm E.coli trong quá trình

tăng trưởng, thu hoạch, sau thu hoạch vận chuyển mất vệ sinh Đồng thời các yếu tốnhư nhiệt độ, pH, nguồn nước không đạt tiêu chuẩn cũng tạo điều kiện cho vi khuẩn

E.coli chỉ có ở trên bề mặt nên ta có thể dễ dàng tiêu diệt được vi sinh vật.

Vi khuẩn E.coli cũng có thể lây truyền trực tiếp từ người này sang người

khác qua các trung tâm chăm sóc sức khỏe, bệnh viện, viện dưỡng lão hoặc bất cứnơi nào người tiếp xúc với phân của người đã bị nhiễm bệnh đây cũng là nguyên

nhân dẫn đến vi khuẩn E.coli dễ lây nhiễm qua con đường tay chân miệng và đặc

biệt là ở trẻ em

Không giống với các loại vi khuẩn gây bệnh khác số lượng vi khuẩn phải có

hàng ngàn đến chục ngàn tế bào mới có thể gây bệnh nhưng E.coli chỉ cần ít hơn

200 tế bào đã có thể gây bệnh Nguyên nhân lớn nhất dẫn đến nhiễm khuẩn là donguồn gốc thức ăn bị nhiễm bẩn, thức ăn chưa được nấu chin và uống nước bẩn vàkhông được xử lý

 Các cách để ngăn ngừa E.coli cho việc ăn uống bao gồm:

 Tránh tiếp xúc vi khuẩn có hại trong nhà bếp bằng cách thịt sống tách biệtvới các thực phẩm khác

 Rửa tay và các dụng cụ nhà bếp bằng nước ấm, xà phòng sau khi sửu dụngđặc biệt là tiếp xúc với thịt sống

 Không để thịt nấu chín và thịt sống trên cùng một đĩa

 Uống các loại sữa đã được tuyệt trùng, nước được xử lý

 Rửa trái cây và rau thật kỹ trước khi dùng

Ngoài ra để hạn chế ngộ độc thực phẩm từ vi khuẩn E.coli ta phải có các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát chặt chẽ nguồn gốc xuất phát của thực phẩm từ độngvật đến thực vật trước khi được buôn bán ra bên ngoài Vì thế các cục cơ quan quản

lý an toàn thực phẩm phải thường xuyên kiểm tra, thử ngiệm và xử lý các loại thực phẩm tại nơi sản xuất như vườn sản xuất rau quả, công ty chế biến bảo quản sữa, lò giết mổ động vật để hạn chế tối đã sản phẩm bị ô nhiễm được bán ra thị trường tiêu thụ

2.1.7 Nguyên tắc phòng bệnh và điều trị

Hiện nay vẫn chưa có nguyên tắc hay phương pháp nào cụ thể để phòng bệnhđặc hiệu vì thế muốn phòng nhiễm khuẩn đường tiêu hóa do E.coli gây ra ta phải sửdụng các biện pháp không đặc hiệu như phòng các vi khuẩn đường tiêu hóa

E.coli thuộc dạng vi khuẩn kháng thuốc cao, vì vậy cần làm kháng sinh đồ để

chọn kháng sinh thích hợp Ngoài việc sử dụng kháng sinh một số việc khác cũngrất quan trọng trong việc điều trị như bổ sung nước, điện giải trong trường hợp tiêuchảy, giải quyết các cản trở trên đường tiết niệu , rút ống thông sớm nếu có thể

2.2 Chuẩn đoán, định danh vi khuẩn E.coli

Quy trình chuẩn đoán trực tiếp vi khuẩn E.coli cũng giống như quy trình

chuẩn đoán các vi khuẩn đường ruột khác Có nhiều phương pháp chuẩn đoán trựctiếp nhưng phương pháp chuẩn đoán chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập Tuy nhiênvẫn có thể làm tiêu bản soi trực tiếp đối với một số loài bệnh phẩm đặc trưng Ngoài

ra kỹ thuật real-time PCR cũng được sử dụng để chuẩn đoán vi khuẩn E.coli

 Quy trình định danh vi khuẩn E.coli bằng bộ IDS 14 GNR

Quy trình định danh vi khuẩn E.coli

Sơ đồ 1 Quy trình định danh vi khuẩn E.coli

Giải thích quy trình

 Xử lý mẫu : Mẫu thực phẩm ở dạng rắn sẽ được nghiền nát

- lấy 25g mẫu cho vào 250ml môi trường BHB tăng sinh

- Cấy vào môi trường MC broth để chọn lọc vi khuẩn E.coli

MẫuMẫu

Xử lý mẫu

Xử lý mẫuCấy phân lậpCấy phân lậpNhuộm GramNhuộm GramĐịnh danh bằng IDS Định danh bằng IDS

 Cấy phân lập

Mẫu thực phẩm được thực hiện cấy 3 chiều theo quy trình sau:

- Lấy khúm khuẩn E.coli từ mẫu đã được phân lập Sử dụng que cấy vô trùng

cấy mẫu vào môi trường MC, đường cấy thứ hai vuống gốc bằng 1/3 lầnđường cấy thứ nhất và đường cấy thứ 3 vuống gốc bằng 1/3 lần đường cấythứ 2 tạo ra các khuẩn lạc rời và riêng lẻ

- Bao gói và ủ ở 37oC trong 12 đến 24 giờ

 Nhuộm Gram

Cách nhuộm:

 Dàn tiêu bản bằng nước muối sinh lý, để khô tự nhiên

 Nhỏ vài giọt thuốc Crystal violet lên tiêu bản, giữ yên 1 phút, rửa nước

 Nhỏ dung dịch lugol lên tiêu bản, để 1 phút, rửa nước

 Tẩy màu bằng cồn 900 tới khi bạc màu

 Rửa qua nước

 Nhỏ thuốc nhuộm Sarafine lên tiêu bản, để 1 phút, rửa nước

 Thấm giấy lọc hoặc để khô ở không khí

 Đọc kết quả: Gram (+) nếu vi khuẩn bắt màu xanh tím, Gram (-) nếu vi

khuẩn bắt màu hồng Nghi ngờ là vi khuẩn E.coli khi thấy hình ảnh trực

khuẩn Gram (-) có màu hồng, hình que

 Định danh bằng IDS 14 GNR

Bộ IDS 14 GNR là một hệ thống gồm 14 thử nghiệm sinh hóa dùng để địnhdanh trực khuẩn Gram (-) , dễ mọc, thuần khiết (không tạp nhiễm) và không quá

24 giờ ta thực hiện như sau:

 Lấy một khúm khuẩn làm tan đều trong dung dịch nước muối để tạohuyền dịch

 Lấy một ít huyền dịch cho vào đĩa giấy Oxidase

 Dùng pipet hút 50µl cho vào 10 giếng thử nghiệm sinh hóa

 Dùng que cấy vô trùng lấy một khúm khuẩn tạo một đường cấy thằngđứng trong 2 lọ môi trường LDC và MOB