NGHIÊN cứu ẢNH HƯỞNG của các CHẤT điều hòa SINH TRƯỞNG và hợp CHẤT hữu cơ đến QUÁ TRÌNH NUÔI cấy IN VITRO LAN GIẢ hạc hòn hèo dendrobium anosmum lindl

DANH MỤC BẢNGBảng 3.1: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ lớp mỏng giả hành lan Giả hạc Hòn Hèo Dendrobium anosmum Lindl....20 Bảng 3.2: Các nghi

Trang 1

-o0o -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ HỢP CHẤT HỮU CƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY

IN VITRO LAN GIẢ HẠC HÒN HÈO

Dendrobium anosmum Lindl

Người hướng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN CÔNG TOẢN

Lớp: 14060302

Khóa: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

Trang 2

-o0o -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ HỢP CHẤT HỮU CƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY

IN VITRO LAN GIẢ HẠC HÒN HÈO

Dendrobium anosmum Lindl

Người hướng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN CÔNG TOẢN

Lớp: 14060302

Khóa: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

Trang 3

Bên cạnh đó em cũng xin được gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đạihọc Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm khoa Khoa Học Ứng Dụng cùng các thầy cô vàcán bộ công nhân viên trong trường đã tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt nhữngkiến thức quý báu trong suốt quảng thời gian em học tập tại trường Từ những kiếnthức đó đã tạo nền tảng, cơ sở để em có thể hoàn thành được khóa luận này.

Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, bạn bè và nhữngngười thân, mọi người đã luôn ở bên cạnh em là nguồn động lực về cả vật chất vàtinh thần giúp em vượt qua những khó khăn vất vả trong học tập và cuộc sống để

em có được thành công như hôm nay

Em xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2019

NGUYỄN CÔNG TOẢN

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sựhướng dẫn khoa học của TS TRẦN THỊ DUNG Các nội dung nghiên cứu, kết quảtrong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây.Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giáđược chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệutham khảo

Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như sốliệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồngốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung khóa luận của mình Trường đại học Tôn Đức Thắng không

liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trìnhthực hiện (nếu có)

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

Tác giả (ký tên và ghi rõ họ tên)

Trang 5

TÓM TẮT

NGUYỄN CÔNG TOẢN, Đại học Tôn Đức Thắng, tháng 01/2019

“NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH

TRƯỞNG VÀ HỢP CHẤT HỮU CƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY IN

VITRO LAN GIẢ HẠC HÒN HÈO (Dendrobium anosmum Lindl.)”

Giảng viên hướng dẫn TS TRẦN THỊ DUNG

Đề tài được thực hiện tại công ty TNHH Nông Vinh TP HCM

Nội dung nghiên cứu gồm 5 thí nghiệm về ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa

sinh trường BA, NAA, chất hữu cơ và giá thể trồng đến quy trình nuôi cấy in vitro lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl).

Các kết quả đạt được:

Môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L NAA + 2 mg/L là tốt nhất cho sự tạo chồi từlớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo với kết quả tỷ lệ tạo chồi đạt 43,31% và trung bình11,49 chồi/mẫu sau 60 ngày nuôi cấy

Nhân chồi lan đạt hiệu quả cao nhất trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L BAvới kết quả 22,44 chồi/mẫu cấy, 4,07 lá/chồi, chiều cao chồi 1,55 cm sau 60 ngàynuôi cấy

Chất hữu cơ thích hợp nhất cho sự phát triển của lan Giả hạc Hòn Hèo là khoaitây ở nồng độ 20 g/L với chiều cao đạt 1,87 cm, số lá 5,87 lá/chồi sau 60 ngày nuôicấy

Nồng độ NAA tối ưu cho sự hình thành rễ lan là 1,5 mg/L, kết quả số rễ hìnhthành 8,04 rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 0,98 cm sau 60 ngày nuôi cấy

Giá thể thích hợp nhất cho việc trồng cây con in vitro Giả hạc Hòn Hèo ngoài

vườn ươm là giá thể dớn với tỷ lệ cây sống đạt 95,56% và cây con phát triển với6,15 lá/cây, chiều cao cây đạt 3,39 cm sau 60 ngày trồng ngoài vườn ươm

Trang 6

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC BIỂU ĐỒ xi

DANH MỤC HÌNH xii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Ý nghĩa 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về lan Dendrobium 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.2 Phân loại 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái 4

2.1.4 Đặc điểm thực vật học 5

2.2 Tổng quan về lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) 5

2.2.1 Nguồn gốc và phân bố 6

2.2.2 Phân loại 6

2.2.3 Đặc điểm hình thái 6

Trang 7

2.2.4 Điều kiện sinh trưởng của lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) 7

2.2.5 Giá thể trồng lan 8

2.3 Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật 9

2.3.1 Khái niệm 9

2.3.2 Lịch sử hình thành và phát triển của công nghệ nuôi cấy in vitro 9

2.3.3 Một số phương pháp nuôi cấy mô 11

2.3.4 Các giai đoạn trong nuôi cấy in vitro 13

2.4 Các chất hữu cơ tự nhiên bổ sung vào trong quá trình nuôi cấy 14

2.4.1 Chuối 14

2.4.2 Nước dừa 15

2.4.3 Khoai tây 15

2.5 Các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung 15

2.5.1 Cytokinin 15

2.5.2 Auxin 16

2.5.3 Sự kết hợp giữa Auxin và cytokinin 16

2.6 Tình hình nghiên cứu về lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) 17

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới 17

2.6.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 17

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 19

3.1 Địa điểm-thời gian thực hiện 19

3.2 Nội dung nghiên cứu 19

3.3 Vật liệu thí nghiệm 19

3.3.1 Nguyên liệu nuôi cấy 19

Trang 8

3.3.2 Trang thiết bị và dụng cụ 19

3.3.3 Môi trường nuôi cấy 20

3.3.4 Điều kiện nuôi cấy 20

3.4 Phương pháp thí nghiệm 20

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 20

3.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 21

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ sung trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 22

3.4.4 hí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 23

3.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến giai đoạn vườn ươm của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 24

3.5 Xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 25

4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 31

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ sung trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 36

4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi

Trang 9

in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 41

4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát giá thể trồng cây in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 45

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 1 52

PHỤ LỤC 2 53

Trang 10

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BA : 6-benzyladenin

ĐC : Đối chứng

IBA : 3-indolebutyric acid

IAA : 3-indole acetic acid

MS : Murashige and Skoog medium

NAA : α-naphtalene acetic acid

TCL : Thin Cell Layer

Trang 11

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành

chồi từ lớp mỏng giả hành lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 20

Bảng 3.2: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

chồi của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 21

Bảng 3.3: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ

sung trong môi trường đến sự sinh trưởng trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo

(Dendrobium anosmum Lindl) 22

Bảng 3.4: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của

chồi in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) 23

Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm Khảo sát giá thể trồng cây invitro Lan Giả hạc 24 Bảng 4.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ

lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy

25

Bảng 4.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ

28

Bảng 4.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của

Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy 31

Bảng 4.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của

Bảng 4.5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ sung

trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium

anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy 36

Bảng 4.6: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ sung

trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium

anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy 38

Trang 12

Bảng 4.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in

vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy .41

Bảng 4.8: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in

vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy .43

Bảng 4.9: Kết quả khảo sát giá thể trồng cây in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo

(Dendrobium anosmum Lindl) 45

Trang 13

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến tỷ lệ tạo chồi từ lớp mỏng lan Giả hạc

Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy 26

Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tăng sinh chồi từ lớp mỏng lan Giả

hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy 26

Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của Lan Giả hạc

Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của Lan Giả hạc

Biểu đồ 4.7: Ảnh hưởng của hàm hợp chất hữu cơ bổ sung trong môi trường đến

khả năng sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau

30 ngày nuôi cấy 37

Biểu đồ 4.8: Ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ sung trong môi trường

đến khả năng sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)

sau 60 ngày nuôi cấy 38

Biểu đồ 4.9: Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in vitro Lan Giả

Biểu đồ 4.10: Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in vitro Lan Giả

Biểu đồ 4.11: Ảnh hưởng của giá thể trồng đến tỷ lệ sống cây con lan Giả hạc Hòn

Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày trồng 45

Biểu đồ 4.12: Ảnh hưởng của giá thể trồng đến sự phát triển số lá và chiều cao của

cây con lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày trồng 46

Trang 14

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Một số giống lan Dendrobium (A: Dendrobium Antennatum; B:

Dendrobium Parishii; C: Dendrobium anosmum; D: Dendrobium Wardianum; E: Dendrobium chrysotoxum; F: Dendrobium Farmeri; G: Dendrobium Atroviolaceum; H: Dendrobium Spectabile; I: Dendrobium Draconis; J: Dendrobium Formosum; K: Dendrobium bellatulum; L: Dendrobium lindleyi) 4

Hình 2.2: Hình hoa Giả hạc Hòn Hèo-Nha Trang 6 Hình 4.1: Sự phát triển của mẫu lát mỏng sau 15 ngày (trái) và 30 ngày (phải) 27 Hình 4.2: Các nghiệm thức ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ

30

Hình 4.3: Các nghiệm thức ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của

Hình 4.4: Các nghiệm thức ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây, chuối và nước dừa

bổ sung trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo

(Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy 40

Hình 4.5: Các nghiệm thức ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in

vitro lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày nuôi cấy 44

Hình 4.6: Các nghiệm thức khảo sát giá thể trồng cây in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo

(Dendrobium anosmum Lindl) sau 60 ngày trồng 47

Trang 15

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hoa lan là loài hoa đẹp và mang nhiều giá trị về mặt thẩm mỹ và tinh thần

Là loài hoa có giá trị kinh tế cao được ưa chuộng rộng rãi trong nước và ngoàinước Do đó, ngành sản xuất lan là ngành mang lại nhiều lợi ích to lớn về mặt kinhtế

Tuy nhiên, vấn đề gặp phải là làm thế nào để cung ứng được nguồn giống đadạng về cả chất lượng và chủng loại để phục vụ cho nhu cầu thị trường Vì hàngnăm, chúng ta vẫn phải nhập các giống lan từ các nước Thái Lan, Đài Loan, TrungQuốc,…Vậy nên, việc nghiên cứu phương pháp nhân giống nhằm cung cấp một sốlượng lớn giống cho thị trường là yêu cầu cần thiết Hiện nay, các phương phápnhân giống truyền thống được áp dụng đối với lan là tách, chiết, giâm cành nhưngcho hệ số nhân giống thấp và cây dễ bị thoái hóa Trong những năm gần đây

phương pháp nhân giống in vitro được nghiên cứu và áp dụng thành công trong sản

xuất nhiều loại cây trồng khác nhau đặc biệt là đối với nhân giống lan

Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum Lindl.) là một loài lan thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) phân bố khá rộng rãi và có nhiều màu sắc hoa khác nhau Ở Việt

Nam có nhiều loài lan Giả hạc đặc hữu có màu sắc hoa và hình thái đặc trưng đượcđặt tên theo nơi tìm thấy như: Giả hạc Daklay, Giả hạc Di Linh, Giả hạc Hòa Bình,Giả hạc Hòn Hèo…

Giả hạc Hòn Hèo một loại lan Giả hạc được tìm thấy ở Hòn Hèo thuộc NhaTrang, đây là loài lan đặc hữu và hiện đã bị khai thác cạn kiệt ở ngoài tự nhiên Vì

vậy việc nhân giống in vitro có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn loài lan này

để phục vụ những mục đích nghiên cứu, lai tạo giống

Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa

sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến qáu trình nuôi cấy in vitro lan Giả hạc Hòn

Hèo” được thực hiện

Trang 16

1.2 Mục tiêu

Xác định được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng và chất hữu cơ thích hợp

cho sự tái sinh và tăng trưởng chồi trong quá trình nuôi cấy in vitro lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl), đồng thời xác định được giá thể trồng phù hợp cho cây con in vitro ở giai đoạn vườn ươm.

Trang 17

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về lan Dendrobium

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Giống Dendrobium có khoảng 1600 loài và được lai tạo thêm nhiều loài mới tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp: “Dendro” có nghĩa là gỗ, “bios” có nghĩa là sống Dendrobium hầu hết là thực vật biểu sinh, sống bám trên vỏ cây Ở

Việt Nam, người ta còn gọi là Hoàng Thảo, Hoàng Lan hay Đăng Lan [3]

Dendrobium thuộc loại đa thân, rất phong phú về dạng cây, dạng hoa Điều kiện

sinh thái cũng đa dạng, có nhiều loài chỉ mọc và ra hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùngnóng, có loài trung gian và cũng có loài thích nghi với mọi điều kiện khí hậu [5]

Dendrobium được Clof Swart đặt tên vào năm 1799, là chi lớn thứ nhì của họ

lan Dendrobium có khoảng 1600 giống nguyên thủy được chia làm 40 nhóm, trong

đó có 8 nhóm phổ biến nhất là: Phalaenanthe, Ceratobium, Callista, Eugenanthe,

Nigrohirsute, Pedilonum, Crumenata, Latourea.

Trang 18

Hình 2.1: Một số giống lan Dendrobium (A: Dendrobium Antennatum; B:

Dendrobium Parishii; C: Dendrobium anosmum; D: Dendrobium Wardianum; E: Dendrobium chrysotoxum; F: Dendrobium Farmeri; G: Dendrobium

D

F E

A

Trang 19

Atroviolaceum; H: Dendrobium Spectabile; I: Dendrobium Draconis; J: Dendrobium Formosum; K: Dendrobium bellatulum; L: Dendrobium lindleyi) [23]

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Dendrobium là loài đa thân và nhiều giả hành, các giả hành thường mang một

thân với nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có rất nhiều mắt ngủ Hoa có thể mọc từthân thành từng chùm hay từng hoa cô độc Hoa lớn, cánh môi phẳng Cụm hoa íthoa, phát triển toàn bộ chiều dài giả hành [11]

Dendrobium được chia ra làm 2 nhóm theo dạng thân của chúng: Dạng thòng

hay Nobile là dạng thân mềm thường sống ở vùng hơi lạnh như Đà Lạt; dạng đứng hay Phalaenopsis là dạng thân cứng thường sống ở vùng có khí hậu nóng hơn [11]

2.1.4 Đặc điểm thực vật học

Thân: Dendrobium là loại đa thân, giả hành gồm một hay nhiều lóng Giả hành

thường mang một thân với nhiều lá mọc xen kẽ - một bộ phận cần thiết cho sự phát

triển và sinh trưởng của lan Kiểu thân Dendrobium được chia thành 2 nhóm: kiểu

thân mềm (thường có ở vùng lạnh như Đà Lạt) và kiểu thân cứng (thường có ở vùngnóng hơn) [1]

Lá: lá lan thường hình kim hay hình trụ có rãnh hoặc phiến mỏng Dạng là mềmmại, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt phụ thuộc vào môi trường sống của cây.Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hoặc chỉ gấp lại theogân giữa như hình chữ V [6]

Rễ: lan Dendrobium có hệ rễ khí sinh, có một lớp tế bào chết chứa đầy không

khí rễ sẽ ánh lên màu xanh bạc Rễ hút được nước mưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ haynước lơ lửng trong không khí, hơi sương và hơi nước, chức năng đó giúp cây hútdinh dưỡng, chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bị giócuốn [8]

Hoa: hoa Dendrobium có 6 cánh với 3 đài (sepal) xen kẽ 3 cánh (petal), trong đó

có 1 cánh khác hẳn với các cánh khác, biến thành môi (lip) và quyết định giá trịthẩm mỹ của lan [10]

Quả và hạt: sau khi thụ phấn, các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả Quả

Trang 20

chứa 10.000-100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt với kích thước nhỏ nên phôi hạtchưa phân hóa Sau 3-5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió [6]

2.2 Tổng quan về lan Giả hạc (Dendrobium anosmum)

Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) là một giống lan thường mọc ở các quốc

gia thuộc vùng Đông Nam Á Châu nhưng nay phổ biến trên khắp thế giới bởi vì khá

dễ trồng, nhiều hoa và hương thơm dịu nhẹ [18]

Trang 21

Hình 2.2: Hình hoa Giả hạc Hòn Hèo-Nha Trang [19]

2.2.4 Điều kiện sinh trưởng của lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) [20]

Ánh sáng: Lan Giả hạc cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời,

nhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng Khi thấy cây quặt quẹo,

đó là dấu hiệu thiếu nắng Hãy đưa cây ra chỗ có nhiều nắng hơn Nhất là vào mùađông, nếu thiếu nắng cây khó lòng ra hoa

Nhiệt Độ: Giả Hạc chịu nóng và chịu lạnh rất tốt, vào mùa nóng cây có thể chịu

được nhiệt độ lên đến 38oC, còn vào mùa lạnh cây có thể chịu được nhiệt độ xuốngthấp đến mức 3,3oC Vào mùa lạnh nếu nhiệt độ 15-16oC không kéo dài trongkhoảng 4-6 tuần lễ thì Giả Hạc khó lòng ra nụ

Độ ẩm: Ẩm độ tốt từ 60-70% cây phát triển tốt đặc biệt là cây con và trong thời

gian ra nụ, nếu độ ẩm trong vườn trồng không đủ cây con sẽ teo dần và chết, còn

Trang 22

hoa thì đến mùa hoa ra rất ít.

Vật liệu trồng: cũng như nhiều loài phong lan khác có thể trồng được bằng sơ

dừa, bó vào dớn, vào các khúc gỗ Có thể trồng trong chậu nhưng phải để chậu nằm

và đặc biệt chậu phải thoát nước tốt Đặc biệt Giả Hạc ưa sống trong các chậu nhỏ,

có diện tích chật chội

Tưới nước: vào mùa hè thì tưới 2-4 lần 1 tuần, vào mùa thu quan sát thấy cây

tăng trưởng chậm thì tưới nước ít lại, giảm mức độ tưới xuỗng còn khoảng 1 lần/1tuần để cây không thiếu nước và tẹo lại Đến mùa đông cây chuẩn bị nụ và ra bôngnếu ẩm độ thấp nên kết hợp với tưới phun sương 2 lần/tháng để cây bung nụ

Phân bón: Lan Giả Hạc không ưa phân bón có nhiễu chất Nitrogen cho nên bón

với phân 15-15-15 từ tháng 2 đến tháng 9, bón phân theo hàm lượng 10-30-10 từtháng 9-11 Đến mùa đông tháng 12 thì chúng ta ngưng hẳn việc bón phân lại Nếutiếp tục bón hoặc phân bón có nhiều chất Nitrogen quá, cây sẽ ra cây con (keiki)thay vì ra nụ

2.2.5 Giá thể trồng lan[8]

2.2.5.1 Xơ dừa

Xơ dừa có khuyết điểm dễ mọc rêu, không thoáng, dễ mục, nhưng do số lượngnhiều và rất rẻ nên xơ dừa được trồng thành băng trên vạt tre Nếu dùng xơ dừatrồng chậu phải hạn chế tưới nước Tốt nhất là tạo điều kiện ẩm độ bên ngoài hơn làtrong chậu Đối với chất trồng này phải phun thuốc ngừa sâu bệnh thường xuyên.Tuy nhiên xơ dừa lại là môi trường rất tốt cho đa số các loại lan thuộc giống

Dendrobium.

2.2.5.2 Dớn

Đây là dạng sợi của thân và rễ cây dương xỉ Sở dĩ dớn được chọn vì không baogiờ đóng rêu nhưng hút ẩm tốt Tuy nhiên, nếu chất trồng toàn dớn thì không có độthoáng

Có 2 loại dớn:

Dớn sợi: là loại dớn già, hóa mộc Có dạng từng sợi được ưa chuộng để trồnglan ở thành phố

Trang 23

Dớn vụn: là phần còn lại của cây dớn sau khi đã lấy loại dớn sợi Loại dớn vụn

là phần non của thân cây dớn, loại này sử dụng trồng lan rất tốt ở vùng lạnh vì độhút ẩm cao, thiếu thoáng khí nên nhiệt độ trong chậu cao hơn bên ngoài, do đó dớntạo một độ ẩm nhất định thuận lợi cho sự phát triển của rễ Trái lại do điều kiện sinhthái ở thành phố có khác nên các nhà vườn trồng lan tuyệt đối không nên dùng loạidớn vụn vì nhiệt độ cao và ẩm độ thấp, nên phải tưới nước nhiều, dớn vụn bị bít dễlàm thối rễ lan Ngoài ra, điều kiện nóng ẩm rất thuận lợi cho một số loại côn trùng

và nấm bệnh chọn dớn làm mục tiêu cắn phá

2.2.5.3 Than gỗ

Được dùng với mục đích giữ ẩm Than là một chất trồng tốt nhất vì không cónấm bệnh, không bị mục và có khả năng giữ nước, vì thế than sẽ hấp thụ dinhdưỡng qua quá trình bón phân và thải ra dần qua sức hút rất mạnh của rễ lan

Than được dùng ở đây là loại than gỗ rừng được nung thật chín Tránh tuyệt đốidùng các loại than gỗ rừng sác (đước) vì hàm lượng NaCl trong than cao dễ làmchết lan

2.3 Tổng quan về nuôi cấy mô thực vật

2.3.1 Khái niệm

“Nuôi cấy mô - tế bào thực vật” là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loạinuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các loại vi sinh vật, trên môi trườngdinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [2]

Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in

vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật.

Nhân giống in vitro được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi

cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật

có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặctrong các loại bình nuôi cấy khác

Phương pháp nhân giống in vitro thực chất là một tiến bộ vượt bậc của các

phương pháp nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành, chiết, ghép,… Ở đây giá trị

Trang 24

thực tiễn của các tiến bộ khoa học kỹ thuật là đã biến những phương thức cổ điển đóthành những phương thức hoàn toàn mới về chất, cho phép giải quyết những khókhăn mà phương pháp cổ điển không thể vượt qua [2]

2.3.2 Lịch sử hình thành và phát triển của công nghệ nuôi cấy in vitro [7]

Năm 1838, Schleiden và Schwann hai nhà sinh vật học người Đức đã chứngminh thành công học thuyết tế bào: “Mọi cơ thể sinh vật dù phức tạp đến đâu cũngđều được tạo nên bởi sự kết hợp của rất nhiều đơn vị rất nhỏ, đó là các tế bào”.Năm 1902, Haberlandt trở thành người đầu tiên thực hiện việc nuôi cấy tế bàothực vật và nhận thấy có sự ảnh hưởng của các khoáng chất và điều kiện môi trườngtrên sự chuyển hóa của các tế bào cô lập trên môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, ông

đã gặp thất bại trong khi nuôi cấy các tế bào đã chuyển hóa được tách ra từ lá một

Năm 1941, Overbeck chứng tỏ khả năng kích thích sự sinh trưởng phôi ở câythuộc họ cà (Datura) của nước dừa trong quá trình nuôi cấy

Năm 1948, Steward xác định tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trên

mô sẹo cà rốt Cũng trong thời gian này, người ta nghiên cứu và tổng hợp thànhcông các chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như α-naphthylacetic (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)

Năm 1955, Skoog tìm ra kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào

Năm 1957, Skoog và Miller ghi nhận thành công sự hình thành cơ quan

Trang 25

từ mô sẹo thuốc lá chịu sự ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôicấy.

Từ năm 1954-1959 bắt đầu tiến hành các kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn.Năm 1960, Cooking công bố có thể dùng enzyme cellulase để phân hủy váchcellulose của tế bào thực vật và thu được kết quả là các tế bào không có vách mà cómang nguyên sinh chất bao quanh, gọi là tế bào trần

Năm 1962, Murashige và Skoog cải tiến thành công môi trường nuôi cấy (môitrường MS)

Năm 1966, bắt đầu chú ý đến nuôi cấy túi phấn

Từ năm 1980-1992, hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ genthực vật được công bố: chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium, kỹ thuật sử dụngđiện, vi tiêm, siêu âm, súng bắn gen đã và đang được các phòng thí nghiệm trên thếgiới áp dụng và đạt hiệu quả cao

2.3.3 Một số phương pháp nuôi cấy mô[2]

2.3.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Phương thức này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi hay đỉnh sinhtrưởng làm mẫu vật nuôi cấy Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh và các phần lá non.Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi vàmỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh Xét về nguồn gốc của các cây đó,

có các khả năng:

- Cây phát triển từ chồi đỉnh

- Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ

- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh

- Phát triển cây trực tiếp: chủ yếu ở các đối tượng hai lá mầm như khoai tây,thuốc lá, cam chanh: mầm (đỉnh sinh trưởng)  chồi nách  cây

- Phát triển thông qua giai đoạn protocorm: chủ yếu gặp ở các đối tượng một lá

Trang 26

mầm như: phong lan, dứa, huệ,… cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạtprotocorm và các protocorm này có thể tiếp tục phân chia thành các protocormmới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh Bằng phương thức này trong mộtthời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể.

- Ghép đỉnh chồi hay vi ghép: về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinhtrưởng nhưng thông qua dinh dưỡng tự nhiên của gốc ghép Đỉnh sinh trưởngdùng làm mắt ghép có kích thước từ 0,2-0,5 mm, được tách từ búp non đangsinh trưởng mạnh của cây mẹ trưởng thành, gốc ghép là mầm giả mới nảy mầm

từ hạt của giống hoang dại, toàn bộ cây ghép được nuôi dưỡng trong điều kiệnống nghiệm vô trùng Phương thức này thường dùng để tạo ra các giống cây ănquả sạch bệnh virus nhằm cung cấp mắt ghép và cành chiết đầu dòng làmnguyên liệu nhân giống cho sản xuất đại trà Phương thức này cho phép thuđược cây hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắtghép

2.3.3.2 Nuôi cấy mô sẹo

Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều Auxin, mô sẹo được hìnhthành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây(Esau, 1977) Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi

đó có vết cắt (Street, 1969) Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có địnhhướng, có hình dạng không nhất định Đặc tính của mô sẹo là mô sẹo phát triểnkhông theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để có thểhình thành cây hoàn chỉnh Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ

và từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn lànuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên, mức độ biến dị tế bào soma rất cao

2.3.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc cótốc độ điều chỉnh thích hợp Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóachất hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng lẻ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và

Trang 27

nuôi cấy trên môi trường đặc biệt và tăng sinh khối.

2.3.3.4 Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

Nuôi cấy protoplats là phương pháp dùng enzym hoặc hóa chất để thuỷ phânthành tế bào và tách được protoplast Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast

có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Dokhông có thành tế bào nên protoplast trở thành một đối tượng lý tưởng trongnghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật Bằng phương pháp dung hợp haiprotoplast có thể tạo ra các cây lai soma Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuậtdung hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene

2.3.3.5 Nuôi cấy hạt phấn

Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro Bao phấn chứa các bào tử hoặc

hạt phấn chưa chín trong môi trường dinh dưỡng xác định nhằm mục đích tạo câyđơn bội Nuôi cấy bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo

ra các dòng, giống thuần ở các cây tự thụ phấn

2.3.3.6 Nuôi cấy lớp mỏng tế bào TCL (Thin Cell Layer) [9]

Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng TCL bao gồm các phần nhỏ được tách ra từ các cơquan khác nhau (thân, rễ, lá, hoa,…) Có 2 dạng TCL là:

- Dạng lTCL (longitudinal Thin Cell Layer): lớp mỏng tế bào được cắt theochiều dọc, chỉ bao gồm một loại tế bào như một lớp tế bào biểu mô hoặc vài lớptách ra từ tế bào vỏ

- Dạng tTCL (transverse Thin Cell Layer): lớp mỏng tế bào được cắt theo chiềungang, bao gồm các mô khác nhau được tách ra (biểu mô, vỏ, vùng thượng tầng, mômạch, nhu mô)

2.3.4 Các giai đoạn trong nuôi cấy in vitro [4]

Quá trình nuôi cấy in vitro gồm 5 giai đoạn chính, mỗi giai đoạn có từng yêu

cầu về điều kiện riêng

- Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Chọn cây mẹ to, khỏe, không nhiễm bệnh và có giá trị kinh tế cao

Chọn cơ quan để lấy mẫu, thường sử dụng là chồi non, đoạn thân chứa chồi ngủ,

Trang 28

lá non, hoa non,

Mô chọn để nuôi cấy thường là mô khỏe, có khả năng tái sinh cao, giữ được cácđặc tính sinh học quý của cây mẹ, ổn định Tùy điều kiện mà giai đoạn này có thểkéo dài từ 3-6 tháng

- Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng

Khử trùng bề mặt mẫu cấy và chuẩn bị môi trường để nuôi cấy

Cấy mẫu vô trùng vào trong ống nghiệm hoặc bình phôi chứa môi trường nuôi

cấy đã được khử trùng Giai đoạn này gọi là cấy mẫu in vitro.

Các mẫu nuôi cấy không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được chuyển vào trongphòng với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một khoảng thời gian các mẫucấy sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc các cơ quan (chồi, rễ, lá) Ngoài ra khi đưamẫu từ bên ngoài vào nuôi cấy phải đảm bảo các điều kiện sau:

 Tỷ lệ nhiễm thấp

 Tỷ lệ sống cao

 Tốc độ sinh trưởng nhanh

- Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Thành phần và điều kiện môi trường được tối ưu hóa cho điều kiện nhân nhanh.Quy trình cấy chuyền để nhân nhanh chồi khoảng 1-2 tháng tùy loại cây Giaiđoạn 3 thường kéo dài từ 10-36 tháng và cũng không nên kéo dài quá lâu

- Giai đoạn 4: Tạo rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhưngthông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kíchthích tạo rễ Một số loài khác, các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra đất.Giai đoạn 4 thông thường cần 2-8 tuần

- Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên.Chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới chuyển ra vườn ươm Quá trình thích nghicây cần được chăm sóc đặc biệt Vì cây chuyển ra từ môi trường bão hòa hơi nướcsang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn nên vườn ươm phải đáp ứng các

Trang 29

yêu cầu sau:

 Cây được che phủ bằng nilon, tưới phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát

 Giá thể trồng cây là đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa Giai đoạn này thường đòi hỏi 4-16 tuần

 Thời gian cần thiết tối thiểu để cây thích nghi là 2-3 tuần

2.4 Các chất hữu cơ tự nhiên bổ sung vào trong quá trình nuôi cấy

2.4.1 Chuối

Chuối là chất hữu cơ có tác động mạnh nhất lên quá trình tăng trưởng, tạo chồi

và số chồi trong nhóm chuối, khoai tây và nước dừa Thành phần hóa học có đường,axit nucleic, axit amin, vitamin, khoáng

2.4.2 Nước dừa [21]

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về VanOverbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941,1942) Sau đó, tác dụng tích cực củanước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghinhận Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng vàchất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996) Nước dừa đã được sửdụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây Nước dừa thườngđược lấy từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản.Nước dừa được một số công ty hoá chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến vàbảo quản Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó đượclọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh Tồn dư protein trong nướcdừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng cóthể dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh Chất cặn có thể được lọc bỏ hoặc

để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn Nước dừa thường được sử dụng ở nồng

độ từ 5 đến 20 % (v/v)

2.4.3 Khoai tây

Trong khoai tây chứa nhiều amino acid, glutamine và asparagine Trong khoai

Trang 30

tây chứa nhiều chất dinh dưỡng như vitamin C, Kali trong lớp vỏ khoai tây,carbohydrate, sắt, calcium Bên cạnh đó trong khoai tây chứa dồi dào các chấtchống oxy hóa, các chất kháng khuẩn,

2.5 Các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung [22]

2.5.2 Auxin

Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộcnhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng(sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn

Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ biểu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ.Các auxin có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùng trong nuôi cấy

mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là

2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ,…

Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutyric acid),IAA (3-indole acetic acid), NAA (Napthaleneaxetic acid), 2,4-D (2,4-D-Dichlorophenoxyaxetic acid) và 2,4,5-T(Trichlorophenoxyacetic acid) Trong sốcác auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp vớicytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối vớimôi trường tạo và phát triển callus Auxin thường hòa tan trong etanol hoặc NaOHpha loãng

2.5.3 Sự kết hợp giữa Auxin và cytokinin

Sự kết hợp giữa Auxin và Cytokynin trong môi trường nuôi cấy với những tỷ lệ

Trang 31

nhất định có vai trò rất quan trọng trong sự biệt hóa tạo mô sẹo, hình thành cơ quanchồi, rễ,… cho từng loại cây nhất định.

Một cách hệ thống, người ta có thể chấp nhận là tính chất về sinh lý của một môlúc được nuôi cấy sẽ như sau (theo Skoog): nếu tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao, người ta

sẽ thu được chức năng sinh tạo rễ; nếu tỷ lệ Auxin/Cytokinin thấp, mô sẽ phát triển

về chức năng sinh tạo thân; và nếu tỷ lệ này gần một người ta sẽ thu được mô sẹo.Theo Kaminek và cộng sự (1997) có thể Auxin ảnh hưởng lên hoạt động củaCytokinin trong tế bào thực vật bằng cách điều hòa thuận quá trình sinh tổng hợp vàphát huy sự thoái hóa của Cytokinin Dominov và cs (1992) nhận thấy Cytokininkích thích Auxin đáp ứng bằng cách làm tế bào nhạy cảm hơn hoặc bằng cách khóakìm hãm ngược của đáp ứng Auxin Sự kết hợp tạo nên tác động hỗ trợ hay kìmhãm giữa hai loại hormone này là một yếu tố quan trọng giúp kiểm soát sự pháttriển

2.6 Tình hình nghiên cứu về lan Giả hạc (Dendrobium anosmum)

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới

Năm 2007, Peng Zhao và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium

CandidumWall Ex Lindl bằng phương pháp lớp mỏng tế bào ngang (tTCL) Kết quả

cho thấy trên môi trường MS + 2% đường + 1,2 mg/L NAA + 1,2 mg/L BA cho tỉ

lệ chồi tái sinh cao nhất (92%), cũng chính trên môi trường này cho kết quả tỷ lệchồi hình thành trên mẫu cấy là cao nhất (24,5 chồi/mẫu) [16]

2.6.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Năm 2008, Nguyễn Thị Mỹ Duyên đã đưa ra quy trình vi nhân giống Lan Giả

hạc (Dendrobium anosmum) Ở giai đoạn nhân nhanh: chồi lan Dendrobium

anosmum phát triển và nảy chồi tốt trên môi trường MS + 2 mg/L BA, tại thời điểm

3 tháng sau khi cấy đạt 3,17 chồi, chồi cao 20,6 mm Môi trường MS không bổ sung

BA cho kết quả nhân chồi rất thấp Đồng thời khi sử dụng BA ở nồng độ cao (10mg/L) vào môi trường nhân chồi cũng cho kết quả thấp (1,5 chồi), xuất hiện chồi dị

dạng, cây phát triển yếu Ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: chồi lan Dendrobium

Trang 32

anosmum tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS + 1 mg/L NAA Sau 3,5 tháng tạo

được cây hoàn chỉnh đạt tiêu chuẩn để đưa ra ngoài vườn [12]

Năm 2009, Nguyễn Văn Vinh và Nguyễn Hữu Lễ đã tiến hành nghiên cứu ảnhhưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự phát sinh chồi và rễ phong lan

Giả hạc Dendrobium anosmum Kết quả cho thấy, BA 0,5mg/L cho số chồi cao

(6,67 chồi/mẫu cấy) và trọng lượng tươi lớn (383,94 mg) sau 90 ngày nuôi cấy Môitrường MS có bổ sung 1 mg/L IBA là môi trường kích thích ra rễ của cây lan

Dendrobium anosmum in vitro có hiệu quả nhất Trong môi trường này mẫu cấy ra

rễ 100% sau 40 ngày nuôi cấy, khả năng sinh trưởng và phát triển của rễ mạnh [13]Năm 2013, Nguyễn Quỳnh Trang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhân

giống in vitro lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) Kết quả cho thấy môi

trường Knuds có bổ sung 0,3 mg/L NAA + 0,3 mg/L Kinetin + 0,3 mg/L BAP cho

hệ số nhân nhanh thể chồi đạt 5,8 lần/3 tuần, chất lượng thể chồi tốt Sau 4 tuần,công thức bổ sung 30 g/L sucrose + 0,5 mg/L GA3 + 0,1 mg/L Kinetin chồi tăngtrưởng tốt (2,45 cm), chất lượng chồi tốt Công thức bổ sung 0,5 mg/L IBA và côngthức 0,3 mg/L IBA + 0,1 mg/L NAA cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt 98%, số rễ trung bìnhđạt trên 3 rễ/chồi, chất lượng rễ tốt [14]

Trang 33

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Địa điểm-thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện tại Công ty TNHH Nông Vinh, Quận 10, Thành phố HồChí Minh

Thời gian thực hiện: 08/2018-12/2018

3.2 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ lớp mỏng giả

hành lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl).

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi của Lan Giả hạc

Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl).

Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây, chuối, nước dừa bổ sung trong

môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum

Lindl)

Khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi in vitro lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl).

Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến giai đoạn vườn ươm của lan Giả hạc Hòn

Hèo (Dendrobium anosmum Lindl).

3.3 Vật liệu thí nghiệm

3.3.1 Nguyên liệu nuôi cấy

Chồi Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum) có chiều dài từ 3 cm.

3.3.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Trang thiết bị: cân phân tích, nồi hấp vô trùng autoclave, tủ cấy vô trùng, máy

đo pH, máy lạnh, tủ lạnh, bếp điện từ, nồi, máy nước cất, kệ để mẫu, bóng đèn chiếusáng,

Dụng cụ: Đũa thủy tinh, ống nghiệm, đĩa petri, bình nuôi cấy thể tích 500 mL,ống đong 1 L, erlen, becher, khay cấy, kẹp gắp, dao cấy,

Trang 34

3.3.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS (Murashige-Skoog,1962) + 25 g/L đường, 8 g/L agar phatrong nước cất

Môi trường trước khi đưa vào nuôi cấy mô được hấp khử trùng trongAutoclave ở 121ºC trong vòng 20 phút, trong các bình thủy tinh 500 mL

Môi trường trong nuôi cấy mô đều được chỉnh pH trong khoảng 5,8 bằngNaOH 1N và HCl 1N trước khi đem đi hấp khử trùng

3.3.4 Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ: 25ºC ± 2ºC

Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày

Cường độ chiếu sáng: 2500-3000lux

Độ ẩm: 55-60%

3.4 Phương pháp thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố Mỗi nghiệm thứccấy 1 bình hoặc đĩa petri, cấy 3 mẫu/bình, lặp lại 9 lần Mẫu được cấy trong bình cóthể tích 500 mL chứa 50 mL môi trường nuôi cấy

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành

chồi từ lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)

Môi trường thí nghiệm: Môi trường MS bổ sung 25 g/L đường, 8 g/L agar và

bổ sung 0,5 mg/L NAA và BA ở các nồng độ khác nhau như bảng 3.1

Bảng 3.1: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành

chồi từ lớp mỏng giả hành lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)

- Mẫu cấy: Các cây con in vitro được cắt bỏ phần rễ và tách bỏ hết các lá ở trên

giả hành Các lớp mỏng cắt ngang dày khoảng 0,5 mm từ giả hành của cây con

Trang 35

in vitro (các mẫu cấy được cấy trong đĩa petri).

- Số mẫu/đĩa: 10 lát mỏng

- Tổng đĩa petri: 45

 Các chỉ tiêu theo dõi: 30 và 60 ngày sau khi nuôi cấy

- Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)

= số mẫu có chồi hìnhthành tổng số mẫucấy ×100

- Số chồi/mẫu cấy:

= tổng số chồitrên mỗi mẫucấy số mẫucó chồihìnhthành

3.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

chồi của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)

Các chồi tạo được từ thí nghiệm 1 được cấy chuyền sang môi trường MS bổsung 2 mg/L BA trong 30 ngày để tạo các cụm chồi làm vật liệu cho thí nghiệm 2

bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau như bảng 3.2

Bảng 3.2: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

chồi của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)

Trang 36

- Số lượng chồi (số chồi/mẫu cấy)

- Số lượng lá (số lá/chồi)

- Chiều cao chồi (cm) tính từ gốc tới ngọn

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ sung trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo

(Dendrobium anosmum Lindl)

Môi trường thí nghiệm: môi trường MS bổ sung 25 g/L đường, 8 g/L agar và

bổ sung khoai tây, chuối, nước dừa như bảng 3.3

Bảng 3.3: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng hợp chất hữu cơ bổ

sung trong môi trường đến sự sinh trưởng của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium

 Các chỉ tiêu theo dõi: 30 và 60 ngày sau khi nuôi cấy

- Chiều cao chồi (cm) tính từ gốc tới ngọn

- Số lượng lá (số lá/chồi)

Trang 37

3.4.4 hí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi

in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)

bổ sung các nồng độ NAA khác nhau như bảng 3.4

Bảng 3.4: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của

chồi in vitro Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)

3.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến giai đoạn vườn ươm

của Lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)

Cây con in vitro cao khoảng 2,5 cm có từ 4 lá trở lên và có từ 2-4 rễ dài từ

2cm trở lên sẽ được đem ra trồng ngoài vườn ươm trong các chậu nhỏ (đường kính3cm) bằng các giá thể được khảo sát như bảng 3.5

Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm Khảo sát giá thể trồng cây invitro Lan Giả hạc

Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)

Trang 38

Nghiệm thức Giá thể trồng

V1 Trồng với giá thể xơ dừaV2 Trồng với giá thể dớnV3 Trồng với giá thể than củi

Giá thể được sử dụng là xơ dừa vụn, dớn vụn và than củi Các giá thể được

xử lý bằng cách ngâm với nước trong 3 ngày trước khi dùng để trồng cây con Đốivới than củi sẽ được đập nhỏ trước khi sử dụng để trồng

Mỗi nghiệm thức trồng 10 cây, trồng 1 cây/chậu Cây con được chăm sócbằng cách tưới phun sương để giữ ẩm 3 lần/ngày

Chỉ tiêu đánh giá: theo dõi trong thời gian 60 ngày

- Tỷ lệ sống (số cây còn lại/ số cây trồng)

- Chiều cao cây, số lá

3.5 Xử lý số liệu

Ghi nhận số liệu và xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1 Sự sai biệt có ýnghĩa ở mức p ≤ 0.05 Dùng phần mềm excel để vẽ biểu đồ

Trang 39

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi

từ lớp mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl)

Cytokinin là hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưuthế ngọn và kích thích phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Cytokinin có hiệu quả trongvai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên mẫu thực vật nguyên vẹn

cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro Tác dụng này của cytokinin đôi khi trở

nên hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin Một tỷ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin

sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

Trong thí nghiệm này các lớp mỏng giả hành lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium

anosmum) được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA và BA ở

các nồng độ khác nhau Kết quả được ghi nhận sau 30 và 60 ngày nuôi cấy

Bảng 4.6: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự hình thành chồi từ lớp

mỏng lan Giả hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy

T0(ĐC) 0,0 18,13d ± 2,72 1,16b ± 0,11T1 0,5 21,06c ± 2,85 1,24ab ± 0,15T2 1,0 22,67c ± 2,56 1,28a ± 0,08T3 1,5 25,59b ± 2,20 1,20ab ± 0,12

Trang 40

0 0,5 1 1,5 2 0.00

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)

Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy

1.05 1.10 1.15 1.20 1.25 1.30 1.35

hạc Hòn Hèo (Dendrobium anosmum Lindl) sau 30 ngày nuôi cấy

Nhờ vào đặc tính mỏng của mẫu cấy nên các tế bào được tiếp xúc trực tiếp vàtương tác tốt với môi trường nuôi cấy Sau 15 ngày nuôi cấy các lát mỏng có biểuhiện phồng lên ở bên mép của lát mỏng tạo thành một khối nhỏ tròn hình hạt đậu Cáckhối nhỏ này khi mới hình thành có màu trắng và dần hóa xanh khi tiếp xúc trực tiếp

Định dạng
Số trang	92
Dung lượng	1,98 MB